测量抗体乳鼠心肌细胞对细胞功能的影响
March 8th, 2013
所提出的方法提供了一种方法扩张型心肌病的患者血浆中的检测功能有效的心性自体抗体，不论特异性抗原，通过分析隔离病人免疫球蛋白对大鼠离体心肌细胞的缩短及细胞内钙瞬变的影响。
以下实验的总体目标是检测扩张型心肌病或其他具有自身免疫背景的心脏病患者血浆中的嗜心脏抗体。这是通过在抗 IgG 球状柱上对患者血浆进行初始小免疫吸收来实现的，以纯化免疫球蛋白 G，作为第二步。从成年 wistar 大鼠中分离出心室心肌细胞，为该生物测定提供细胞基础。
接下来，让心肌细胞附着在腔室盖玻片上并在上午 2：00 用 URA 染色，以便能够观察收缩期间的细胞内钙瞬变，然后测试患者的 IgG 以观察其对心肌细胞收缩力的影响。结果根据离体心肌细胞的收缩性和钙瞬变的变化来证明患者的 IgG 是否含有热带抗体。与用于检测抗体的标准免疫测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它独立于特异性抗原，并且可以区分刺激和阻断抗体。
演示该程序将 bera Google 并体验我们实验室的技术援助。要开始此程序，通过将每 2 毫升患者 EDTA 血浆中 3 毫升抗 IgG 球体填充到空的 econopak 柱中来制备微型免疫吸收柱。接下来，在抗 IgG 球体顶部放置过滤器。
切开色谱柱的下端并按下过滤器，以达到大约每秒 1 滴的流速。然后用 1 体积的 0.9% 氯化钠血浆洗涤色谱柱 3 次，当血浆完全浸入用相同体积的 0.9% 氯化钠洗涤的抗 IgG Spheros 洗涤液中时，将色谱柱中的血浆移液。接下来，在色谱柱中吸取一个血浆体积的 0.2 mol 甘氨酸盐酸盐，pH 值为 2.8，并使其浸入 phos 中。
然后向色谱柱中加入另一体积的盐酸甘氨酸。将流速收集在 15 mL试管中，并在 pH 值为 8.0 的情况下用 0.5 摩尔 tris hydrochloride 将 pH 值调节至 7.3，以再生色谱柱。用两体积的 0.9% 氯化钠进行最后一次洗涤后，用三种血浆体积的盐酸甘氨酸洗涤。
该色谱柱可用于下一个血浆样品，用于心肌细胞。收集的 IgG 组分必须用实验缓冲液进行透析，方法是首先将 IgG 组分填充到纤维素酯透析膜管中，截留分子量为 100 道尔顿。然后将试管放入 1 升 EB 中，在 4 摄氏度下用磁力搅拌缓慢搅拌 8 小时后，将透析管转移到 3 升新鲜 EB 中，并在透析后在 4 摄氏度下再透析 20 小时。
将样品在 57 摄氏度下在水浴中煮沸 30 分钟。要灭活补体因子，请测定总 IgG 浓度并制备等分试样，每个等分试样含有 330 μg IgG。在此过程中，根据随附的手稿制备无钙分离缓冲液。
然后在恒温器鼻腔灌注系统的上部储液器中填充 80 毫升 IB，将缓冲液保持在 37 摄氏度，并用 95% 氧气、5% 二氧化碳充气 30 分钟。在 20 毫升中溶解大约 7， 000 至 10， 000 单位的 2 型胶原酶和 174 毫克不含脂肪酸的 BSA。IB 中含有 112.5 微摩尔氯化钙，并根据需要调整上部储液槽中分离缓冲液的 pH 值。
接下来，使用每公斤 375 微克的硫喷妥钠麻醉 175 至 200 克的 wistar 大鼠，并在硫喷妥钠溶液中加入 2， 500 IU 肝素。开胸手术后，用完整的主动脉弓小心地切除心脏，并将其转移到冰冷的、零点百分比的氯化钠中。从心脏中取出血液和周围组织。
然后将其转移到新鲜的 0.9% 氯化钠中并暴露主动脉。打开 langor 系统的减流器，以获得每秒 2 到 3 的下降速度。然后将心脏连接到套管上。
以每秒 1 滴的流速灌注最多三分钟，以洗掉剩余的血液。之后，在 LOR 系统中循环 IB。现在从上储液槽中取出 20 毫升缓冲液。
用胶原酶溶液填充储液槽，并根据需要重新填充缓冲液以达到 80 毫升。然后将消化液再循环 27 分钟。接下来，将心脏从套管上分离。
切除心房和主动脉，然后将心室切成小块。让消化缓冲液流入下部储液槽。将体积减少到最大 40 毫升，以便在 95% 氧气、5% 二氧化碳的持续充气下进一步消化切碎的心室 10 至 15 分钟。
然后，通过 200 微米网孔大小的纱布将细胞悬液过滤到 50 毫升试管中。最后，将细胞悬液以 40 3G 离心 2 分钟，恢复细胞的钙含量。在室温下，将细胞重悬于 10 毫升中。
含有 200 微摩尔氯化钙的 IB 再次离心，并将细胞重悬于 10 毫升中。IB 含 500 微摩尔氯化钙。最后离心后，复苏，将心肌细胞悬浮在无菌过滤的 EB 中，密度为每毫升 50， 000 个细胞。
在四孔室中涂覆盖玻片，每孔 10 微克层粘连蛋白，然后等待其完全干燥。然后将 1 毫升心肌细胞悬液填充到每个孔中。使用带有切割尖端的微量移液器，让细胞在室温下粘附 1 小时，将 10 微升 1 毫克/毫升 fira 2：00 AM 储备液稀释为 5 毫升 eb，并将染色溶液置于黑暗中。
接下来，从盖玻片中取出缓冲液和未附着的细胞，吸取 0.5 毫升染色溶液。在每种容器中，将细胞在适度摇动下孵育 10 分钟。随后，去除染色溶液并用 1 ml eb 洗涤细胞一次。
然后在此过程中向每个孔中加入 0.5 毫升 EB，将盖玻片置于连接到肌细胞钙和收缩力记录系统的逆荧光显微镜下。在第一口井和超级孔中放置带有 influx 和 influx 管的定制电极。以每分钟 1 毫升 eb 熔合心肌细胞。
以 20 伏特、1 赫兹和 5 毫秒的持续时间开始电刺激，并让细胞适应刺激约两分钟。选择横纹清晰且持续收缩的完整杆状心肌细胞，并将其放置在视野中心。然后打开相机通道，通过旋转细胞取景适配器并移动显微镜载物台，在视频区域内水平定位细胞。
调整视频区域的检测控制元素的边界。打开荧光通道并记录 10 到 15 次收缩，以获得初始细胞缩短和钙瞬变。之后，关闭显微镜光通道以避免荧光染色剂漂白。
使用三通阀将流向从 EB 切换到样品旁路，并将心肌细胞与 1 mL 患者 IgG 超级融合。在空气到达之前停止泵，打开光通道并记录另外 10 到 15 次收缩以获得急性细胞反应。然后暂停记录并再次关闭光通道，两分钟和五分钟后重复记录，并在结束时将电极从孔中取出，使用离子向导软件分别使用边长斜杠长度和 URA 两个数字减去斜杠比窗口分析细胞缩短和钙瞬变。
接下来，计算初始细胞缩短和钙瞬时峰高的急性、2 分钟和 5 分钟响应的百分比变化。以下是控制测量的代表性示例。在用 IgG 超级输注之前在线监测细胞缩短和钙瞬变，并在 IgG 超级输注后 2 分钟和 5 分钟立即监测。
以下是测量含有心脏抑郁抗体的 IgG 样品的示例。在用 IgG 进行过血之前在线测量细胞缩短和钙瞬变，并在用 IgG 进行过血后 2 分钟和 5 分钟立即测量。看完这个视频，你应该对如何通过测量分离的 IgG 对分离的成人红心肌细胞钙瞬变中细胞缩短的影响来检测患者血浆中的心脏运输抗体。
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概述
本研究提出了一种检测扩张型心肌病患者中功能性有效的心肌特异性自身抗体的方法。该技术分析了患者分离的免疫球蛋白对分离的大鼠心肌细胞收缩和细胞内钙瞬变的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏病学
- 免疫学
- 细胞生物学
背景
- 扩张型心肌病与自身免疫反应有关。
- 检测心肌特异性抗体对于理解心脏疾病至关重要。
- 现有的方法通常依赖于特定抗原。
- 需要能够区分刺激性和阻断性抗体的技术。
研究目的
- 检测患者血浆中的心肌特异性抗体。
- 评估患者IgG对心肌细胞收缩性的影响。
- 提供一种独立于特定抗原的方法。
使用的方法
- 在抗IgG球状柱上对患者血浆进行小型免疫吸附。
- 从成年Wistar大鼠中分离心室心肌细胞。
- 染色心肌细胞以观察细胞内钙瞬变。
- 评估患者IgG对心肌细胞收缩性的影响。
主要结果
- 收缩性和钙瞬变的变化表明存在特异性抗体。
- 该方法成功地区分了不同类型的抗体。
- 结果表明该技术优于标准免疫分析。
- 研究结果有助于理解心脏疾病中的自身免疫机制。
结论
- 所提出的方法是检测心肌特异性抗体的可靠方法。
- 它增强了研究扩张型心肌病中自身免疫反应的能力。
- 该技术可能改善心脏病学的诊断能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to detect functionally active cardiotropic antibodies in patient plasma without requiring prior antigen identification, addressing a key gap in autoimmune heart disease research. By measuring effects on cardiomyocyte contractility and calcium transients, it provides a functional readout that distinguishes stimulating from blocking autoantibodies, supporting target de-risking in early discovery. The antigen-independent approach enhances predictive confidence for therapeutic intervention strategies in dilated cardiomyopathy and related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting autoantibodies that directly modulate cardiomyocyte function.
- Operational Value: Provides a functional assay system independent of known antigens, expanding target space for autoimmune cardiology.
- Predictive Value: Discriminates between stimulating and blocking antibody effects, improving confidence in mechanism-based target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, real-time readouts of cell shortening and calcium transients for compound or antibody screening.
- Reproducibility: Standardized isolation and staining protocols support consistent cellular responses across experiments.
- Platform Utility: Establishes a reusable bioassay for evaluating immunomodulatory candidates in cardiovascular disease models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses adult rat cardiomyocytes with high homology to human cardiac proteins, enhancing translational potential.
- Mechanistic De-risking: Links autoantibody presence to functional cellular outcomes, supporting causal inference in disease models.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of antibody effects on contractility and calcium handling in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immunological insights that inform preclinical candidate selection in cardiovascular autoimmune research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking patient-derived IgG to measurable changes in cardiomyocyte physiology.
- Screening: Delivers quantitative, real-time measurements of contractility and calcium flux for evaluating immunomodulatory effects.
- Analytics: Enables statistical comparison of acute and time-dependent responses to IgG superfusion, supporting dose-response and kinetic profiling.
- Translational Research: Utilizes a disease-relevant cellular system with cross-species antigen homology, facilitating extrapolation to human pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for screening immunomodulatory compounds or biologics in cardiovascular autoimmune contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into autoantibody-mediated cardiomyocyte dysfunction, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible functional readouts that minimize assay variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying functionally active autoantibodies early, reducing late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of targets based on antibody-mediated functional effects in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiomyocyte isolation, calcium imaging, and contractility monitoring systems.
- Dependent on Langendorff perfusion equipment, fluorescent microscopy, and ion/wizard-based analysis software.
- Necessitates cross-team standardization for IgG purification, cell preparation, and stimulation protocols.
- Adaptation to other model systems may require validation of antigen homology and cellular responsiveness.
- Practical limitations include tissue access, cell viability windows, and the need for specialized perfusion and imaging infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
IgG Isolation from Patient Samples
4:39
Isolation of Rat Cardiomyocytes
8:27
Fura-2 Staining of Cardiomyocytes
9:43
Recording of Cell Shortening and Ca2+ Transients
12:24
Results: The Measurement of an IgG Sample Containing Cardiodepressive Antibodies
13:15
Conclusion
