促进药物发现:斑马鱼在一个自动化的高含量检测炎症
July 16th, 2012
在这里，我们描述了一种新型的高含量化学诱导的炎症检测，在免疫调节生物活性鉴定。我们已经成功地结合自动显微镜定制开发的软件，使量化的炎症反应以及进一步的数据处理，分析，挖掘，和存储的自动化脚本。
该程序的总体目标是进行表型筛选，以使用体内斑马鱼炎症测定法鉴定化合物的免疫调节活性。这是通过首先将斑马鱼幼虫分配给 384 来实现的。将接下来要筛选的化合物添加到幼虫中，以使组织渗透。
然后加入硫酸铜溶液以造成组织特异性损伤。最后，用新鲜培养基替换化合物和硫酸铜。最终，通过分析实时体内显微镜数据，可以获得显示组织特异性白细胞流入程度随时间变化的结果。
该技术的主要优点是它允许在数百个个体中同时诱导炎症，从而实现实验和分析自动化。演示该程序的是克里斯蒂娜·惠特曼 （Christina Whitman），她是我实验室的博士生 用于下巴测定。在纯合双转基因和野生型 AB 鱼之间建立群体交配，通过自然产卵收集胚胎，并在 29 摄氏度至 29 摄氏度至 3 天的 E 三种培养基中每板饲养 50 至 70 个胚胎。
在荧光立体镜下检查所有幼虫的荧光报告基因表达、自发性炎症和适当的与年龄相关的发育。在制备筛选培养基并向 384 的孔中加入 20 微升后，孔板将 74 微升培养基中的单个麻醉幼虫转移到每个孔中。使用已切割成 2 毫米孔径的移液器吸头和灵活的微量移液器吸头。
将幼虫定位在孔内的横向位置 使用机器人液体处理工作站执行所有后续液体处理步骤，以确保同时处理所有幼虫以进行药物治疗。上下移液 5 次，在药物储备板中混合化合物。将 16 微升 7.5 x 药物储备板添加到筛选板中，并以每秒 10 微升的速度混合 5 次。
用铝箔盖住筛选板，并在 29 摄氏度下孵育 1 小时。诱发化学伤人。向每个工作溶液中加入 10 微升 120 微摩尔硫酸铜工作溶液。
接受阴性对照，混合四次，然后在 29 摄氏度下再次孵育 1 小时。从 90 分钟开始，从每个孔中取出并交换 80 微升培养基两次，洗涤胚胎。初始铜处理后，使用外汇物镜在倒置自动显微镜上获取图像。
设置初始 Z 水平，以便可以看到来自左右后侧线的神经肿块，并每小时对每个孔进行一次成像。在四个焦平面中使用明场侧 3 和 GFP 通道。自定义实验室视图软件从每个通道的四个焦平面创建扩展焦距图像。
然后，合并图像以创建最终的 RGB 叠加图像。模式识别工具识别 RGB 叠加图像中的神经瘤，并在神经瘤周围创建一个经验定义的感兴趣区域，对受伤神经瘤周围的红色荧光白细胞进行评分，从而初步读出白细胞或苍白细胞占据的面积百分比。平均而言，95% 的幼虫被正确检测到，随后可以进行进一步的数据处理。
使用炎症图或眼图评估单个实验的成功。苍白数据用亮绿色进行颜色编码，代表高初始炎症指数，黑色表示没有炎症。这种快速概览可以快速识别失败的实验，然后将其排除在进一步的数据分析之外。
时间 0.0 和时间 0.5 处的 iMap 清楚地表明是否应将实验包含在进一步的数据处理中。铜对照以不同深浅的绿色显示，而 DMSO 对照孔在时间 0.5 时显示为深绿色或黑色。炎症在铜质对照中几乎得到解决，现在以深绿色或黑色表示以处理对照。
对 32 个对照仿行进行平均，并计算标准差。只。包括两个标准差内的数据点。阴性对照 DMSO 的平均值设置为零，铜对照的最高平均 PAOL 设置为 1，将每种化合物的 PAOL 线性、插值或外推到实验板上的相应对照。
对来自重复实验的归一化原始数据进行平均化，产生最终读数，即由于炎症消退引起的炎症指数。随着时间的推移，对初始炎症进行单调指数非线性回归拟合。通过使用此公式，其中 0 是时间等于 0 时初始响应的度量，1 与量级随时间变化的斜率相关以生成特征空间，应用非线性回归，聚类分析将特征空间划分为特征区域，从而允许自动识别来自不同免疫调节类别的有趣候选者。
所有参数都根据参数 ACE 为 0 和 ace 为 1 显示在 2D 图中。数据处理例程创建的网页提供结果的快速概览，以及用户请求的详细视图。还集成了与其他相关异质、生物和化学数据库的软链接，为这些例程的比较和新颖研究提供了宝贵的资源。
为在试点筛选中长期存储这些数据设置了适当的数据标准和元信息，在 640 种 FDA 批准的已知生物活性化合物的库中进行了分析，以了解对粒细胞炎症反应的启动、进展或消退的影响。根据观察到的效果，对四种类型的免疫调节表型进行了分类，它们可能表明不同的作用方式，抗炎、抗消退、促炎和促消退。45 种化合物中有 640 种通过将初始炎症指数降低到 50% 或更低而发挥了显着的抗炎作用。
在这一类别中，发现了 6 种化合物，它们属于真正的抗炎药的药理学类别。确认这种方法的有效性，观看此视频后，您应该很好地了解如何在很大程度上自动化免疫调节化合物活性的体内表型筛选，从而在整个动物环境中进行一致的数据采集和分析。
概览
本研究提出了一种高内容化学诱导的炎症测定法，利用斑马鱼幼鱼来识别免疫调节活性成分。该方法结合了自动显微镜和自定义软件来定量分析炎症反应和数据分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 高内容筛选
背景
- 炎症在多种疾病中起着关键作用。
- 斑马鱼模型在研究免疫反应方面非常有效。
- 自动化技术提高了实验测定的效率。
- 识别活性成分可以导致新的治疗策略。
研究目的
- 开发一种用于筛选免疫调节化合物的新型测定法。
- 实现炎症反应定量分析的自动化。
- 在高通量环境中促进数据处理和分析。
所用方法
- 将斑马鱼幼鱼分布在384孔板中。
- 使用硫酸铜诱导炎症。
- 使用自动显微镜进行实时成像。
- 使用自定义软件分析白细胞涌入量化数据。
主要结果
- 成功识别了免疫调节表型。
- 高检测率的幼鱼可供进一步分析。
- 自动化数据处理程序提供了全面的结果。
- 将化合物分类为四种免疫调节类别。
结论
- 该测定法允许高通量筛选活性化合物。
- 自动化分析提高了结果的可靠性。
- 该方法可应用于各种免疫学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This automated high-content inflammation assay in zebrafish enables phenotypic screening for immune-modulatory compounds in a whole-animal context, supporting early target validation and mechanistic de-risking. By quantifying leukocyte recruitment in real time, the method provides predictive confidence in compound effects on inflammatory pathways, facilitating go/no-go decisions in discovery pipelines. The integration of robotic liquid handling and custom analytics supports scalable, reproducible data generation for portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring granulocyte recruitment as a functional readout of innate immune activation.
- Operational Value: Enables simultaneous treatment of hundreds of larvae, increasing throughput for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking compound exposure to in vivo inflammatory resolution dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative leukocyte area metrics that enable structure-activity relationship analysis.
- Operational Value: Combines automated microscopy with custom software for standardized, high-content data acquisition.
- Scalability: Compatible with 384-well formats, allowing screening of large compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses disease-relevant granulocyte trafficking to model acute inflammatory responses.
- Mechanistic De-risking: Classifies compounds into immune-modulatory phenotypes (anti-inflammatory, pro-inflammatory, etc.) to inform mechanism of action.
- Preclinical Alignment: Provides early insight into off-target or toxic effects via modulation of inflammatory resolution.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, delivering functional immune response data that informs compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Tests compound effects on leukocyte influx to validate target engagement in inflammatory pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for hit confirmation and SAR expansion.
- Analytics: Employs nonlinear regression and cluster analysis to generate feature space for automated hit categorization.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to mechanistic pathways via immune-modulatory classification.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immunology-focused campaigns across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by measuring dynamic inflammatory responses in intact organisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through automated liquid handling, imaging, and normalized data processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying immunomodulatory liabilities early.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization using normalized inflammatory index and resolution kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic line maintenance, and fluorescence microscopy.
- Dependent on robotic liquid handling systems and automated inverted microscopes with environmental control.
- Needs cross-team standardization for image analysis pipelines and compound plating consistency.
- Adaptation to alternative disease models may require validation of leukocyte recruitment parallels.
- Practical limitations include assay duration (several hours) and dependency on optical clarity for accurate leukocyte segmentation.
