Name: 验尸报告组织心肌细胞核分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习从验尸组织分离心肌细胞核的方法，采用组织匀浆、密度梯度离心和流式细胞术进行免疫标记分选。该技术可获得高纯度细胞核，适用于基因表达和表观遗传学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Marcelo Toro在流式细胞术方面提供的协助。本研究由瑞典心脏与肺基金会、欧盟委员会第七框架计划“CardioCell”、瑞典研究理事会、AFA保险公司和ALF项目资助。O.B. 得到德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的支持。

1. 心脏细胞核的分离
<ol>
 <li>用10 ml的1% BSA/PBS包被液包被超速离心管（Beckman Centrifuge Tubes #363664）。盖上管盖，在管式旋转仪中旋转30分钟。弃去包被液，让离心管自然晾干（分析单个鼠心需使用一根离心管；也可选择在一根离心管中处理最多5只鼠心或来自其他物种（如人）的1 g心脏组织）。</li>
 <li>所有后续步骤均需在冰上操作。使用解剖刀从新鲜或速冻的小鼠心脏中分离左心室。注意：本方案针对小鼠心脏优化，但也可适用于大鼠或人的心脏组织。或者，可使用最多1 g来自其他物种的心脏组织。</li>
 <li>用解剖刀将组织切成小块。</li>
 <li>将组织块转移至装有15 ml裂解缓冲液的50 ml Falcon管中。</li>
 <li>使用T-25 Ultra-Turrax探头式匀浆器（IKA）以24,000 rpm匀浆10秒，对心脏组织进行均质化处理。</li>
 <li>加入等体积的裂解缓冲液将匀浆液稀释至30 ml。</li>
 <li>使用玻璃Dounce匀浆器（40 ml）进一步匀浆组织以释放细胞核。使用大间隙杵头进行8次上下研磨。</li>
 <li>依次将粗提的细胞核悬液通过100 μm和70 μm的尼龙网细胞滤筛（BD Biosciences）过滤。</li>
 <li>在4 °C下，以700 × g离心10分钟，沉淀粗提的细胞核。</li>
 <li>小心地将离心管倒置以去除上清液，并用纸巾擦拭管内壁。注意不要扰动细胞核沉淀。</li>
 <li>用移液器反复吹打，将粗提的细胞核沉淀溶解于5 ml蔗糖缓冲液中。再向溶解后的沉淀中加入25 ml蔗糖缓冲液。</li>
 <li>向已包被的超速离心管（见步骤1.1）中加入10 ml新配制的蔗糖缓冲液。</li>
 <li>小心地将步骤1.9中溶解于蔗糖缓冲液的重悬细胞核沉淀液叠加在已加入的10 ml蔗糖缓冲液之上。</li>
 <li>将离心管配平后放入JS13.1摆动转子中，并将转子装入高速离心机（Beckman Avanti S-25）。</li>
 <li>在4 °C下以13,000 × g离心60分钟。</li>
 <li>离心结束后，小心从转子中取出离心管，倒置离心管弃去上清液，并用纸巾擦去管内残留的杂质。</li>
 <li>将细胞核沉淀溶解于1 ml核储存缓冲液（NSB plus缓冲液）中。注意：NSB plus含有1.5 mM亚精胺作为DNA稳定剂。</li>
 <li>继续进行步骤2.1，即心肌细胞核的免疫染色。</li>
</ol>
2. 流式细胞术免疫染色
<ol>
 <li>准备免疫染色的阴性对照。从细胞核样品中取出20 μl分装样品，加入980 μl NSB plus缓冲液。</li>
 <li>向细胞核样品中加入抗中心粒周围物质1抗体（兔抗PCM-1，Atlas Antibodies），稀释比例为1:500，用于免疫标记心肌细胞核。将同型对照抗体以与抗PCM-1抗体相同的稀释比例加入第2.1步制备的阴性对照中。</li>
 <li>将阴性对照和样品管在4 °C下孵育过夜。</li>
 <li>用NSB plus缓冲液至少洗涤阴性对照和样品一次（在4 °C预冷的离心机中以700 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于1 ml NSB plus缓冲液中）。</li>
 <li>向阴性对照和样品管中加入抗兔荧光二抗（FITC或APC），稀释比例为1:1000。</li>
 <li>将阴性对照和样品管在4 °C下孵育1小时。</li>
 <li>用NSB plus缓冲液至少洗涤阴性对照和样品一次（在4 °C预冷的离心机中以700 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于1 ml NSB plus缓冲液中）。</li>
 <li>进行流式细胞术分析和分选。</li>
</ol>
3. 流式细胞术
<ol>
 <li>在开始流式细胞分选前，按照步骤1.1所述，用1% BSA/PBS溶液对核收集管（Falcon 15 ml）进行包被处理。</li>
 <li>将样品和阴性对照通过30 μm细胞筛过滤，然后先将阴性对照上样至流式细胞仪（BD Influx）。根据前向散射光（FSC）、前向散射光脉冲宽度（FS pulse width）和侧向散射光（SSC）设定第一和第二门，以确定细胞核及单核（单个细胞核）群体（图2a和b）。在样品中加入DNA染料（DRAQ5（1:500））有助于初步识别细胞核群体。</li>
 <li>上样经免疫标记的样品，并设定第三门，以分离心肌细胞核（PCM-1阳性）与非心肌细胞核（PCM-1阴性）。启动分选（图2c和d）。</li>
</ol>
可选： 为分析核DNA含量（倍性）并进行细胞周期分析，可向细胞核中加入适当的DNA染料（例如Hoechst 33342或DRAQ5）（图2e）。
<ol start="4">
 <li>流式细胞术分选后，将细胞核置于冰上，并重新分析以确定分选纯度（图 3a 和 3b）。</li>
 <li>在4°C离心机中以1500 × g离心15分钟，收集分选后的细胞核。</li>
 <li>用适合下游应用的缓冲液溶解细胞核沉淀。</li>
</ol>
4. 代表性结果
细胞核形态和完整性可通过DNA染色并在显微镜下观察来评估（图1）。PCM-1标记的成功与否可通过落射荧光显微镜和流式细胞术进行评估（图1、图2c和图2d）。PCM-1阳性与阴性细胞群应彼此明显分离（图2c和图2d）。在小鼠左心室中，所有细胞核中约有30%应为心肌细胞核（图2d）。分选纯度可通过重新分析已分选的细胞核来评估（图3a和图3b）。两个细胞核群体的分选纯度均应超过95%。
<img alt="荧光显微镜，蛋白质表达分析；细胞核，PCM-1，Nkx2.5 标记物，细胞研究。" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. PCM-1 鉴定心肌细胞核。 在成年小鼠心脏中，心脏细胞核（a）经 PCM-1 抗体（b）和 Nkx2.5 抗体（c）染色。（d）被 PCM-1 标记的细胞核周围环绕着心肌细胞胞质（肌球蛋白重链（MHC）），并表达转录因子 Nkx2.5，表明 PCM-1 染色可准确识别心肌细胞核（比例尺：20 μm 和 10 μm（d，插图））。（e）使用 DNA 染料 DRAQ5 观察分离的心脏细胞核。（f 和 g）使用抗 PCM-1 抗体标记心肌细胞核（比例尺：10 μm）。注意，在组织切片和分离的细胞核中，心肌细胞核呈现 PCM-1 的核周染色模式（箭头所示）。
<img alt="流式细胞术分析；显示细胞群体的散点图；DNA含量直方图。" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 心肌细胞核的流式细胞分选。 (a) 通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）鉴定心脏细胞核。(b) 第二个门控根据FSC和FS脉冲宽度5识别单个细胞核。(c, d) 荧光门控可将心肌细胞核（PCM-1阳性）与非心肌细胞核（PCM-1阴性）从心脏组织中分离。(e) 小鼠心肌细胞主要为二倍体（2n，>80%），仅一小部分为四倍体（4n）6。需注意，人类心肌细胞含有更高比例的多倍体细胞核（>2n）7,8。
<img alt="流式细胞术散点图比较；PCM-1 与 SSC；细胞群分析示意图。" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 分选后心肌细胞与非心肌细胞核的纯度分析。 对分选后的非心肌细胞核（a）和心肌细胞核（b）进行再分析。两个细胞群的分选纯度均超过 99%。

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

准确鉴定心肌细胞核对于心肌组织再生过程的分析至关重要2,3。从新鲜组织中分离心肌细胞的传统技术主要基于对细胞外基质蛋白的酶消化，随后通过低速离心从间质细胞中进行纯化。进一步纯化来自胚胎干细胞（ESC）的活心肌细胞可通过表面标志物（如SIRPA9）免疫标记或线粒体染料10实现；而固定后的心肌细胞则可通过胞质标志物（如肌球蛋白重链（MHC））或核蛋白（如GATA4或Nkx2.5）进行鉴定。然而，Nkx2.5和GATA4的表达不仅限于成熟心肌细胞，在发育过程中及心肌梗死后的心脏祖细胞中亦可检测到11,12。用于鉴定心肌细胞的遗传学策略具有最高的特异性，但无法应用于大型动物模型或人类1。现有策略的局限性导致了关于稀有事件（如增殖、凋亡和嵌合现象）定量分析的争议性结论1,13。因此，亟需建立一种准确的方法以鉴定并纯化成熟分化的心肌细胞核。
本文描述了一种基于中心粒周围物质1（PCM-1）的纯化技术。此前，我们通过显示三个独立的核标记物——PCM-1、心肌肌钙蛋白...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 裂解缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.32 M 蔗糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM 醋酸镁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 蔗糖缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 M 蔗糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM 醋酸镁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 细胞核储存缓冲液（NSB plus）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.44 M 蔗糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM 精胺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>同型兔 IgG- ChIP 级，#ab37415</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗 PCM-1 抗体，#HPA023374</td><td>Atlas Antibodies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴二抗，抗兔 Alexa 488 荧光抗体，#A-21206 或等效荧光二抗</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，30 &amp;mu;m、70 &amp;mu;m 和 100 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃匀浆器（40 ml）及“L”型研杵&quot;&quot;</td><td>VWR（Wheaton Industries Inc.）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Ultra-Turrax 匀浆机</td><td>IKA 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分散工具 S25 N-18 G</td><td>IKA 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管，15 ml 和 50 ml</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 离心管 #363664</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS13.1 摆动转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Influx 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管式旋转仪</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从死后组织中分离心肌细胞核

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

在组织切片中，心肌细胞核的鉴定一直具有挑战性，因为大多数策略仅依赖于细胞质标记蛋白1。在心肌细胞中发生的稀有事件，如增殖和凋亡，需要准确识别心肌细胞核，以分析稳态及病理条件下细胞的更新情况2。本文提供了一种通过密度沉降法结合针对中心粒周围物质1（pericentriolar material 1, PCM-1）抗体进行免疫标记，从而从死后组织中分离心肌细胞核的方法，并随后通过流式细胞术进行分选。该策略具有高通量分析和分离的优势，且对新鲜组织和冷冻保存的存档材料均适用。这使得研究生物样本库中已收集的样本成为可能。该技术已在多种物种中得到验证和应用，适用于多种下游实验，如碳-14测年3、细胞周期分析4、胸腺嘧啶类似物（如BrdU和IdU）的可视化4、转录组学及表观遗传学分析。

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。

心肌细胞核在组织切片中的鉴定一直具有挑战性，因为大多数策略仅依赖于细胞质标记蛋白1。罕见事件……

本实验的总体目标是从死后组织中分离心肌细胞核。首先使用探头式匀浆器和玻璃匀浆器对组织进行匀浆，随后进行多次过滤步骤，以实现该目的。第二步是通过密度梯度沉降离心法，将细胞核组分从其他细胞组分中分离出来。接下来，使用针对PCM1的抗体对心肌细胞核进行免疫标记。最后一步是通过荧光激活细胞分选技术分离标记的心肌细胞核。最终，在进行后续下游操作之前，通过重新分析分选后的细胞核组分来确认心肌细胞核的纯度。该技术的主要优势在于，可以高通量地同等有效地分析新鲜或冷冻存档组织中的心肌细胞核。由于多种原因，针对心肌细胞的基于DNA的研究尤其具有挑战性。首先，心肌细胞仅占心脏细胞总数的约20%至30%。此外，这些细胞在很大程度上具有核化特征。而且，心肌细胞在很大程度上是多倍体。本文所述方法能够克服所有这些难题。开始实验步骤之前，用10毫升1% BSA与PBS的包被溶液对超速离心管进行包被。将离心管旋转30分钟后，移除包被溶液，使其自然风干。使用手术刀从速冻的小鼠心脏中分离左心室，开始心脏细胞核的分离操作。将分离的组织修剪成小段，然后将组织块转移至含有15毫升裂解缓冲液的50毫升锥形管中。接下来，使用探头式匀浆器以24,000 RPM的速度匀浆心脏组织10秒，随后加入等体积的裂解缓冲液稀释至总体积30毫升。将匀浆液转移至玻璃Dounce匀浆器中，使用大间隙研杵进行八次研磨，以释放细胞核。然后将粗制细胞核悬液依次通过100微米细胞滤筛和70微米细胞滤筛，收集至一个新的50毫升锥形管中。随后在4°C条件下，以700 × g离心10分钟，沉淀粗制细胞核。倒置离心管，小心吸除上清液，然后用纸巾擦拭管内壁，注意勿扰动细胞核沉淀。用移液器将溶液上下吹打数次，以重悬粗制细胞核。在5 mL蔗糖缓冲液中分离，然后向核悬液中再加入25 mL蔗糖缓冲液。接下来，向一支先前制备好的包被超速离心管中加入10 mL freshly prepared蔗糖缓冲液。然后，将重悬的核沉淀液小心地覆盖在缓冲液上方。将离心管在摆动转子中平衡后，将转子放入高速离心机中，以13,000 ×g、4 °C离心60分钟。离心结束后，小心地从转子中取出离心管，并再次将其倒置。弃去上清液，用纸巾擦拭管内壁残留的碎片，然后将核沉淀重悬于1 mL核储存缓冲液中。开始免疫染色程序之前，将20微升的细胞核样品转移至一支离心管中。向该样品中加入980微升细胞核储存缓冲液，并将此管标记为阴性对照。现在，向细胞核样品及阴性对照管中加入抗PCM一抗体，稀释比例为1:500。然后将两个试管在4°C下孵育过夜。第二天，用细胞核储存缓冲液洗涤试管并弃去上清液后，将细胞核沉淀重悬于另一毫升的细胞核储存缓冲液中。然后将抗狂犬病荧光二抗以1:100的稀释比例加入细胞样品中，在4摄氏度下孵育一小时。用细胞核储存缓冲液洗涤离心管后，将沉淀物重悬于1毫升细胞核储存缓冲液中，用于流式细胞术分选和分析。在包被细胞核收集管时，如同视频开始时所展示的，使用BSA和PBS进行处理。首先将样品和阴性对照分别通过30微米细胞滤网过滤。在上样前，加入DNA染料。加入1:500稀释的试剂以鉴定细胞核群体。将阴性对照加载到流式细胞仪上。利用前向散射和侧向散射参数设置第一个门控，用于定义心脏细胞核，类似于此处所示的点图（DOT plot）。然后使用前向散射和前向散射脉冲宽度参数创建第二个门，圈选细胞核单细胞，类似于此处所示的点图。现在加载免疫标记样本，并设置第三个门，以区分PCM1阳性的心肌细胞核与PCM1阴性的非心肌细胞核。利用细胞核DNA染料分析DNA含量，并进行细胞周期分析，分析方法类似于本直方图所示。根据细胞核的PCM1阳性情况分选后，将分选得到的细胞核置于冰上，并重新分析每份分选样品的一部分，以确定分选纯度。最后，将收集管中的分选细胞核在1500 × g、4 °C条件下离心15分钟。弃去上清液后，将细胞核沉淀重悬于与后续实验应用相容的缓冲液中。在本图中，成年小鼠心脏组织使用了核染料以及针对PCM1、心肌转录因子NKX2.5和肌球蛋白重链（MHC）的抗体进行染色。此处展示了上一幅图叠加图像的放大区域。请注意，以白色标记的PCM1阳性细胞核表达红色的转录因子NKX2.5，并被绿色的心肌细胞胞质所包围。这些数据共同表明，PCM one 染色可准确识别心肌细胞核。插图突出了 PCM one 在心肌细胞核中的核周染色模式，接下来三幅图所示实验中的箭头进一步指示了这一模式。在这些实验中，分离的心脏细胞核经 DNA 染料 DRAC five 及抗 PCM one 抗体染色。此处为前两幅图的叠加图像，箭头再次突出了 PCM one 在分离的心肌细胞核中的核周染色模式。该点图显示，通过此方法分离的细胞核中约有 30% 为心肌细胞核，这由其 PCM1 标记所示。最后，如这些直方图所示，小鼠心肌细胞核主要为二倍体，表现为 2N 峰，仅有少量为四倍体，表现为较小的 4N 峰。该技术的一个优势在于，其可轻松适用于其他物种。与人类相同。

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

验尸报告组织心肌细胞核分离

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

心肌细胞更新率的定量具有挑战性。本文所述方案通过实现对新生心肌细胞核生成及细胞核倍性的准确且灵敏的定量，为解决这一难题做出了重要贡献。...

同时评估心肌细胞DNA合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本研究的目的是建立一种可重复地从成年心脏中分离心肌细胞并测量其DNA含量和核化程度的方法。...

从固定心脏中分离心肌细胞用于免疫细胞化学和倍性分析

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&lt;50...

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。...

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

本文介绍了一种从心肌梗死（MI）后小鼠心脏中分离出足量且高活性的非心肌细胞的实验方案。该方法可用于后续的单细胞测序、流式细胞术分析以及原代细胞培养。...

制备心肌梗死后成年小鼠心脏的非心肌细胞悬液用于单细胞RNA测序

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

采用优化的解离方案对冠状动脉内膜切除术组织样本进行处理，以分离单个细胞核。通过三种互补方法验证分离细胞核的完整性：台盼蓝排斥染色法评估细胞膜完整性，DAPI标记共聚焦显微镜观察确认细胞核形态，流式细胞术定量细胞核得率与纯度。...

冠状动脉旁路移植术患者冠状动脉内膜剥脱组织的单细胞核分离

学习从验尸组织分离心肌细胞核的方法，采用组织匀浆、密度梯度离心和流式细胞术进行免疫标记分选。该技术可获得高纯度细胞核，适用于基因表达和表观遗传学研究。

从死后组织中分离心肌细胞核

探索更多视频