细胞特异性分析 拟南芥 使用荧光激活细胞分选法分离叶片细胞

本实验的总体目标是从叶片中分离出特定细胞类型的原生质体群体。首先，培育在叶片特定细胞类型中表达GFP的植株；其次，采集叶片并通过酶解消化法生成原生质体。

接下来，使用荧光激活细胞分选（FACS）对原生质体进行过滤和分选。最后一步是通过荧光显微镜确认分选的准确性。最终，分选后的原生质体可用于细胞类型特异性基因表达分析、蛋白质组学分析或代谢谱分析。

荧光激活细胞分选技术此前已成功用于根部，但将其用于分离叶片细胞时，由于叶绿素荧光的干扰，此前对标记GFP的应用受到限制。该方法的可视化演示至关重要，因为样品制备需迅速且谨慎，这对于最大限度减少细胞分选过程中可能发生的广泛生理变化尤为关键。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为他们不了解如何设置细胞分选仪，也不清楚如何确认分选的准确性。该方法有助于解答植物系统生物学领域的关键科学问题。在叶片等复杂的多细胞器官中，鉴定基因调控网络存在难题，原因是不同类型的细胞会表达不同的基因群组。

这种遗传信息在整片叶子的采收分析过程中会丢失，从而演示该实验步骤。与我一同进行实验的还有 Ellison As 和 Sanjeev Kuma，他们为本研究在实验室中提供技术支持。首先，向一个直径九厘米的圆形培养皿中加入 20 毫升含有原生质体酶以及转录和RNA抑制剂的溶液 A。

然后采集所需的叶片材料，用于包含多个叶片的样品，如本处所示样品。将叶片排列成最多15片的叠层，然后使用剃刀刀片将叶片切成宽度为1毫米的条状。

使用平头镊子立即将叶条转移至培养皿中，轻轻分开叶条，然后对样品进行两次真空浸润，每次五分钟。接着，将培养皿置于转速为90 RPM的摇床中，在室温下孵育三至四小时。在孵育过程中，每隔半小时用镊子将叶条彼此分开。

消化完成后，将原生质体溶液轻轻通过70微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。为去除叶片条，叶片条将被保留，原生质体则通过滤网。

现在用 4 毫升溶液 A 轻柔地冲洗叶条，并将洗涤液收集到 50 毫升离心管中。然后将原生质体悬液转移至圆底管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。注意不要扰动沉淀，轻柔地尽可能吸除上清液，再在相同的离心条件下用 5 毫升溶液 A 洗涤原生质体。

最后，在去除上清液后，使用截断的 P 1000 枪头将原生质体重悬于适量的溶液 A 中，用于立即分选。使用未截断的 P 1000 枪头将原生质体溶液中的任何团块分散开。通过 50 微米滤膜将原生质体过滤至取样管中，以进一步解离细胞。

然后根据需要稀释细胞溶液，以避免堵塞细胞进样喷嘴。在确定最佳细胞进样条件后，使用488纳米氩离子激光器检测GFP阳性原生质体，通过比较580/30带通滤光片与530/40带通滤光片的输出信号进行识别。请注意，GFP阳性原生质体会出现在530信号高、580信号低的细胞群中。

非GFP原生质体位于低530、低580群体中，而死亡或濒死的原生质体及碎片则出现在高580群体中。为了通过荧光显微镜观察分选后的原生质体，分选后应直接将原生质体收集到至少八倍体积的A溶液中。分选后的原生质体可通过离心浓缩，并收集至八倍体积的A溶液中，随后在荧光显微镜下观察，以验证富集效果。第一幅图像展示了TP 382细胞系富集的示例，该细胞系在保卫细胞中表达GFP。本表总结了使用该方法在扩增前后获得产量的示例。

500 皮克至 50 纳克之间的获得量足以用于 Ovation Pico WTA 系统扩增，并可进一步通过定量 PCR、下一代测序或微阵列进行分析。下一组图像展示了通过上述方法分离和分选得到的各种原生质体细胞系。这些最初的原生质体来源于 KC 2 74 叶片，为 KC 2 74 的横切面。

叶片显示GFP在维管组织中表达。这些原生质体分离自KC 4 64叶片，KC 4 64叶片的横切面显示GFP表达存在于外胚乳表皮。最后，这些原生质体来源于TP 3 82叶片，TP 3 82叶片中也可见相应表达。

此处保卫细胞表达GFP。典型的流式细胞术采集点图显示了580/30纳米与530/40纳米带通滤光片的检测结果对比。图中所示分选门为分选过程中常用的设置。

这幅来自野生型四叶草叶片原生质体的散点图，在无抑制剂条件下进行原生质体制备，显示了一个单一的低530、低580荧光群体。而这幅在抑制剂存在下制备的野生型四叶草叶片原生质体的散点图，则展示了由于抑制剂引起的应激和着色所导致的580荧光信号的偏移。这些散点图分别为KC74、KC464和TP382品系的叶片来源原生质体所获得。

这些样本在存在抑制剂的情况下也进行了处理，结果显示 GFP 存在于高 530 低 580 的群体中。在此代表性实验中，首先获取了每种组分类型的定量 PCR 样本，随后使用 Ovation Pico WTA 系统对样本进行扩增，并进行定量 PCR。

使用GFP特异性引物进行实验。图中显示的数值以红色表示最高值，绿色表示最低值，以肌动蛋白2作为参考基因，其平均值或单个值由水平黄色条带标示。结果验证了对分选组分中GFP细胞含量的光学评估。

高530、低580群体表现出可测量的最高水平的GFP表达。尽管高530、高580群体的GFP表达水平约低1000倍，但低530、低580以及低530、高580群体的GFP表达水平均较低，与对照组完整叶片和未分选原生质体群体的表达水平相当。一旦掌握，若操作得当，该技术从植物材料到获得分选细胞群体可在四至五小时内完成。在执行该操作过程中，重要的是要持续监控细胞分选仪，并在必要时重新校准，以保持分选的准确性。

已找到该实验步骤。还可采用其他方法（如微阵列分析）来比较不同细胞类型中的基因表达水平。目前该技术已建立，我们正在分析特定叶部细胞类型在不同发育阶段的基因表达，并将这些数据与农艺学项目中获得的整片叶片数据进行比较。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用荧光激活细胞分选技术分离叶片中的单细胞类型。