Name: 鞘糖脂抗原的质谱分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: 学习使用离子阱质谱分析鞘糖脂抗原的表达谱，该方法通过甲基化反应和色谱分离技术，可从免疫细胞中灵敏检测低丰度糖脂抗原，为癌症生物标志物研究提供可靠工具。

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DZ 受 MD Anderson 癌症中心和美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI079232 的支持。MD Anderson 癌症中心部分受美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 CA16672 的支持。

1. 实验室安全注意事项
<ol>
	<li>所有有机溶剂必须储存在有明确标识的特定区域。请参阅制造商标签以了解所需的灭火器类型。</li>
	<li>所使用的多种试剂可能具有致癌性，并可能导致精神抑郁。这些试剂必须在通风良好的化学通风橱中操作（详见特定试剂和设备表格）。</li>
	<li>建议在处理有机溶剂和细胞时，始终佩戴个人防护装备，如手套、实验服和护目用品。</li>
</ol>
2. 从大鼠白血病细胞中提取糖鞘脂
<ol>
	<li>将 RBL 大鼠白血病细胞8（1000 万至 1 亿）储存于 16x100 mm 玻璃管中，置于 -80 °C 条件下。台盼蓝染色后使用血细胞计数板进行细胞计数。细胞活力应高于 95%。</li>
	<li>使用混合极性溶剂通过强烈超声提取脂质，每次超声 1–2 小时，共进行四次。首次和最后一次使用 6 ml 氯仿-甲醇 1:1（v/v）作为溶剂。第二次和第三次可使用 6 ml 异丙醇:己烷:H2O 55:25:20（v/v/v，使用前通过抽吸去除上层相）。该溶剂的配制方法为：按 55:25:20 的比例混合异丙醇、己烷和 H2O，剧烈振荡后静置，待上层相析出后将其去除，保留下层相用于实验。</li>
	<li>超声处理后进行离心，使不溶性物质形成沉淀。收集上清液并合并。在 Speedvac 中干燥 4 小时。若无 Speedvac，可使用氮气流或旋转蒸发仪。使用高效的冷阱收集挥发的有机溶剂。有机溶剂污染真空泵油会降低真空泵的工作效率。</li>
	<li>使用高效薄层色谱法（HPTLC）进行初步分析。为定量糖脂，配制 0.2% 奥尔cinol 的 50% 硫酸溶液（100 mg 溶于 50 ml）和半乳糖标准品溶液（40 mg 溶于 100 ml 储备液）。在 30 μl 反应体系中配制一系列稀释液作为标准曲线（浓度范围为 0 g/L 至 20 g/L）。向每份稀释样品中加入 20 μl 甲醇。将各糖脂样品溶解于 200 μl 甲醇中，超声处理后取 20 μl 用于糖脂含量测定。在带螺口盖的 1.5 ml Eppendorf 管（Sarstedt, 72.692.005）中，向每个样品加入 0.4 ml 0.2% 奥尔cinol 的 50% 硫酸溶液，并设置一系列半乳糖-H2O-甲醇溶液作为标准曲线。在 100 °C 的加热块中煮沸 5 分钟。使用 Sunrise Tecan 微孔板读数仪在 440 nm 处测定显色反应的光密度。进行 HPTLC 时，对于经氯仿-甲醇 1:1（v/v）处理的中性脂质，使用氯仿:甲醇:H2O 60:35:8（v/v/v）作为展开溶剂；对于酸性脂质（神经节苷脂），使用异丙醇:己烷:H2O 55:25:20（v/v/v）作为展开溶剂。分离得到的中性糖鞘脂溶解于 200 μl 氯仿:甲醇 1:1（v/v）溶剂中，使用 Drummond Microcaps 点样至 Merck 硅胶薄层色谱板上。将薄层板在氯仿:甲醇:H2O 60:35:8（v/v/v）溶剂系统中展开，随后干燥。使用奥尔cinol-硫酸试剂在 300 °C 下显色以观察糖鞘脂。</li>
	<li>为将中性脂质与酸性脂质分离，可采用小型 DEAE Sephadex A-25 柱进行阴离子交换层析分离。[DEAE Sephadex A25 树脂的制备方法：将 Sephadex A-25 树脂粉末浸泡于氯仿:甲醇:H2O 30:60:8（v/v/v）溶液中过夜，抽吸去除上清液，仅保留 Sephadex A25 树脂。加入新鲜的氯仿:甲醇:H2O 30:60:8（v/v/v）洗涤树脂，重复三次以去除 Sephadex A25 树脂中的负电荷残留物。]</li>
	<li>根据需要，将第 2.1 步获得的脂质溶解于氯仿:甲醇:H2O 30:60:8（v/v/v）中，超声处理（不超过 10 分钟），并重新悬浮。</li>
	<li>使用玻璃棉和一支 9 英寸巴斯德吸管制备小型 DEAE Sephadex A25（Cl 型）柱。小心填充玻璃棉，防止树脂粉末穿过柱体。将 DEAE Sephadex A25（Cl 型）树脂加入 9 英寸巴斯德吸管的“颈部”，过程中避免柱体干燥。确保洗脱液中无树脂颗粒出现。将溶于氯仿:甲醇:H2O 30:60:8（v/v/v）的样品上样。中性脂质组分为穿流组分（flow through fraction）。</li>
	<li>用 8 ml 甲醇中的醋酸钠溶液洗脱酸性脂质组分（与树脂结合的部分）。将中性与酸性组分分别干燥，通过透析去盐，再用 Speedvac 干燥，并通过 HPTLC 进行分析。</li>
</ol>
酸性组分含有神经节苷脂，可直接用于第三步反应的透析。中性组分不仅含有中性鞘糖脂，还含有磷脂（磷脂酰胆碱和鞘磷脂），必须通过乙酰化反应去除。
根据我们的经验，透析盒法比透析管或反相C18柱层析法更高效、更便捷。
<ol start="9">
	<li>下一步是通过乙酰化和全乙酰化反应从神经鞘糖脂中去除磷脂。将DEAE Sephadex A-25穿流组分在Speedvac中（带冷却）干燥4小时。样品干燥后，再次放入Speedvac中继续干燥4小时。确保样品完全干燥，因为残留水分会阻碍全乙酰化反应的进行。</li>
	<li>在避光条件下，用1 ml吡啶和0.5 ml乙酸酐对样品进行全乙酰化处理，室温或37 °C过夜反应。该用量适用于最多200 μg的糖脂。此反应可在37 °C进行，因为糖鞘脂在此温度下溶解性更好。</li>
	<li>将全乙酰化产物用Speedvac干燥3小时，并加入1 ml甲苯共蒸发3次，以确保完全蒸发。若样品仍未完全干燥，继续用Speedvac干燥至完全无残留。</li>
	<li>在巴斯德移液管中，使用玻璃棉和弗罗里硅土（Florisil，Sigma-Aldrich）小柱（30–60目，10×80 mm）。弗罗里硅土颗粒在使用前需在110 °C烘箱中充分干燥。将颗粒填充至巴斯德移液管颈部位置，并用1,2-二氯乙烷-正己烷（4:1, v/v）平衡小柱。</li>
</ol>
从弗罗里硅土柱洗脱的速度非常快。溶剂的快速挥发可能导致色谱柱干涸。因此，应在运行色谱柱前预先配制好所有溶剂混合物，因为在洗脱过程中无法暂停操作。
<ol start="13">
	<li>将全乙酰化样品溶于1 ml 1,2-二氯乙烷-正己烷（4:1, v/v）中上样，用6 ml相同溶剂洗涤层析柱，随后用10 ml 1,2-二氯乙烷冲洗。用6 ml 1,2-二氯乙烷-丙酮（1:1, v/v）洗脱中性全乙酰化糖鞘脂。此步骤可将全乙酰化磷脂与糖鞘脂分离，因为全乙酰化糖鞘脂可结合于弗罗里硅土（Florisil）层析柱，而全乙酰化磷脂则不能。</li>
	<li>使用真空离心浓缩仪（Speedvac）干燥馏分2小时，随后在2 ml甲醇中加入2 ml 0.5 M甲醇钠溶液 [Sigma-Aldrich, 403067]，室温下脱乙酰化反应3小时。</li>
	<li>用3 ml甲醇-乙酸溶液 [乙酸/甲醇 15/85 v/v] 中和反应体系，再次使用Speedvac干燥。通过透析法除盐 [将干燥产物溶于3 ml水中，转移至Slide-A-Lyzer透析盒中，以纯水透析24小时，期间至少更换两次透析液]。将透析后的糖鞘脂（水溶液）用Speedvac干燥至完全无水分。</li>
</ol>
3. 糖鞘脂的化学修饰（完全甲基化）13
<ol>
	<li>将GSLs（1-20 μg）加入带有螺旋盖和聚四氟乙烯衬垫的玻璃试管中，加入二甲基亚砜（150 μl），无需特殊干燥条件或惰性气体环境。</li>
	<li>通过在化学研钵中用研杵研磨氢氧化钠颗粒制备粉末状氢氧化钠（40-60 mg）。确保将粉末储存在极度干燥的环境中，并在通风橱内进行研磨操作，避免吸入粉末。</li>
	<li>接着用刮勺将氢氧化钠粉末加入样品溶液中。使用100微升Halmilton注射器加入碘甲烷（80 μl）[也可使用通过橡胶管连接至注射器的100微升VWR校准移液器]，并在室温下振荡混合物1小时。</li>
	<li>用水（2 ml）终止甲基化反应。通过加入二氯甲烷（2 ml）萃取三次全甲基化产物[糖脂位于二氯甲烷相，即下层相，因此可将上层相转移至新的玻璃试管中，并再次用二氯甲烷萃取]。</li>
	<li>用2 ml水洗涤合并的二氯甲烷提取物三次[上层为水相，可随后弃去]。最后一次洗涤后，将样品转移至新试管中，并使用Speedvac干燥。</li>
	<li>随后可将样品溶解于100至200 μl甲醇中，用于ESI-MS分析。</li>
</ol>
4. 甲基化修饰糖鞘脂的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析
<ol>
	<li>在 MALDI TOF-TOF 质谱仪（Applied Biosystems 4700，Foster City，CA）上进行 MALDI-TOF-MS 和 MALDI-TOF/TOF-MS/MS 实验。通过将等体积的 10 mg/ml 二羟基苯甲酸（DHB）乙腈溶液与 0.1% 三氟乙酸（TFA）水溶液混合，制备基质溶液。</li>
	<li>取 1 μl DHB 基质点样于 MALDI 靶板上，随后点加 1 μl 样品溶液（含 100 ng 糖脂类物质），样品溶于甲醇中。缓慢点样，并在分析前使其自然干燥。</li>
</ol>
5. 离子阱质谱分析完全甲基化糖鞘脂
<ol>
	<li>使用线性离子阱质谱仪（LTQ，ThermoScientific，San Jose，CA）配备纳米电喷雾离子源，在正离子模式下进行质谱分析，流速为0.30 μl/min，毛细管温度为230 °C，碰撞能量设置为30–50%。调整碰撞能量，使前体离子残留丰度最低。所有离子均以钠加合物形式检测。</li>
	<li>通过比较完全甲基化iGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）标准品与甲基化Gb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）标准品在ESI-LIT-MS中产生的钠加合分子离子的MS4产物离子图谱，鉴定Gb3（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）与iGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）同量异位混合物中的iGb3。具体依据为糖链片段m/z 667和末端二糖1-烯离子m/z 445（即 X→667→445→，其中X表示在MS1中检测到的分子离子）的裂解模式差异。</li>
</ol>

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</ol>

DZ 是德克萨斯州休斯顿市 BioTex 公司的顾问，并且是本篇文章中提及技术相关专利（已授权或正在申请中）的发明人。

糖组（glycome）这一术语是类比基因组和蛋白质组而提出的，指的是一个生物体内的所有糖类结构。要全面理解糖基化的多种功能，需要采用整合性方法，包括功能糖组学和结构糖组学的研究。这两方面的研究均面临诸多挑战：糖类生物合成不依赖模板，导致糖类结构极为复杂且多样；糖配体与受体在分子水平上的相互作用常受到糖苷配基结构的影响；此外，低丰度配体在功能上具有重要意义。
目前普遍认为，质谱法（MS）是结构糖组学研究中不可或缺的方法，尤其适用于鉴定和表征低丰度配体。为了将糖链或糖缀合物观测为分子离子，我们通常采用一种高效、低能量的电离方法，称为电喷雾电离（ESI）。为了更详细地表征糖链结构，必须选择特定的分子离子并将其断裂为更小的片段。这一过程通常通过碰撞诱导解离实现，即让糖链离子与惰性气体分子发生碰撞而获得能量。能量升高导致化学键断裂，对产生的碎片进行系统分析可获得糖链分子结构的信息。通常可产生具有“特征性”的碎片离子，这些离子对特定糖链结构特征具有诊断意义。结合分子质量，这些碎片有时足以用于糖链的鉴定；然而在过去，要完全表征糖链结构通常需要更多信息，特别是当结构为新颖结构时。这些方法包括单糖组成分析、部分甲基化醇乙酸酯的气相色谱-质谱分析以确定连接方式，以及特异性糖苷酶消化17。
如过去十年所证明的那样18-19，多次低能量碎裂（可在离子阱质谱仪（IT-MS）中高效进行）可显著提高糖链质谱分析的信息产出。通过进行四到五轮碎裂（其他质谱仪器无法实现），即使在具有相同分子质量（即同重异位素）的组分混合物中，也能够区分含有相同单糖组分但糖连接方式不同的异构糖链。在本分析中，糖链经过衍生化处理，通过完全甲基化将所有游离羟基替换为甲基。尽管在未甲基化的情况下也可进行糖链结构指认，但完全甲基化可提高检测灵敏度17。
Levery 和 Zhou 结合了离子阱质谱（IT-MS）方法学的所有潜在优势，包括利用仅在 MS4 和 MS5 谱图中可观测到的特征性诊断离子来检测异构体结构，从而实现对以多种同重数混合物形式存在的糖鞘脂进行高灵敏度的鉴定与定量7-9。理论上，只要能够化学合成相应的标准品糖脂，我们就有望鉴定出每一种存在的糖脂结构。
该分析的关键步骤是糖鞘脂（GSL）从生物样品中的回收率。通常，可从一亿个肿瘤细胞（如RBL细胞）中回收约80 μg的GSL。为了在离子阱质谱仪中进行多轮碎片化分析并产生足够的分子离子，至少需要10微克的肿瘤细胞GSL。纯化过程中GSL产量过低将导致离子丰度不足，无法进行进一步的碎片化分析。分析的成功与否取决于所回收GSL的量。通常，在使用纳米电喷雾离子源进行分析前，完全甲基化修饰的GSL最终浓度应达到1 mg/ml，并溶解于甲醇中。进行完整MSn分析的检测下限取决于MS1谱图中特定离子的丰度。通常需要达到典型的e7离子丰度，才能完成充分的MS5分析。纯化过程中GSL产量偏低，可能是由于过乙酰化步骤（用于去除磷脂）中GSL的损失所致，此步骤中过乙酰化的GSL必须结合到弗罗里硅土（Florisil）树脂色谱柱上，经过洗涤后再洗脱。为确保过乙酰化GSL与硅胶的良好结合，在样品初次流经色谱柱后，应将样品重新上样两次。

<table><tbody><tr><td>1,2 二氯&amp;#8211;乙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25（Cl型）</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 克</td></tr><tr><td>癸烷（无水）：</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 毫升</td></tr><tr><td>二氯乙酸</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>透析盒</td><td>Fischer(Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer，3500 MWCO，3-12 毫升</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>弗罗里硅土（Florisil）</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>用于填充色谱柱</td></tr><tr><td>己烷</td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>碘甲烷</td><td>Riedel de Haen, Germany</td><td>03810</td><td>用银箔稳定，具有致癌性</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>中性糖鞘脂 Qualmix</td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>单唾液酸神经节苷脂混合物</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>二唾液酸神经节苷脂混合物</td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>乳糖基神经酰胺及唾液酸衍生物</td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>神经节四糖神经酰胺及唾液酸衍生物</td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9英寸</td></tr><tr><td>吡啶：</td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠：</td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 克</td></tr><tr><td>甲醇钠</td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>甲醇中0.5 M溶液</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 升</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9英寸</td></tr><tr><td>玻璃纤维（玻璃棉）</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 玻璃</td></tr><tr><td>12x75 毫米玻璃试管</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>校准移液管（100 微升）</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>16x100 毫米一次性硼硅酸盐试管 ×1,000</td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>带螺旋盖</td></tr><tr><td>玻璃试管盖</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>尺寸/13-415</td></tr><tr><td>Merck 薄层色谱板</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>薄层色谱用玻璃缸</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Drummond 微量毛细管</td><td>Drummond scientific company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l，用于点样薄层色谱样品</td></tr><tr><td>Sunrise 微孔板吸光度读数仪</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 色谱纸</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 厘米 × 34 厘米，用于薄层色谱缸</td></tr><tr><td>间苯二酚-氯化铁喷雾试剂</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>用于在薄层色谱板上检测糖鞘脂</td></tr><tr><td>Prevel 喷雾装置</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪（Speedvac）</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>配备有机溶剂化学捕集阱</td></tr><tr><td>MALDI TOF-TOF 质谱仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>离子阱质谱仪</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

糖鞘脂抗原的质谱分析

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

鞘糖脂（GSL）属于糖缀合物类生物大分子，其结构信息在胚胎发育、信号转导以及免疫受体识别等重要生物学过程中发挥关键作用1-2。鞘糖脂包含以异构体形式存在的复杂糖基部分，以及在脂肪酰链长度、不饱和度和羟基化方面存在差异的脂质部分。其碳水化合物部分和神经酰胺部分均可能具有生物学意义。例如，三己糖神经酰胺包括球形三己糖神经酰胺（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）和异球形三己糖神经酰胺（Galα3Galβ4Glcβ1Cer），二者具有相同的分子质量，但碳水化合物部分的糖苷键连接方式不同，因而发挥完全不同的生物学功能3-4。另一个例子表明，α-半乳糖神经酰胺（一种对不变的自然杀伤T细胞具有强效激动作用的配体）的神经酰胺部分若被修饰，可改变其在癌症和自身免疫疾病动物模型中的细胞因子分泌谱和功能5。在免疫器官和细胞中对异构体进行结构分析的困难，成为阐明许多生物学功能的一大障碍6。
本文介绍了一种可视化的方法，用于对免疫细胞中的鞘糖脂谱进行相对简单、快速且灵敏的分析7-9。该方法基于鞘糖脂的提取和化学修饰（全甲基化，见下文图5A，经全甲基化反应后，己糖的所有羟基均被甲氧基取代）10-15，随后采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）和离子阱质谱进行分析。完成一次完整的分析需要5000万个免疫细胞，实验可在一周内完成。通过与合成标准品比较，可确定各种鞘糖脂的相对丰度。当总iGb3/Gb3混合物含量为2 fmol时，该方法可检测出其中1%的iGb3异构体9。
离子阱质谱可用于分析异构体。例如，要分析同一份样品中是否存在球三糖神经酰胺和异球三糖神经酰胺，可通过糖鞘脂分子的碎片化来实现两者的结构区分（见下文图5）。此外，对糖基部分进行化学修饰（通过完全甲基化反应）可提高电离效率和碎片化效率，从而增强检测的灵敏度和特异性，并提高唾液酸残基的稳定性。糖鞘脂的提取和化学修饰可在标准认证的化学通风橱中完成，质谱分析则可由配备离子阱质谱仪的核心平台完成。

大鼠白血病细胞系RBL（一种向NKT细胞呈递鞘糖脂抗原的抗原呈递细胞）的鞘糖脂MALDI质谱分析示例示于 图3。这些离子可被指派到特定的糖鞘脂结构图3A）。在经NB-DGJ处理的RBL细胞中16，一种抑制糖鞘脂合成的药物，观察到所有糖鞘脂显著减少（图3B）。结构异构体无法被区分。Applied Biosystems 4700 的串联质谱（MS/MS）功能可使一级质谱（MS1）离子碎裂为二级质谱（MS）离子2 片段，从而获得有限的结构信息。然而，MS2分析通常不足以区分寡糖异构体。
糖鞘脂的离子阱质谱分析能够研究异构体，例如在图3A中检测到的三己糖神经酰胺离子形式存在的iGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）和Gb3（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）。为了检测此类异构体，对标准品iGb3和Gb3进行了多轮串联质谱碎裂分析，直至发现差异（图4A和图4B）。在本示例中（图5C），通过与标准iGb3和Gb3比对，可区分iGb3与Gb3。
<img alt="脂质提取与分析示意图；超声、色谱、质谱仪设置流程。" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 糖鞘脂提取流程及糖鞘脂化学修饰（全甲基化）示意图。 采用有机溶剂从细胞中提取糖鞘脂。为去除非糖鞘脂类脂质，可对脂质进行全乙酰化及去乙酰化处理。其次，通过全甲基化反应对糖鞘脂进行化学修饰，以提高质谱检测的灵敏度和特异性。最后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和离子阱质谱（ion trap MS）分析糖鞘脂的谱型。
<img alt="葡萄糖定量；图表；吸光度与浓度；葡萄糖标准曲线；线性回归。" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采用地衣酚硫酸法测定糖鞘脂含量：使用含0.2%地衣酚的50%硫酸溶液及葡萄糖标准曲线对糖鞘脂进行定量分析。
<img alt="质谱分析，神经酰胺水平，糖鞘脂合成抑制，RBL 细胞，NB-DGJ 作用。" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 大鼠白血病细胞的糖鞘脂组学分析。 A. 典型的基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱图；每个离子代表一种特定的糖鞘脂结构，但无法区分结构异构体。B. NB-DGJ 是一种抑制糖鞘脂合成的药物，可显著降低 RBL 细胞中所有糖鞘脂的生成水平。
<img alt="串联质谱图；iGb3 检测、碎片离子、灵敏度结果图" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 糖鞘脂异构体的串联质谱分析。A. 全甲基化 GSL Gb3Cer 和 iGb3Cer 在正离子模式离子阱质谱中的特征性裂解途径。Gb3 和 iGb3 可通过其碎片图谱明确区分。连接方式的差异反映在 MS4 产物离子中，这些离子与同量异位的 m/z 445 前体离子一致。B. 代表性结果显示，可在 iGb3/Gb3 异构体混合物中检测到 iGB3。星号标记仅针对 iGb3 的诊断性离子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="糖脂全甲基化后的质谱结果；正离子电喷雾离子阱串联质谱的离子解离谱图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 离子阱质谱可用于糖鞘脂异构体的分析。 A. 标准品 iGb3 与 Gb3 在离子阱 LTQ 质谱仪中经过四轮碎裂后，其碎裂谱图存在差异。B. 来自 iGb3 或 Gb3 的离子特征性 MS4 谱图。C. 三己糖神经酰胺为 iGb3 与 Gb3 异构体的混合物，可通过离子阱质谱法加以鉴定（图：Dapeng Zhou）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。

本文介绍了一种特异且灵敏的方法，用于深入了解免疫器官和细胞中糖鞘脂抗原的表达谱。该方法利用离子阱质谱技术，通过逐步裂解糖鞘脂分子，并与化学合成的标准品进行比较，实现对分子结构的分析。

糖鞘脂（GSL）属于糖缀合物类生物大分子，其结构信息在重要的生物过程中发挥关键作用……

本实验的总体目标是建立一种特异且灵敏的方法，以深入了解免疫器官和细胞中糖脂类抗原的表达谱。该方法首先从细胞中提取糖脂，第二步是将中性糖脂与酸性糖脂分离开来。在将磷脂从中性脂质中去除后，提取的糖脂通过全甲基化反应进行化学修饰，其中己糖的所有羟基均被甲氧基取代。最终，提取的糖脂通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和离子阱质谱进行分析。该技术相较于现有的分析型高效液相色谱（HPLC）和抗体染色等方法的主要优势在于，质谱具有更高的灵敏度，并能准确测量分子质量。该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如检测低丰度的糖脂抗原。该技术的应用前景涵盖癌症的治疗或诊断，因为许多糖脂抗原（如 GD2 和 globo H）可作为癌症生物标志物表达。我将以 DA pen Zoe 教授实验室的一名本科生身份演示该实验流程。David Hawk 博士将对质谱仪进行操作。在开始此操作之前，使用血细胞计数器对大鼠嗜碱性白血病细胞进行计数。经台盼蓝染色后，细胞活力应高于 95%。首先向细胞中加入六毫升体积比为 1:1 的氯仿-甲醇溶液，以提取脂质。使用混合极性溶剂进行长时间超声处理，持续一至两小时。以异丙醇-正己烷-水按55:25:20的体积比配制的溶剂（按书面实验步骤所述方法制备）作为最终提取液，重复此步骤两次。加入6毫升氯仿和甲醇，然后进行超声处理。超声处理后，以4,000 RPM离心5分钟，使不溶性物质沉淀。在真空浓缩仪中干燥4小时之前，先收集上清液。为了分离中性脂质与酸性脂质，可采用阴离子交换色谱法，使用少量脱乙酰基壳多糖A 20小柱进行分离。按照本视频附带的书面步骤制备 DEAE SEDEX A 25 后，使用玻璃壁和一支 9 英寸的巴氏吸管准备层析柱。小心填充玻璃壁，防止树脂粉末穿过柱体。将 DEAE SEDEX A 25 树脂加入 9 英寸巴氏吸管的颈部，过程中避免柱体变干。确保离心管中无树脂残留。将脂质溶解于氯仿-甲醇-水按30:60:8体积比配制的溶剂中，超声处理并重新悬浮，然后将溶解后的样品加入层析柱。中性脂质将流过层析柱，而带电脂质将保留在柱内。用8毫升含乙酸钠的甲醇溶液洗脱酸性脂质组分。图中所示为经乙酸钠处理后的干燥带负电荷组分。使用Slide-A-Lyzer透析盒对组分进行透析脱盐。透析后，通过真空离心干燥浓缩各组分，再采用高效薄层色谱法（HPTLC）对脂质进行初步分析。为进行HPTLC分析，将分离得到的中性糖鞘脂（GSL）溶解于200微升氯仿-甲醇（1:1，体积比）溶剂中。将样品点样于硅胶薄层色谱板上。待板干燥后，以氯仿-甲醇-水按60:35:8的体积比展开色谱板。使用浓硫酸在300摄氏度下显色，以观察酸性脂质或神经节苷脂等糖脂类物质。采用55:25:20体积比的异丙醇-己烷-水作为溶剂，以相同方式在高效液相色谱中运行。此时，中性组分不仅含有中性糖基化脂质，还含有磷脂，必须通过乙酰化和对乙酰化反应去除。首先，在冷却条件下，将DEAE Sephadex A-25穿透组分在真空浓缩仪中干燥四小时。样品干燥后，将其放回离心机中，再干燥四小时。确保样品完全干燥，因为任何残留水分都会阻碍对乙酰化反应。向样品中加入1毫升吡啶和0.5毫升乙酸酐，用于最多200微克糖基磷脂酰肌醇脂质的对乙酰化反应，在37摄氏度避光孵育过夜。当 GSL 处于较佳温度时，加入一毫升甲苯以确保完全蒸发，并通过真空离心干燥仪干燥提取物三小时。如果样品仍未完全干燥，则继续使用真空离心干燥仪直至完全干燥，此处展示的是已干燥的对乙酰化样品。同时，通过在 110 摄氏度烘箱中孵育，首先将弗洛里硅土颗粒彻底干燥，以制备弗洛里硅土柱。然后用玻璃棉填充巴斯德吸管以制备色谱柱，将填料装填至吸管颈部，并用体积比为4:1的二氯乙烷-己烷洗脱液进行平衡。从弗洛里硅土柱中洗脱的速度非常快。由于溶剂挥发迅速，可能导致色谱柱干裂，因此所有溶剂混合物均应在上柱前预先配制好。由于在洗脱过程中无法停止色谱柱，因此将百分之一的样品溶于1毫升中，并以四比一体积比的二氯乙烷-己烷混合溶剂进行上样。随后用6毫升相同溶剂洗涤色谱柱，再用10毫升二氯乙烷进行洗脱。将中性GSL与六毫升体积比为1:1的1,2-二氯乙烷-丙酮混合。此步骤可去除GSL中的磷脂，因为GSL糖脂会结合到氟罗尔柱上，而磷脂则不会结合。将组分在真空离心浓缩仪中干燥两小时后，加入两毫升0.5摩尔的甲醇钠和两毫升甲醇，在室温下脱乙酰化三小时。孵育后，加入三毫升甲醇和乙酸中和混合物，通过离心浓缩干燥，再通过透析法脱盐：将干燥产物溶解于三毫升水中，注入透析夹（Eliza透析盒），随后对水透析24小时，期间至少更换两次水。透析完成后，使用真空离心浓缩仪将透析后的糖鞘脂（GSL）干燥至完全无水。进行完全甲基化时，首先将糖鞘脂（GSL）加入带有螺旋盖和聚四氟乙烯（Teflon）内衬的玻璃试管中，加入150微升二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide）。无需特殊干燥条件或惰性气体环境，在化学通风橱中，通过研钵和研杵将氢氧化钠颗粒研磨成粉末状氢氧化钠。随后，用刮勺将粉末状氢氧化钠加入样品溶液中。然后使用100微升Hamilton注射器加入80微升甲烷。在甲基化反应中加入2毫升水淬灭后，室温下振荡混合物1小时，再加入2毫升二氯甲烷萃取完全甲基化的产物。糖脂位于二氯甲烷相（下层相），因此可将上层相转移至新的玻璃试管中。然后可用氯甲烷对完全甲基化的产物再次进行萃取，共萃取三次。将合并的二氯甲烷萃取液用2毫升水洗涤三次，每次洗涤后弃去上层水相；最后一次洗涤后，将样品转移至新管中并干燥。使用真空离心浓缩仪干燥后，样品可溶解于100至200微升甲醇中，用于质谱分析。分析按照书面实验步骤进行：样品被送至德克萨斯大学MD安德森癌症中心蛋白质组学平台，分别采用MALDI-TOF-TOF质谱仪和离子阱LTQ质谱仪进行分析。图中显示的是大鼠白血病细胞系 RBL 的糖脂质的基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）分析示例，RBL 是一种抗原呈递细胞，可将糖脂质抗原呈递给 NKT 细胞。这些离子可归属于经药物处理后 RBL 细胞中特定的糖脂质结构，该药物可抑制糖脂质的合成。结果显示，所有糖脂质的含量均显著减少。无法区分结构异构体。所使用的Applied Biosystems 4700质谱仪具备串联质谱（MS/MS）功能，可将一级质谱（MS1）离子碎裂为二级质谱（MS2）碎片，从而获得有限的结构信息。然而，MS2分析通常不足以区分寡糖异构体，而离子阱质谱（ion trap MS）对糖脂类分子的糖指纹（glyco finger lipids）进行分析，能够用于研究寡糖异构体并检测此类异构体。通过多轮碎片化分析标准IGB三和GB三，直至发现差异，如本特征所示。当IGB三和GB三以不同比例混合时，源自IGB三或GB三的离子的MS四级质谱图可用于基于每种异构体产生的特征离子丰度建立标准曲线。在本示例中，可通过与标准品比较来区分IGB三和GB三。该谱图代表了对 1 3 2 5 的质谱四级分析，其中分子离子对应于 IGB three 和 GB three 的特征离子。检测到 IGB three 和 GB three 的特征离子，表明存在这两种异构体的混合物。IGB three 与 GB three 的比例通过与标准曲线比较计算得出。在进行该实验操作时，需特别注意在糖脂进行丙基甲基化之前，应在层析过程中完全回收糖脂。确保在纯化过程中回收至少80微克的糖脂。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过半定量质谱法分析糖脂。您将掌握糖脂提取、分离为中性和酸性组分、通过全甲基化反应进行修饰，以及将修饰后的糖脂送至质谱平台检测等关键步骤。请务必注意，使用1,2-二氯乙烷、氯仿、氯乙酸和碘甲烷时可能具有极高的致癌危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取诸如佩戴手套和实验服等防护措施。遵守安全规则，祝您探索顺利。

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