对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

本实验的总体目标是利用非绿色荧光的钙离子指示剂染料，在脑片中对GFP标记的神经元进行空间和时间上的刺激诱导钙反应监测。该目标通过以下步骤实现：首先提取在特定细胞中表达GFP的转基因小鼠的脑组织；第二步是使用切片机制备脑组织切片。

接下来，将钙离子指示剂染料加载液用移液器滴加到脑片上，使染料被脑细胞吸收。最后一步是使用共聚焦显微镜对荧光细胞进行时间戳记录。最终通过多色钙成像分析显示GFP标记神经元中的钙离子反应。

与现有的共聚焦显微技术相比，该方法的主要优势在于，我们可以利用红移荧光钙离子指示剂染料，对表达绿色荧光蛋白（GFP）的神经元中的钙信号进行成像。由于该红色荧光染料具有显著的斯托克斯位移，使得我们能够结合绿色GFP荧光，仅使用单一激发波长即可实现红色荧光的多色分析。我们最初产生这一方法的构想，源于在研究中遇到的一个问题：我们只能通过遗传编码的荧光标记（即绿色荧光蛋白）来识别特定神经元，但却需要同时监测这些神经元中的钙信号。

我将演示该实验流程中的若干关键步骤。首先，将加热后的琼脂溶液倒入方形培养皿中，高度约为1厘米；待其冷却凝固后，将4%琼脂凝胶切割成每边长1厘米的立方体小块，放入瓶中储存备用。在处死小鼠后，使用单刃剃须刀片从额骨沿正中矢状方向向枕外隆凸处切开头皮。

随后，首先沿头颅外侧方向进一步切开头皮切口，然后沿腹侧方向切开，再做两个侧向切口和一个头侧切口。

在枕骨大孔处用小型弹簧剪仔细分离颅骨。此时，枕骨、顶间骨和顶骨应已分离。如果硬脑膜仍然存在，需用镊子小心去除，以防止损伤脑组织。

接下来，去除鳞骨、前筛骨孔和额骨孔。现在可以用倒置的微型勺形刮匙轻松取出脑组织，并切断颅神经。脑组织应腹侧面朝下，放置在耐切割的表面上，确保脑组织的腹面朝下。

使用单刃剃须刀片切除小脑。这一平整的切面将作为将脑组织固定在切片板上以进行冠状脑切片的基础。接下来，取少量快速固化高性能氰基丙烯酸酯超级胶水，将脑组织的切面朝下粘附于切片机的底板上。

随后，将一块一立方厘米的琼脂凝胶粘贴在脑组织腹侧，并将其固定在切片机的底板上，以在切片过程中提供支撑和固定。待粘合剂干燥后，将底板放入切片机的浴槽中，槽内盛有六摄氏度的含氧细胞外溶液。然后以较低的切片速度将脑组织切成300微米厚的切片，收集冠状脑切片直至整个脑组织被完全切完。

现在，通过将DMSO溶液加入onic F1 27粉末中，配制20%的onic F1 27 DMSO溶液。接着，将溶液直接超声处理两分钟以使其溶解。随后，取5微升20%的onic F1 27溶液加入含有50微克细胞通透性furred am的离心管中。

用移液器将溶液混匀。然后向混合物中加入45 µL细胞外液，并涡旋振荡。短暂操作后，再加入325 µL细胞外液，并将试管超声处理三分钟。

超声处理后，加入 1.156 毫升含氧细胞外溶液，以获得最终的钙指示剂 D 负载溶液。将冠状脑片转移至六孔细胞培养板中，每孔加入含氧细胞外溶液并放置最多六片脑片。随后，小心吸除各孔中的含氧细胞外溶液，注意避免损伤脑片。

接下来，将750微升钙离子指示剂D加载溶液直接加入每个孔中。脑片应被含有rore am的溶液覆盖。随后，将脑片置于氧气-二氧化碳细胞培养孵育箱中，在37摄氏度下孵育45至60分钟。

孵育结束后，将钙离子指示剂DI负载液更换为新鲜的含氧细胞外溶液，以防止细胞过度负载。为监测刺激诱导的荧光信号变化，将一片负载了fure red的脑片转移至记录室，并按需定位。将记录室安装至共聚焦显微镜系统后，用含氧细胞外溶液灌流脑片10分钟，以清除细胞外残留的钙离子指示剂染料。

离开记录室后，将八通道灌流液收集至真空瓶中。然后在显微镜下用低倍镜观察脑片，记录脑片的方向，并在脑片中找到目标区域，本实验中为脑内的下丘脑区域。

随后切换至高倍镜。通过采集GFP图像并同时检测URA红色信号的荧光强度，在切片中找到目标细胞。调节激光功率至能够检测URA红色荧光强度变化的水平，并避免两种荧光染料发生漂白。

接下来，以 0.5 至 2 赫兹的速率开始采集图像，以获取 fura 和 GFP 信号。该图显示了冠状脑切片中 GN、RHR Tau GFP 神经元的共聚焦图像。这是在将脑切片加载 fura am 后观察到的相对均匀的荧光信号，而此图为显示加载了钙离子指示剂染料的神经元的合并图像。

以下是来自下丘脑不同脑区中单个GFP标记神经元的体感刺激诱导钙反应的示例。可通过计算曲线下面积来估算特定细胞在相同时间段内钙离子总量的变化，从而比较不同下丘脑核团中GN RHR表达神经元之间的钙信号差异。一旦掌握该技术，若操作得当，包括钙离子指示剂染料的制备、脑片的染色及孵育在内的整个过程可在90分钟内完成。