细胞特异性分析拟南芥叶用荧光激活细胞分选
October 4th, 2012
的制造方法拟南芥叶片原生质体，用荧光激活细胞分选（FACS）是兼容的，允许的特定细胞群的研究。此方法是与任何兼容拟南芥
该程序的总体目标是从叶子中分离细胞类型特异性原生质体群体。这是通过首先生长在叶片中特定细胞类型中表达 GFP 的植物来实现的。第二步是使用酶消化收获叶子并生成原生质体。
接下来，使用荧光激活细胞分选或 FACTS 对原生质体进行过滤和分选。最后一步是使用荧光显微镜确认分选的准确性。最终，分选的原生质体可用于细胞类型特异性基因表达分析、蛋白质组学分析或代谢分析。
荧光激活细胞分选以前已成功用于根，但它用于分离叶细胞。由于叶绿素荧光的干扰，在该方法之前用 GFP 标记受到限制。该方法的快速目视演示至关重要，但仔细的样品制备对于最大限度地减少细胞分选过程中可能发生的广泛生理变化至关重要。
一般来说，刚接触这种方法的人会很困难，因为他们不知道如何设置细胞分选仪或如何确认准确分选。这种方法可以帮助回答植物系统生物学领域的关键问题。在复杂的多细胞器官（如叶子）中识别基因调控网络的问题在于，不同的细胞类型表达不同的基因组。
这种遗传信息在整片叶子的收获分析中丢失了 演示程序。与我一起的是 Ellison As 和 Sanjeev Kuma，他们为我们实验室的这项工作提供技术支持。首先，用 20 毫升含有原型电镀酶以及转录和 RNA 抑制剂的溶液 A 填充一个 9 厘米的圆形培养皿。
然后，对于包含多个叶子的样品，收获所需的叶子材料，如此处所示的样品。将叶子排列成最多 15 片叶子。然后用剃须刀片将叶子切成一毫米宽的条状。
立即使用一对扁平镊子将叶条转移到培养皿中，轻轻分离条带，然后真空浸润样品两次，每次 5 分钟。接下来，将培养皿放在室温下设置为 90 RPM 的轨道摇床上，并将原型石膏样品放置 3 到 4 小时。在孵育过程中，用镊子每半小时将叶条彼此分开。
消化后，通过 70 微米细胞过滤器将原生质体溶液轻轻过滤到 50 毫升试管中。要去除叶条，将保留条带。原生质体将过滤。
现在使用 4 毫升溶液 A 轻轻冲洗叶条，将洗涤液收集在 50 毫升试管中。然后将原生质体悬液转移到圆底管中，并在 300 倍 G 和室温下将原生质体离心 5 分钟。小心不要干扰沉淀，轻轻吸出尽可能多的仰卧纳脱，然后在相同的离心条件下用 5 毫升溶液 A 洗涤原生质体。
最后，去除仰卧纳脱后，使用截留的 P 1000 尖端将原生质体重悬于适当体积的溶液 A 中，以便在分选前立即进行分选。使用未切割的 P 1000 尖端分解原生质体溶液中的任何团块。通过 50 微米填充过滤器将原生质体过滤到源管中，进一步解离细胞。
然后适当稀释细胞溶液，以避免堵塞细胞来源喷嘴。在确定最佳电池来源条件后，使用 488 纳米阿贡激光器加上 580 30 带通滤光片的输出与 530 40 带通滤光片确定 GFP 正 Proto plus。请注意，GFP 阳性原生质体将出现在高 530、低 580 的群体中。
随着非 GFP 原生质体在低 530、低 580 种群中，死亡垂死的原生质体和碎片出现在高 580 种群中，用于通过荧光显微镜观察分选的原生质体，将原生质体直接分选到至少 8 体积的溶液 A 中分选浓缩物后，通过离心原生质体可以分选成 8 体积的溶液 A 并收集用于荧光显微镜上的可视化，以验证富集。第一张图片显示了 TP 382 细胞系富集的实例，该细胞系在保卫细胞中表达 GFP。下表总结了扩增前后使用该方法获得的产量示例。
获得的量在 500 pg 至 50 ng 之间，足以通过 ovation PICO WTA 系统进行扩增，并随后通过定量 PCR、下一代测序或微阵列进行分析。下一组图像显示了通过刚才描述的方法分离和分选的各种原生质细胞系。这些第一批原生质体来源于 KC 2 74，留下 KC 2 74 的横切面。
叶子显示 GFP 在脉管系统中表达。这些原生质体是从 KC 4 64 叶中分离出来的，KC 4 64 叶的横切面显示 GFP 表达存在于 A dal 表皮中。最后，这些原生质体来源于 TP 3 82 叶中的 TP 3 82 叶。
GFP 在此处的保卫细胞中表达。显示了典型的传真采集点图，说明了 5 80 30 纳米与 5 30 40 纳米带通滤波器的输出。显示的排序门是排序过程中通常使用的排序门。
在没有抑制剂的情况下抹灰的煤四叶衍生原生质体的第一个停止图显示了单个低 530、低 580 种群。而这个来自野生型煤的点图，在抑制剂存在下贴上原生质体的四叶衍生原生质体表明，由于抑制剂引起的应力和着色而发生的 580 荧光发生变化。这些点图分别是来自 KC 7 4、KC 4 64 和 TP 3 82 系的叶源原生质体。
这些样品也在抑制剂存在下进行了 proplasted，显示 GFP 包含在高 530 低 580 种群中。对于这种代表性，首先获得每种馏分类型的定量 PCR 实验样品。然后使用 ovation PICO WTA 系统和定量 PCR 对样品进行扩增。
使用 GFP 特异性引物进行。显示的值为红色最高值和绿色最低值，使用肌动蛋白 2 作为参考基因的平均值或单个值由水平黄色条表示。结果重新验证了分选组分中 GFP 细胞含量的光学评估。
高 530 低 580 人群表现出最高的可测量 GFP 表达水平。虽然高 530 高 580 种群的 GFP 表达低约 1000 倍，但低 530、低 580 和低 530 高 580 种群表现出低水平的 GFP 表达，与对照全叶和未分选的原生质体种群相当一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四到五个小时内从植物到分选细胞群完成。在执行此程序时，重要的是要记住持续监控细胞分选仪，并在必要时重新校准它，以保持分选的准确性。
找到此程序。可以执行其他方法，例如显微射线分析，以比较和对比不同细胞类型的基因表达水平。现在这项技术已经开发出来，我们正在分析不同发育阶段特定叶细胞类型的基因表达，并将其与农艺学项目中生成的全叶数据进行比较。
观看此视频后，您应该对如何使用荧光激活细胞分选分离单细胞类型的叶片有很好的了解。
概述
本文介绍了一种与荧光活化细胞分选（FACS）兼容的拟南芥叶原生质体分离方法。该技术能够研究表达GFP的特定细胞群，为植物系统生物学的各种分析提供便利。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
背景
- 原生质体分离对于研究特定细胞类型中的基因表达至关重要。
- 以往的方法在荧光检测过程中因叶绿素干扰而面临挑战。
- FACS已成功应用于根细胞，但尚未广泛应用于叶细胞。
- 理解多细胞器官如叶子中的基因调控网络是复杂的。
研究目的
- 开发一种从拟南芥叶子中分离表达GFP的原生质体的可靠方法。
- 使细胞类型特异性基因表达和代谢分析成为可能。
- 为更好理解提供程序的视觉演示。
使用的方法
- 从表达GFP的拟南芥植物中收集叶子。
- 酶解叶组织以生成原生质体。
- 使用FACS过滤和分选原生质体。
- 通过荧光显微镜确认分选准确性。
主要结果
- 成功从各种拟南芥系中分离出原生质体。
- 表现出表达GFP的特定细胞类型的富集。
- 获得足够数量的原生质体以供后续分析，如定量PCR。
- 通过显微镜对分选的原生质体进行视觉确认。
结论
- 该方法为研究拟南芥中的特定细胞群提供了一种稳健的方法。
- 它解决了先前在分离叶原生质体方面的局限性。
- 该技术可以显著推进植物系统生物学的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell-specific analysis using fluorescence activated cell sorting (FACS) in Arabidopsis leaves addresses the challenge of confounded gene expression signals in complex multicellular tissues. This method enables high-confidence dissection of cell-type specific regulatory networks, supporting predictive biology and de-risking early discovery decisions. The approach enhances portfolio relevance by enabling precise molecular profiling at the single-cell level, critical for translational plant systems biology and comparative genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene regulatory networks in distinct leaf cell types.
- Supports functional validation of cell-specific targets by isolating pure populations.
- Improves predictive confidence by reducing signal confounding from heterogeneous tissues.
- Facilitates mechanistic de-risking in plant model systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protoplast populations for downstream gene expression and proteomic assays.
- Standardizes cell sorting and gating strategies for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable workflows for high-throughput screening of cell-type specific responses.
- Supports reliable evaluation of genetic or chemical perturbations in defined cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell-type specific molecular profiles with developmental and stress response biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in plant systems biology.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate genes or pathways based on cell-specific data.
- Supports comparative studies across developmental stages and environmental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This FACS-based method integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target identification to preclinical validation in plant models.
- Discovery Biology: Dissects gene expression and regulatory pathways at single-cell resolution, clarifying biological mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell sorting outputs for robust assay development.
- Analytics: Provides high-fidelity measurements for comparing gene expression across cell types and conditions.
- Translational Research: Links cell-specific molecular signatures to developmental and stress phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cell-type specific analysis across diverse plant lines and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and sorting for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast preparation and FACS instrumentation.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative PCR or sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sorting gates and validation protocols.
- May require adaptation for different plant lines or cell-type specific markers.
- Sample preparation speed and care are critical to minimize physiological changes during sorting.
