Name: 在GFP标记的下丘脑神经元的小鼠脑片成像钙反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习使用红色荧光钙指示剂染料在小鼠脑片中监测GFP标记神经元的钙反应。该方法结合共聚焦显微镜实现多色成像分析，可实时追踪钙信号时空动态，为神经科学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

感谢参与本研究工作的同事们。本工作得到了德国研究基金会（SFB 894）、DFG重点计划1392“嗅觉的整合分析”以及大众基金会（TLZ）的资助。TLZ是大众基金会的利希滕贝格讲席教授。

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

神经科学中的一个核心问题是理解大脑如何处理社会信息。社会识别所需的主要信息来源由嗅觉或信息素信号编码。这些信号通过鼻腔内的神经元群体检测，并在大脑中（尤其是下丘脑）被识别，这在许多社会行为过程中发挥关键作用，并影响激素及其他神经内分泌因子13-16。在如下丘脑等包含多种功能核团和大量神经元的脑区中，分析神经元反应的一个主要障碍在于如何识别出特定的目标神经元。
已开发出许多转基因小鼠品系，其中主要利用GFP来标记神经元。然而，GFP的荧光特性会干扰使用如fluo-3和fluo-4等Ca2+指示剂染料进行的测量17。因此，我们开始采用红移型Ca2+指示剂染料（如fura-red）来研究GFP标记的神经元3,4。此前，基于fura-red的Ca2+成像已与表达GFP的胰岛β细胞以及在HEK细胞中表达GFP标记受体的研究相结合5,6。与fura-2类似，已有报道指出fura-red与GFP之间存在一定的串扰2。然而...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Fura-red/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-3021</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 Hyrax V 50</td><td>Zeiss</td><td>9770170</td><td></td></tr><tr><td>切片机冷却装置 CU 65（适用于 Hyrax V 50）</td><td>Zeiss</td><td>9920120</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱，CB210-UL</td><td>Binder</td><td>0019389</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水，Loctite 406TM</td><td>Henckel</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>双头刮勺，勺形</td><td>Bochem</td><td>3182</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺，勺形</td><td>Bochem</td><td>3344</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀，Moria-Vannas-Wolff，7 mm 刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀，Vannas，3 mm 刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wagner 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14071-12</td><td></td></tr><tr><td>医用镊子，Dumont 7b</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>大型矩形开放式浴槽（RC-27）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0238</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 BioRad Radiance 2100</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

对下丘脑小鼠脑切片中gfp标记神经元的钙反应进行成像

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

尽管我们对大脑中信息编码机制的认识已大幅增长，但关于下丘脑等脑区多功能核团中特定神经元的精确分子步骤及其活动的核心问题仍然存在。这一问题包括参与调控各种神经激素信号转导级联反应的分子组分的鉴定。细胞内 Ca2+ 浓度的升高在调节神经元敏感性方面起着重要作用，无论是在信号转导水平还是在突触部位均如此。
近年来，一些新工具被开发出来，用于在大脑中纷繁复杂的神经元中识别特定神经元，其原理是在特定启动子的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）。为了在空间和时间上同时监测GFP标记神经元中由刺激诱导的Ca2+反应，需要使用非绿色荧光的Ca2+指示剂染料。此外，共聚焦显微镜因其能够清晰显示组织切片中不同深度平面的单个神经元，并有效限制非焦平面的荧光干扰，已成为成像单个神经元的常用方法。已有研究将比率型Ca2+指示剂fura-2与GFP标记的神经元结合使用1。然而，该染料需用紫外光（UV）激发，而紫外激光器成本较高，且紫外光在组织中的穿透深度有限，限制了其在许多实验室的应用。此外，GFP的荧光可能干扰fura-2的信号2。因此，我们决定采用一种红色荧光的Ca2+指示剂染料。fura-red具有极大的斯托克斯位移，使其可在单一激发波长下与GFP联合实现红色荧光的多色分析。我们此前在GFP标记的嗅觉神经元中联合使用fura-red已取得良好效果3。用于嗅觉组织切片的实验方案在下丘脑神经元中似乎同样有效4。基于fura-red的Ca2+成像也已成功应用于GFP标记的胰岛β细胞以及在HEK细胞中表达的GFP标记受体5,6。fura-red的一个特殊性质是：当该指示剂与钙结合后，其在650 nm处的荧光强度会降低7。因此，Ca2+浓度较低的静息状态神经元具有相对较强的荧光强度。需要指出的是，目前已有其他红色Ca2+指示剂染料或正在开发中的新型染料，可能在不同类型的神经元或脑区中提供更优或改进的成像结果。

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca2+指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca2+信号成像的最新进展。

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

尽管我们对大脑中信息编码机制的了解已大幅增加，但一个核心问题仍然存在：……

本实验的总体目标是利用非绿色荧光的钙离子指示剂染料，在脑片中对GFP标记的神经元进行空间和时间上的刺激诱导钙反应监测。该目标通过以下步骤实现：首先提取在特定细胞中表达GFP的转基因小鼠的脑组织；第二步是使用切片机制备脑组织切片。接下来，将钙离子指示剂染料加载液用移液器滴加到脑片上，使染料被脑细胞吸收。最后一步是使用共聚焦显微镜对荧光细胞进行时间戳记录。最终通过多色钙成像分析显示GFP标记神经元中的钙离子反应。与现有的共聚焦显微技术相比，该方法的主要优势在于，我们可以利用红移荧光钙离子指示剂染料，对表达绿色荧光蛋白（GFP）的神经元中的钙信号进行成像。由于该红色荧光染料具有显著的斯托克斯位移，使得我们能够结合绿色GFP荧光，仅使用单一激发波长即可实现红色荧光的多色分析。我们最初产生这一方法的构想，源于在研究中遇到的一个问题：我们只能通过遗传编码的荧光标记（即绿色荧光蛋白）来识别特定神经元，但却需要同时监测这些神经元中的钙信号。我将演示该实验流程中的若干关键步骤。首先，将加热后的琼脂溶液倒入方形培养皿中，高度约为1厘米；待其冷却凝固后，将4%琼脂凝胶切割成每边长1厘米的立方体小块，放入瓶中储存备用。在处死小鼠后，使用单刃剃须刀片从额骨沿正中矢状方向向枕外隆凸处切开头皮。随后，首先沿头颅外侧方向进一步切开头皮切口，然后沿腹侧方向切开，再做两个侧向切口和一个头侧切口。在枕骨大孔处用小型弹簧剪仔细分离颅骨。此时，枕骨、顶间骨和顶骨应已分离。如果硬脑膜仍然存在，需用镊子小心去除，以防止损伤脑组织。接下来，去除鳞骨、前筛骨孔和额骨孔。现在可以用倒置的微型勺形刮匙轻松取出脑组织，并切断颅神经。脑组织应腹侧面朝下，放置在耐切割的表面上，确保脑组织的腹面朝下。使用单刃剃须刀片切除小脑。这一平整的切面将作为将脑组织固定在切片板上以进行冠状脑切片的基础。接下来，取少量快速固化高性能氰基丙烯酸酯超级胶水，将脑组织的切面朝下粘附于切片机的底板上。随后，将一块一立方厘米的琼脂凝胶粘贴在脑组织腹侧，并将其固定在切片机的底板上，以在切片过程中提供支撑和固定。待粘合剂干燥后，将底板放入切片机的浴槽中，槽内盛有六摄氏度的含氧细胞外溶液。然后以较低的切片速度将脑组织切成300微米厚的切片，收集冠状脑切片直至整个脑组织被完全切完。现在，通过将DMSO溶液加入onic F1 27粉末中，配制20%的onic F1 27 DMSO溶液。接着，将溶液直接超声处理两分钟以使其溶解。随后，取5微升20%的onic F1 27溶液加入含有50微克细胞通透性furred am的离心管中。用移液器将溶液混匀。然后向混合物中加入45 µL细胞外液，并涡旋振荡。短暂操作后，再加入325 µL细胞外液，并将试管超声处理三分钟。超声处理后，加入 1.156 毫升含氧细胞外溶液，以获得最终的钙指示剂 D 负载溶液。将冠状脑片

imaging-calcium-responses-gfp-tagged-neurons-hypothalamic-mouse-brain

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在GFP标记的下丘脑神经元的小鼠脑片成像钙反应

犁鼻器（VNO）可检测种内化学信号，这些信号传递社会和生殖信息。我们利用在犁鼻器组织中表达G-CaMP2的转基因小鼠进行了Ca2+成像实验。该方法使我们能够分析犁鼻神经元对大量信息素刺激所产生的复杂反应模式。...

在表达基因编码钙传感器的犁鼻器组织切片中成像神经元反应

来源： Bancroft, E. A., et al. 定量分析原代小鼠中脑神经元中的自发性 Ca2+ 流动及其下游效应. J. Vis. Exp. (2020)...

小鼠胚胎来源腹侧中脑神经元中钙离子内流的可视化

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+...

脑片中神经元树突的双光子钙成像

本方案详细介绍了如何实施和进行多光纤光度记录，如何校正钙离子非依赖性伪影，以及双色光度成像的重要注意事项。...

用于记录自由活动动物神经活动的多光纤光度法

本文介绍了如何暴露一只活体、麻醉状态下的实验小鼠的膝状神经节，并利用钙成像技术记录这些神经元群体对不同味觉刺激的反应，从而实现使用多种刺激物进行多次重复实验。该方法可用于深入比较哪些神经元对哪些味觉物质产生反应。...

小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

我们介绍一种从腹侧暴露成年小鼠脑干的实验方案。通过使用梯度折射率透镜与微型显微镜，可利用钙成像技术在活体中检测下橄榄核神经元胞体的活动。...

in vivo 小鼠下橄榄核钙成像

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案详细描述了在清醒小鼠上丘（SC）中成像钙反应的实验流程，包括在野生型小鼠中利用双光子显微镜对单个神经元活动进行成像，同时保持皮层完整；以及在部分皮层缺失的突变型小鼠中利用宽场显微镜对整个上丘进行成像。...

小鼠上丘钙成像

本方案概述了 体内 利用钙成像技术测量腰段6背根神经节（L6...

体内背根神经节神经元对躯体和内脏刺激反应的钙成像

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

学习使用红色荧光钙指示剂染料在小鼠脑片中监测GFP标记神经元的钙反应。该方法结合共聚焦显微镜实现多色成像分析，可实时追踪钙信号时空动态，为神经科学研究提供可靠工具。

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

探索更多视频