抗体对分离心肌细胞功能影响的测定

以下实验的总体目标是检测扩张型心肌病或其他具有自身免疫背景的心脏疾病患者血浆中的嗜心性抗体。该检测首先通过抗 IgG 球形柱对患者血浆进行初步的小型免疫吸附，以纯化免疫球蛋白 G；第二步，从成年 Wistar 大鼠中分离心室心肌细胞，为本生物测定提供细胞基础。

接下来，让心肌细胞贴附于培养皿盖玻片上，并用URA 2:00 AM染色，以实现对收缩过程中细胞内钙瞬变的观察；随后检测患者IgG对其心肌细胞收缩力的影响。实验结果可根据分离的心肌细胞收缩力及钙瞬变的变化，判断患者IgG是否含有具有激动作用的抗体。该技术相较于现有的标准免疫测定等抗体检测方法的主要优势在于，其不依赖于特定抗原，且能够区分激动性抗体与阻断性抗体。

该实验步骤将由 bera Google 演示，并由我们的实验室提供技术支持。开始此操作前，通过将三毫升抗 IgG Spheros 与两毫升患者 EDTA 血浆加入空的 EconoPak 柱中，制备微型免疫吸附柱。接下来，在抗 IgG Spheros 上方放置一个滤膜。

剪开柱子的下端尖部，压紧滤膜，使流速达到每秒约一滴。然后用一个血浆体积的0.9%氯化钠溶液洗涤柱子三次。当血浆完全渗入抗IgG Spheros后，将血浆移入柱中，并用相同体积的0.9%氯化钠溶液洗涤。接着，向柱中加入一个血浆体积的pH 2.8的0.2摩尔甘氨酸盐酸溶液，使其渗入柱中。

然后向柱中加入等体积的盐酸甘氨酸。用15毫升离心管收集流出液，并用0.5摩尔的盐酸三羟甲基氨基甲烷（pH 8.0）调节pH至7.3，以再生层析柱。最后用两倍柱体积的0.9%氯化钠溶液冲洗后，再用三倍血浆体积的盐酸甘氨酸洗涤柱体。

该层析柱可用于下一个血浆样本，以用于心肌细胞实验。收集的IgG组分需通过实验缓冲液进行透析：首先将IgG组分装入截留分子量为100千道尔顿的纤维素酯透析膜管中。然后将透析管放入1升实验缓冲液（EB）中，在4°C下用磁力搅拌器缓慢搅拌8小时。之后，将透析管转移至3升新鲜EB中，在4°C下继续透析20小时。

将样品置于水浴中，在 57 摄氏度下煮沸 30 分钟。为灭活补体因子，测定总 IgG 浓度，并分装成每份含 330 微克 IgG 的等分试样。在此步骤中，根据随附的文稿配制无钙分离缓冲液。

然后在恒温兰诺灌注系统的上部储液槽中加入80毫升IB缓冲液，将缓冲液温度维持在37摄氏度，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气30分钟。将约7,000至10,000单位的II型胶原酶和174毫克无脂肪酸BSA溶解于20毫升IB缓冲液中，其中含有112.5微摩尔氯化钙；如有需要，调节上部储液槽中分离缓冲液的pH值。

接下来，使用硫喷妥钠（375 微克/千克）对一只 175 至 200 克的 Wistar 大鼠进行麻醉，并在硫喷妥钠溶液中加入 2,500 IU 肝素。开胸后，小心切除带有完整主动脉弓的心脏，并将其转移至冰冻的 0.0% 氯化钠溶液中。从心脏中清除血液及周围组织。

然后将其转移至新鲜的0.9%氯化钠溶液中，暴露主动脉。打开朗格多夫装置的流速调节器，使液滴速度达到每秒两到三滴。随后将心脏连接至套管。

以每秒一滴的流速灌注最多三分钟，以冲洗残留的血液。随后，在LOR系统中循环IB。现在从上部储液槽中移除20毫升缓冲液。

向储液器中加入胶原酶溶液，并补充所需量的缓冲液至总体积达到80毫升。然后继续循环消化液27分钟。接下来，将心脏从套管上分离。

去除心房和主动脉，然后将心室切成小块。让消化缓冲液流入下方储液槽。将体积减少至最多40毫升，持续通入95%氧气和5%二氧化碳，在此条件下进一步消化切碎的心室组织10至15分钟。

随后，将细胞悬液通过孔径为200微米的滤网过滤至50毫升离心管中。最后，以40 ×g在室温下离心两分钟，以恢复细胞的钙含量。在室温下，用10毫升溶液重新悬浮细胞。

加入含200微摩尔氯化钙的IB缓冲液，再次离心，并用10毫升IB缓冲液重悬细胞。使用含500微摩尔氯化钙的IB缓冲液。经过最后一次离心后，将心肌细胞重悬于无菌过滤的EB缓冲液中，细胞密度为每毫升50,000个细胞。

在四孔板的盖玻片上每孔加入10微克层粘连蛋白，待其完全干燥。然后每孔加入1毫升心肌细胞悬液。使用剪去尖端的微量移液器，让细胞在室温下贴壁1小时。将10微升浓度为1毫克/毫升的Fura-2 AM储存液用5毫升EB稀释，并将染色液避光保存。

接下来，移除缓冲液和未贴壁的细胞，用移液器向每张盖玻片加入0.5毫升染色液。在每个孔中，于轻度振荡条件下孵育细胞10分钟。随后，移除染色液，并用1毫升EB洗涤细胞一次。

然后在此步骤中向每个孔加入 0.5 毫升 EB，将盖玻片置于连接心肌细胞钙离子和收缩力记录系统的倒置荧光显微镜下。将自制电极连同进液管和出液管置于第一孔中并进行灌流。以每分钟 1 毫升 EB 的速度融合心肌细胞。

以20伏特、1赫兹、每次脉冲持续5毫秒的参数开始电刺激，使细胞适应刺激约2分钟。选择一个具有清晰横纹和稳定收缩的完整杆状心肌细胞，并将其置于视野中央。然后打开相机通道，通过旋转细胞固定装置并移动显微镜载物台，将细胞在视频区域内水平定向。

调整视频区域检测控制元件的边界。打开荧光通道，记录10到15次收缩，以获取初始的细胞缩短和钙瞬变数据。随后，关闭显微镜光源通道，以避免荧光染料发生漂白。

通过三通阀将灌流液从 EB 切换至样品旁路，并用一毫升患者 IgG 融合并刺激心肌细胞。在气泡到达细胞前立即停止泵流，打开光通道并继续记录 10 到 15 次收缩，以获取细胞的急性反应。随后暂停记录并再次关闭光通道，分别在两分钟和五分钟时重复记录，实验结束后将电极从孔中取出，使用 IonWizard 软件分别通过边缘长度/长度窗口和 URA2 数值相减/比值窗口分析细胞缩短和钙瞬变。

接下来，计算急性反应、两分钟和五分钟反应相对于初始细胞缩短和钙瞬变峰值高度的百分比变化。以下是对照测量的一个代表性示例：在IgG灌流之前以及IgG灌流后立即、两分钟和五分钟时，实时监测细胞缩短和钙瞬变情况。

以下是一个含有心肌抑制性抗体的IgG样本检测实例。在IgG灌流之前，以及IgG灌流后立即、两分钟和五分钟时，实时测量了细胞缩短和钙瞬变。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过检测分离的IgG对分离的成年大鼠心肌细胞的细胞缩短和钙瞬变的影响，来测定患者血浆中的心肌抑制性抗体。