Name: 提取组织抗原的功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习制备适用于功能性免疫学检测的人体组织提取物的方法。该技术使用BAW混合液进行组织匀浆，并通过冻干去除溶剂，为T细胞增殖和细胞因子分泌检测提供无毒性溶剂的安全抗原来源。

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本工作获得了澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC #559007）、青少年糖尿病研究基金会（JDRF 4-2006-1025）以及维多利亚州政府运营基础设施计划的资助。我们感谢Tom Mandel胰岛移植项目胰岛分离团队成员提供人体组织。人体组织的采集和使用均获得当地伦理批准（St. Vincent's Hospital HREC-A 011/04 和 St. Vincent's Health HREC-A 135/08）。

1. 脾脏组织的制备
<ol>
	<li>注意——所有人体组织均应视为具有潜在传染性，所有操作均须在II级生物安全柜中进行。使用无菌剪刀和镊子去除脾脏组织块（约1-2 cm大小）中的脂肪和纤维组织，并尽可能剪除外层的被膜组织。</li>
	<li>剪取一小段（1-2 cm）3脾组织的组织块，并将每块放入无菌的50 ml Falcon管中。</li>
	<li>将组织块浸入液氮中进行速冻2.</li>
	<li>-20°C 保存80 °C类似的方案适用于其他组织。</li>
</ol>
2. 准备人胰岛用于储存
<ol>
	<li>在CMRL培养基中培养胰岛。将胰岛收集至10 ml锥底试管中，用PBS洗涤两次，每次以1,500 rpm离心5分钟。倒去PBS，并将倒置的试管短暂置于纸巾上以吸除残留缓冲液。注意避免胰岛脱落。</li>
	<li>吸除残留液体后，重新盖紧试管，于液氮中速冻，随后在-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 准备提取物
<ol>
	<li>配制 BAW 混合液（10:30:60 %v/v），并于 4 °C 保存。</li>
	<li>从 -80 °C 取出试管，在室温下解冻。</li>
	<li>加入足量的预冷 BAW 溶液以浸没组织样本。对于胰岛组织，使用 3–5 ml；对于脾脏组织，根据组织块大小使用 10–20 ml。</li>
	<li>组装组织匀浆器。通过“匀浆”10–20 ml 的 70% 乙醇/水溶液进行清洗。</li>
	<li>将匀浆探头插入含有组织和 BAW 溶液的试管中，进行多次短时脉冲匀浆。之后将试管置于冰桶中冷却。</li>
	<li>在处理不同样本之间，需彻底清洗匀浆器：先匀浆 10–20 ml 的 70% 乙醇/水溶液，再用 BAW 缓冲液进行匀浆。此步骤可防止样本间的组织交叉污染。使用后应拆卸并用 70% 乙醇/水溶液清洗。</li>
	<li>若需要仅含可溶性成分的提取物，将匀浆后的组织提取液在室温下以 4,000 rpm 离心 10 分钟。若需要更粗略的提取物，则在室温下以 1,000 rpm 离心 5 分钟。提取 BAW 不溶性蛋白的最合适方法取决于后续的蛋白分析需求。在功能性免疫学检测中，我们建议尝试用 8 M 尿素溶解不溶性组分，因为此前研究发现该条件耐受性良好6。</li>
	<li>将上清液转移至洁净试管中，并置于冰上。</li>
	<li>使用 BCA 法或类似方法测定提取物中的蛋白浓度。</li>
</ol>
4. 冻干提取物
<ol>
	<li>根据所需的蛋白质质量（即, 100 μg 每管），根据需要稀释匀浆液，并分装等量样品至已标记的5.0 ml无菌Falcon（12×75 mm）试管中。我们常使用 100 μg/tube.</li>
	<li>使用18-20号无菌注射器针头在每支试管的管盖上打3个孔。</li>
	<li>将冻存管置于干冰上约10分钟，或放入-80 °C 冷冻机用于 &gt;1 小时。于 -80 °C 直到准备放入冷冻干燥机为止。</li>
	<li>开启冻干机并使其达到平衡（-100 °C。这一步骤大约需要30分钟。</li>
	<li>根据体积大小，冷冻干燥可在3小时内完成，但我们通常将样品放置过夜。</li>
	<li>干燥循环结束后，关闭真空泵，并缓慢向腔室通入压力。取出支架。</li>
	<li>在无菌操作台中，取下试管的穿孔盖，并更换为新的盖子（Falcon 352032）。</li>
	<li>-20 °C 下保存管子20 °C样品可用培养基或其他缓冲液重悬，并用于功能或生化检测。</li>
</ol>
5. 代表性结果
图1显示了加载脾脏和胰岛耗竭的胰腺组织（标记为腺泡）以及纯化的人胰岛（标记为胰岛）提取物的蛋白质凝胶染色结果。结果显示，每种组织中不同分子量的蛋白质均得到了良好呈现。
使用基于CFSE的增殖实验检测了组织提取物刺激人T细胞增殖的能力7（图2）。本实验所用外周血单个核细胞（PBMC）来自一名1型糖尿病患者。反应强度表示为无抗原条件下每5,000个CD4+、CFSEbright细胞中CFSEdim细胞数量与抗原刺激三复孔样本中每5,000个CD4+、CFSEbright细胞中CFSEdim细胞数量的比值7。结果显示，腺泡提取物诱导的增殖反应较弱但可检测（CD1=3.5），而胰岛提取物诱导的反应较强（6.8）。灭活流感病毒（CDI=142.6）作为阳性对照包含在实验中。
<img alt="显示脾脏、腺泡和胰岛样本蛋白质条带的SDS-PAGE凝胶电泳。" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 蛋白质凝胶。 
<img alt="流式细胞术分析，CFSE 与 CD4 Alexa Fluor 647 图表，比较样本中的抗原反应。" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 针对腺泡和胰岛提取物的基于 CFSE 的增殖实验结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本方案的开发旨在制备不含去垢剂等有毒化学物质的人体组织提取物。具体而言，我们已应用该方法制备可用于人体免疫功能检测的人体组织提取物。 体外采用本方案制备的提取物可用任意缓冲液重新溶解，并适用于多种生物化学分析，如蛋白质印迹或液相色谱。这使得该技术可广泛应用于多种后续实验。
	采用我们的方案，对组织提取物的反应较弱。这是预料之中的，因为我们正在寻找针对“自身”抗原的反应；在本研究中，针对胰岛抗原的T细胞反应通常较弱1。此前我们发现，使用基于CFSE的增殖实验可检测到人CD4+ T细胞对重组前胰岛素和谷氨酸脱羧酶（GAD）的反应，这两种抗原是1型糖尿病的自身抗原7,8。我们选择使用组织提取物，以避免使用合成肽9和重组蛋白10时可能遇到的问题。
	我们通常不在提取过程中添加蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的存在可能会抑制抗原的加工和提呈11，从而抑制T细胞反应。相反，我们会在冰上进行提取，以...

<table><tbody><tr><td>5 ml 12 x 75 mm 无菌聚苯乙烯管</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯管盖（上图）</td><td>BD Falcon</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 无菌管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>马林克罗特化学公司</td><td>2856-10</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>537993-IL</td><td></td></tr><tr><td>均质器：PRO200 </td><td>生物策略</td><td>01-01200</td><td>10 x 115 毫米锯齿形发生器</td></tr><tr><td>冻干机 </td><td></td><td></td><td>Virtis，台式 4K</td></tr><tr><td>无菌针头 18-20 号 </td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302032</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066培养基 </td><td>Sigma</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>PBS </td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1. &lt;/strong&gt; 特定试剂与设备&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

组织抗原提取用于功能分析

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

许多适应性免疫应答中由B细胞和T细胞识别的抗原靶点尚未被明确1。这一情况在自身免疫性疾病和癌症中尤为突出2。我们的目标是研究人类T细胞在1型糖尿病这一自身免疫性疾病中所识别的抗原1,3,4,5。为了分析人类T细胞对那些尚未明确T细胞识别抗原的组织所产生的免疫应答，我们开发了一种从人体组织中提取蛋白质抗原的方法，所获得的抗原形式可直接用于功能性检测6。以往，由于提取方法所得裂解物中含有对人外周血单个核细胞具有毒性的去垢剂，因此无法检测T细胞对未纯化组织提取物的应答。本文描述了一种提取人体组织蛋白的方法，所得产物对人T细胞无毒性。该方法将组织在正丁醇、乙腈和水（BAW）的混合液中进行匀浆。测定组织提取物中的蛋白质浓度后，将已知质量的蛋白质分装至各管中。提取后，通过冷冻干燥去除有机溶剂。冻干后的组织提取物可长期保存，待需要时使用。在免疫功能检测中，可将免疫细胞悬液直接加入冻干提取物中，使用适当培养基进行培养。采用本方法制备的提取物，可轻松检测外周血单个核细胞的细胞因子产生和增殖反应。因此，本方法可快速制备适用于T细胞应答分析中抗原来源的人体组织裂解物。我们建议，该方法将有助于在器官移植、癌症和自身免疫等研究中分析适应性免疫应答对组织的识别。

一种用于制备人组织提取物的简单方案被描述，该提取物可作为功能性T细胞检测中抗原的来源。该方法可用于检测T细胞对组织来源抗原的反应。 体外.

适应性免疫反应中由B细胞和T细胞识别的许多抗原靶标尚未明确1。这一情况在自身免疫性疾病中尤为突出……

本实验的总体目标是制备适用于功能性免疫学检测的组织提取物。首先采集目标组织样本，随后将组织样本在正丁醇、丙酮、乙腈与水的混合液（即 BAW）中进行匀浆处理，即可实现该目标。确定蛋白质浓度后，将提取物进行分装并冻干以去除溶剂。最终，将重新溶解的提取物用作人T细胞增殖或细胞因子分泌实验中的抗原来源。与去垢剂裂解等现有方法相比，该技术的主要优势在于所得提取物不含毒性溶剂和去垢剂。在本方案中，所有人体材料均应被视为具有潜在感染性，所有操作均应在二级层流柜中进行。使用无菌剪刀和镊子，从大小约为一至二厘米的脾组织样本中去除脂肪和纤维组织。尽可能修剪掉外层的被膜组织。切取少量脾脏组织，将每块组织放入无菌的50毫升Falcon管中。将组织块浸入液氮中速冻，随后于-80摄氏度保存。开始进行人眼片制备以用于储存培养的实验操作。将CMRL培养基中的小块组织在37摄氏度下孵育。用10毫升圆底试管以1,500 RPM离心5分钟收集小块组织。弃去上清液，并用PBS洗涤两次，第二次洗涤后保留沉淀。倒掉 PBS，并将离心管倒置在纸巾上片刻以吸除残留缓冲液。注意不要使眼状结构脱落。排净液体后，盖上管盖，立即在液氮中速冻，然后于 -80 摄氏度保存。为制备组织提取物，首先将装有组织的离心管从零下80摄氏度取出，置于室温下。组织将在预先配制并保存在4摄氏度的正丁醇、乙腈和水的混合液（BAW）中进行匀浆。加入足量的冰冻BAW以浸没组织；本演示中所用的脾脏组织，使用10至20毫升BAW。组装组织匀浆器。用20毫升70%乙醇水溶液进行匀浆以清洁匀浆器。随后将匀浆器探头放入含有组织和BAW溶液的离心管中，通过多次短时脉冲匀浆处理组织样品。此后将试管放入干净的容器中，以防止样品间组织交叉污染。每次处理不同样品之间，需用10至20毫升70%的乙醇水溶液进行匀浆清洗，随后用BAW缓冲液离心，彻底清洁匀浆器。将匀浆后的组织提取物置于室温下。如果需要仅含可溶性物质的提取物，则以 4,000 RPM 离心 10 分钟。如果需要更粗略的提取物，则在离心后以 1000 RPM 离心 5 分钟，将上清液转移至洁净离心管中，并置于冰上。随后使用 BCA 或类似方法测定提取物中的蛋白质浓度。本方案中最重要的步骤是准确测定提取物中的蛋白质浓度，以便确定需要冻干的提取物体积。为获得所需的蛋白质质量，首先根据所需大量蛋白质的量稀释匀浆液，并将等分试样分装至已标记的5毫升无菌管中。在本示例中，每管分配100微克蛋白质。使用18至20号无菌针头在每支试管的管盖上打三个孔，将试管置于干冰上约10分钟使其冷冻。开启冷冻干燥机，使其平衡至零下100摄氏度，此过程约需30分钟。当冷冻干燥机准备就绪后，将试管放入其中，并启动真空泵。根据提取物体积的大小，冷冻干燥可在三小时内完成。尽管通常会将样品过夜放置。干燥循环结束后，关闭真空泵，并缓慢使空气进入腔室。在无菌操作台中取出试管架。取下试管的穿孔盖，并更换为新盖。将试管在-20摄氏度条件下保存。随后可将样品重新悬浮于培养基或其他缓冲液中，并用于生化检测。该图显示了加载脾脏眼状体耗竭的胰腺组织提取物以及纯化的人眼状体提取物的蛋白质凝胶染色结果。这些结果展示了每种组织中不同分子量蛋白质的良好呈现。通过增殖实验检测了asana和胰岛提取物刺激人T细胞增殖的能力，在该实验中，外周血单个核细胞（PBMC）用荧光染料CFSE标记，响应抗原而发生增殖的细胞其CFSE荧光强度降低，通过流式细胞术直接测定。本示例中使用的外周血单个核细胞（PBMC）来自一名1型糖尿病患者。C细胞反应的强度表示为：在无抗原条件下，每5,000个CFSE亮染的CD4阳性细胞中CFSE暗染细胞的数量，与在有抗原条件下三份重复样本中相应数量的比值。结果显示，针对Asana抗原刺激，细胞增殖反应较弱但可检测，细胞分裂指数（CDI）为3.5。与包含灭活流感病毒（作为阳性对照，CDI为6.8）的眼孔提取物相比，反应更强。按照此步骤操作后，还可使用其他方法，如Ali Spot或e Iza，以回答更多问题，例如在组织来源抗原刺激下会分泌哪些细胞因子。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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