淀粉样前体蛋白胞内段的纯化与聚集

本实验的目的是纯化淀粉样前体蛋白的胞内结构域（也称为 A ICD），并提供一种通过原子力显微镜对 A ICD 进行热诱导聚集及表征的实验方案。首先在细菌中表达 A ICD 的 GST 融合蛋白；随后纯化 GST-A ICD 融合蛋白，并用凝血酶切割以分离 GST 与 A ICD，去除 GST 标签。

然后诱导A ICD的热聚集。最后，利用原子力显微镜对A ICD聚集体进行成像。最终可获得结果，表明A ICD能够被纯化至均一性，且产量足以用于生物化学和生物物理分析。

与现有需要复杂色谱步骤的方法相比，该技术的主要优势在于，可在台面上使用常规试剂和设备分离得到高纯度且可溶性的 A ICD。本方案制备的 A ICD 适用于进一步的生物化学与生物物理表征。

演示该实验步骤的是Amina ti。我实验室的前博士后Andres Oberer博士将演示如何进行A ICD的原子力显微镜成像。为表达重组的A PP胞内域（A ICD），首先使用含有pgx 41质粒的BL 21细胞，该质粒携带与GST蛋白C末端融合的人源A ICD序列。挑取单菌落接种于10毫升含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37摄氏度剧烈振荡培养过夜，次日早晨继续后续操作。

在1升锥形瓶中，将5毫升过夜培养物加入400毫升LB氨苄青霉素培养基中，37°C剧烈振荡培养，直至600纳米处的光密度达到0.4至0.6。通常需要2至2.5小时，以诱导G-S-T-A-I-C-D的表达。

加入0.4毫摩尔的IPTG，在37摄氏度下剧烈振荡培养5小时。在4摄氏度下以6,000 × g离心15分钟收集细胞，并将沉淀在-80摄氏度下保存。制备裂解缓冲液并将细菌置于冰上后，向沉淀中加入20毫升缓冲液，并结合涡旋振荡与用移液器在冰上反复吹打，充分混匀。

将细菌沉淀重悬于Reese悬浮液中，随后将Reese悬浮的细菌裂解液通过预冷的乳化器或French高压压碎器。在30,000 PSI条件下，将裂解液再次通过乳化器，并收集至预冷的50毫升离心管中。在4°C、15,000 × g条件下离心裂解液30分钟。

将上清液分离并转移至预冷的50毫升离心管中。加入500微升50%的谷胱甘肽琼脂糖悬液。在4°C下旋转孵育30分钟，期间样品持续旋转。

孵育后配制新鲜的洗脱缓冲液。将裂解液和浆液倒入一次性5英寸聚苯乙烯层析柱（带粗滤器）中。用3毫升PBS洗涤柱子5次。

封闭层析柱底部，加入 500 µL 室温洗脱缓冲液。封闭层析柱顶部，室温下旋转 5 分钟。将早期流出液收集至预冷的 1.5 mL 微量离心管中。

再重复洗脱两次。将洗脱液在4升PBS中，于4°C条件下，使用截留分子量为10,000的透析膜透析过夜。次日，再于4°C条件下，用额外4升PBS透析1小时。

从透析盒中取出蛋白质，并进行蛋白质定量分析，以确定G-S-T-A-I-C-D的得率。通常从400毫升培养液中纯化可获得超过20毫克的纯化蛋白质，浓度为10至20毫克/毫升。将蛋白质分装为每份200微升的等分试样，于-80摄氏度冷冻保存。

为了从 GST 标签中释放 AICD，取 200 微升纯化的 GST-AICD，加入 20 微升浓度为每微升 1 个单位的凝血酶，于 37 摄氏度孵育过夜。次日，在 4 摄氏度下以 20,000 × g 离心 30 分钟，去除聚集物。将上清液转移至预冷的微量离心管中，以去除 GST 和凝血酶。分别加入 50 微升 50% 谷胱甘肽琼脂糖凝胶悬液和 50 微升 50% Protein A 琼脂糖凝胶悬液。

室温下旋转孵育5分钟。短暂离心以沉淀农杆菌珠，将上清液转移至新的离心管中。用谷胱甘肽再提取GST蛋白四次。

Aros 对5微升纯化的A ICD进行蛋白质定量分析。通常从400毫升培养液中可获得50至100微克蛋白，浓度为0.2至0.5毫克/毫升。将新制备的A ICD用PBS稀释至0.1毫克/毫升浓度后，通过在43摄氏度、800 RPM条件下于加热振荡器中孵育48小时，诱导其发生热聚集。

将样品用去离子水稀释20倍，取2微升点样至新解理的云母表面，在干燥器中过夜干燥。使用原子力显微镜轻敲模式观察聚集的A ICD，采用镀金的MicroTIPS-Au氮化硅悬臂梁，其标称针尖半径为2纳米。

成像过程中典型的轻敲振幅为10至20纳米，对应悬臂梁的共振频率。此处显示了G-S-T-A-I-C-D的表达及相对富集情况。裂解后，大部分融合蛋白存在于可溶性组分中，因此无需从包涵体中提取。

从谷胱甘肽亲和柱洗脱的材料纯度大于95%。在本实验所示的制备过程中，从柱子洗脱的蛋白质浓度为14.5毫克/毫升，产量为22毫克。将200微升该制备物与20单位的凝血酶在过夜条件下进行切割，可使融合蛋白几乎完全（近100%）被切割。

所使用的凝血酶量极低，无法被kumasi检测到。经过蓝色染色以及去除凝血酶和GST后，造成了一定程度的材料损失。然而，最终产物纯度超过90%，在此制备过程中获得了70微克的A ICD，浓度为0.35毫克/毫升。

通过荧光显微镜观察，ICD 聚集体通常呈类固醇无定形结构，大小范围为 50 至 100 纳米。当在聚集反应中加入等摩尔量的分子伴侣 UBI Quillin one 时，无法检测到聚集物质。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化 EICD、诱导其聚集，并通过 A-F-M-E-I-C-D 成像聚集体。

通过该技术纯化的样品可应用于其他方法，如光散射和滤膜滞留实验，以探究分子伴侣对EACD聚集的影响。