在GFP标记的下丘脑神经元的小鼠脑片成像钙反应
August 24th, 2012
在这个协议中，我们更新了最新进展，成像钙 2 +绿色荧光蛋白标记的神经元在脑组织切片，使用红色荧光钙信号 2 +指示剂染料。
该程序的总体目标是使用非绿色荧光钙指示剂染料在脑切片中监测刺激诱导的钙反应，包括 GFP 标记神经元中的空间和时间。这是通过首先提取在特定细胞中表达 GFP 的转基因小鼠的大脑来实现的。第二步是用切片机制备组织切片。
接下来，将钙指示剂染料上样溶液移液到切片上，以使染料能够被脑细胞吸收。最后一步是使用共聚焦显微镜对荧光细胞进行时间戳记录。最终，使用多色钙成像分析显示 GFP 标记神经元中的钙反应。
与现有的共聚焦显微镜方法相比，该技术的主要优点是，我们可以使用红移荧光钙指示剂芯片对绿色荧光 GFP 技术神经元中的钙进行成像。较少的红色的巨大冲程偏移使我们能够使用单个激发波长对红色荧光与绿色 GFP 进行多色分析。当我们面临监测神经元中钙信号的问题时，我们第一次想到了这种方法，我们只能使用遗传荧光技术（即绿色荧光蛋白）来识别这些信号。
现在，我将演示此过程的各种关键步骤。首先将加热的琼脂溶液倒入方形培养皿中至一厘米高，冷却硬化后将 4% 琼脂凝胶切成一立方厘米的块状，并放入瓶中储存。斩首后，用单刃剃须刀片在从额骨到枕外突的中央矢状方向切割头皮。
随后，首先在喙侧方向进一步打开切割的头皮。然后向腹侧方向。然后做两个侧面和一个嘴部切口。
在枕骨大孔中，用小弹簧剪刀小心地劈开颅骨。此时，枕骨顶骨间和顶骨应分离。如果硬脑膜仍然存在，请用一把镊子小心地将其取出，以防止对大脑造成损伤。
接下来，切除鳞状骨、筛前孔和额孔。现在，可以用倒置的微勺刮刀轻松去除大脑，并且可以切断颅神经。大脑应该落在它的腹侧，放在一个防割的表面上，大脑的腹面向下。
使用单刃剃须刀片去除小脑。这个直切表面将是将大脑安装在板上的基础，以便能够切片冠状脑切片。接下来，使用少量快速固化的高性能氰基丙烯酸酯胶粘剂强力胶将大脑与切片机底板上的切割面粘合在一起。
随后，在大脑腹侧将一立方厘米的琼脂凝胶块粘在切片机的底板上，以在切片时支撑和固定大脑。键合干燥后，将板放入含有 6 摄氏度冷含氧细胞外溶液的切片机浴中。然后以低切片速度将大脑切成 300 微米厚的切片，收集冠状脑切片，直到整个大脑被切片。
现在通过将 DMSO 溶液添加到 onic F1 27 粉末中，在 DMSO 溶液中制备 20%onic F1 27。接下来，通过直接对溶液进行声波 2 分钟来溶解它。之后，将 5 微升 20%onic F1 27 溶液加入一管 50 微克细胞渗透性毛皮 am 中。
用移液管混合溶液。然后向混合物中加入 45 微升细胞外溶液并涡旋。简而言之，再加入 325 μL 细胞外溶液，再对试管进行超声处理 3 分钟。
超声处理后，加入 1.156 毫升含氧细胞外溶液，得到最终的钙指示剂 D 上样溶液。将冠状脑切片转移到装有含氧细胞外溶液的六孔细胞培养板中，每孔最多 6 片。然后从腔室中吸出含氧细胞外溶液，小心不要损坏脑切片。
接下来，将750 微升钙指示剂 D 上样溶液直接移液到每个溶液中。嗯，脑切片应该被含有 rore am 的溶液覆盖。之后，将切片在氧气二氧化碳细胞培养箱中在 45 摄氏度下孵育 60 至 37 分钟。
在孵育结束时，用新鲜的含氧细胞外溶液替换钙指示剂 DI 上样溶液，以防止细胞超负荷。为了监测刺激诱导的荧光信号变化，将其中一个 fure red 负载的脑切片转移到记录室并根据需要定位。将腔室安装在共聚焦显微镜装置上后，用含氧细胞外溶液灌注切片 10 分钟，以去除任何多余的细胞外钙指示剂染料。
离开记录室后，PERFUSE 8 被收集在真空瓶中。然后通过显微镜以低放大倍率观察切片。记下切片的方向，并在切片中找到感兴趣的区域，在我们的例子中，即大脑中的下丘脑区域。
之后，更改为高倍率。通过收集 GFP 图像并同时检查 URA 红色信号的荧光强度，在切片中找到感兴趣的细胞。将激光功率调整到允许测量 URA 红色荧光强度变化的值，并防止两个荧光团漂白。
接下来，开始以 0.5 到 2 赫兹的速率采集图像，以收集 fure 和 GFP 信号。该图显示了冠状脑切片中 GN、RHR Tau GFP 神经元的共聚焦图像。这是在用 fure am 加载脑切片后观察到的相对均匀的荧光信号，这是显示加载钙指示剂染料的神经元的合并图像。
以下是不同下丘脑区域中单个 GFP 标记神经元的体细胞刺激诱导的钙反应的示例。一旦掌握，可以使用曲线下面积作为同一时期给定细胞中钙总变化的估计值来比较不同下丘脑核的 GN RHR 表达神经元之间不同的钙信号。该技术可以在不到 90 分钟的时间内完成，包括钙指示剂染料的制备、切片的加载和孵育（如果执行得当）。
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概述
本协议概述了一种方法，用于监测大脑切片中 GFP 标记的神经元中的钙反应，使用红色荧光钙指示剂染料。该方法允许对刺激反应中的钙信号进行时空分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 钙信号传导对神经元功能至关重要。
- GFP 标记的神经元允许在脑组织中进行特定的可视化。
- 红色荧光染料为绿色指示剂提供了一种替代方案。
- 共聚焦显微镜能够对钙动力学进行高分辨率成像。
研究目的
- 监测神经元中刺激诱导的钙反应。
- 利用非绿色荧光钙指示剂染料以获得更好的对比度。
- 增强钙信号的多色成像分析。
使用的方法
- 从表达 GFP 的转基因小鼠中提取脑组织。
- 使用显微切片机准备大脑切片。
- 将钙指示剂染料加载溶液应用于切片。
- 通过共聚焦显微镜记录荧光细胞的时间戳。
主要结果
- 脑细胞成功吸收了钙指示剂染料。
- 在 GFP 标记的神经元中可视化钙反应。
- 有效使用多色钙成像分析。
- 展示了钙信号传导的空间和时间动力学。
结论
- 这种方法为研究神经元中的钙信号传导提供了可靠的方法。
- 红色荧光染料可以增强成像能力。
- 该协议可以应用于涉及神经元活动的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of calcium responses in genetically defined hypothalamic neurons enables precise interrogation of neurohormonal signaling pathways at the single-cell level. This approach addresses the challenge of isolating stimulus-induced activity in specific neuronal populations, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation. The method's compatibility with multicolor analysis facilitates robust, reproducible data for portfolio triage and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of stimulus-induced calcium flux in genetically identified neurons.
- Supports functional validation of neurohormonal targets within complex hypothalamic circuits.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating cell-type specific responses.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven target selection.
Screening & Assay Development
- Establishes validated brain slice systems for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative calcium imaging readouts for assay standardization.
- Enables multicolor analysis, supporting multiplexed screening strategies.
- Improves assay scalability and platform reuse across neuronal subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant hypothalamic pathways.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of CNS targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in neuroendocrine programs.
- Enables comparative analysis across neuronal populations for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS research pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in genetically defined neurons.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative calcium imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides area-under-curve and temporal response metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of functional outputs with disease-relevant neuronal circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse neuronal and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in neurobiology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and genetically modified mouse models.
- Demands access to advanced microscopy and fluorescence analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading and imaging parameters.
- Adaptable to other neuronal populations and tissue types with protocol optimization.
- Dependent on the availability and performance of red-shifted calcium indicator dyes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:52
Solution Preparation and Brain Dissection
3:21
Coronal Hypothalamic Sections Slicing
4:30
Preparation of the Ca2+ Indicator Dye Loading Solution
6:35
Microscopy and Analysis
7:59
Results: Ca2+ Signals in TGFP Neurons of Mouse Hypothalamic Brain Slices
8:52
Conclusion
