从病人的血液样本可行的循环肿瘤细胞的快速分离

癌症患者的血液循环肿瘤细胞的分离，而造成细胞损伤。肿瘤细胞的分离，实现使用的E-选择双分子表面，除了对上皮标记的抗体。碳纳米管涂层，特别是促进癌细胞粘附造成捕获纯度高。

该程序的总体目标是从血液样本中分离活的循环肿瘤细胞。首先制备分离微管，然后从血液样品中分离血沉棕黄层。接下来，通过功能化的微管装置加工 Buffy 涂层。

从微管中收获捕获的细胞，并使用生理模拟场所的设备维持培养，以生物模拟方式捕获流动的 CTC，而不会造成细胞损伤。该技术在临床环境中提供了开发个性化癌症疗法的功能。主要优点是这是一种使用常用材料的简单技术，它再现了血管中发生的自然实体组织过程。

我是康奈尔大学生物医学工程副教授 Mike King，我实验室的高级技术人员 Jeff Madison 将演示该程序。以下方案用于生产单个微管装置，对 250 微升 6.6%Halo 位点纳米管溶液进行超声处理。用冷水调用溶液 30 秒。

第二次超声处理后，将溶液吸入注射器中。通过 0.45 微米注射器过滤器将溶液过滤到干净的微型垃圾管涡旋中。halo site 纳米管解决方案定期进行

为了保持均匀性，请获得一段 50 厘米长的 micro rehan 微管。在对角线上切开微管入口，将微管的一端插入一个小的 IDEXX 适配器中，然后将注射器针头插入微管的另一端。要清洁微管，请将微管的开口端放入 70% 乙醇中，然后将约 50 微升乙醇吸入注射器中以填充微管，以冲洗掉微管中的乙醇。

大量蒸馏水吸入注射器中。现在从微管上拆下注射器，清空注射器，然后重新连接到微管上。每体积抽取 50 微升 0.02 重量。

多元醇赖氨酸放入微量管中，在室温下孵育 5 分钟。然后将 100 μL 过滤的纳米管溶液吸入微管中，并在室温下孵育 3 分钟。要冲洗纳米管溶液，请通过微管吸取 100 微升水并在室温下孵育过夜，通过微管吸取 50 微升 PBS，然后吸取 50 微升/毫升 10 微克。

Protein G 溶液在室温下平衡 90 分钟。接下来，将 50 μL 每毫升 5 μg、E 选择素 IgG 和 50 μg/mL 抗体溶液吸入微量管中。在室温下孵育 2 小时，用 5% 牛奶蛋白阻断非特异性细胞粘附。

然后在室温下孵育 PBS，直到血液或血沉棕黄层样品准备好处理 10 分钟，然后再使用微管进行细胞分离。抽取 50 微升钙饱和 PBS 以激活肝素化管中的选择素分子。从患者身上采集 10 毫升血液样本用于淋巴细胞分离。

将 10 mLfol Packs 溶液放入 50 mL离心管中。将 10 mL 全血样品以 2000 倍 G 的速度轻轻覆盖，在 4 摄氏度下离心 15 分钟，且减速度最小。接下来，将血沉棕黄层转移到新管中。

用 PBS 清洗血沉棕黄层并离心以放置红细胞。将细胞沉淀轻轻重悬于 1 mL RBC 裂解液、缓冲液中，并在室温下孵育 10 分钟。然后加入 10 毫升。

PBS 轻轻混合并通过离心对细胞进行上颚。使用 IDEXX 接头将细胞轻轻重悬于 PBS plus 中。将功能化微管的一端连接到 5 毫升注射器上。

将注射器插入注射泵，将功能化微管的开口端浸入细胞预防装置中。通过微管处理细胞悬液，以去除未结合和松散结合的细胞。将微管的开口端转移到含有 PBS plus 的试管中。

将 300 微升 PBS plus 吸入注射器中。接下来，将微管的开口端放入干净的管中。断开注射器与微管的连接，并连接一个装有 acuate 的注射器，轻轻灌注 acuate 以填充微管。

在室温下孵育 10 分钟后，连接含有 1 毫升生长培养基的注射器，灌注微量管并将流出物收集到适当的组织中。培养板继续进行培养。5 天后，从一名乳腺癌患者和一名肺癌患者的血液样本中分离出分离的循环肿瘤细胞。

在文化中。根据上皮细胞分子 epican 的染色对这些制剂进行 CTC 捕获的表征，并且细胞核捕获纯度计算为被鉴定为 CT C 的细胞与捕获细胞总数的百分比。该图显示了从供体 A 和 B 中分离的 CTC 的代表性显微照片，培养 5 天后，用 Alexa Fluor 4 88 对细胞进行 EPAM 荧光染色。

通过 DPI 染色观察细胞核。按照此程序，可以使用活的 CTC 和培养物来获取患者特异性信息，例如药物敏感性或细胞标志物表达。感谢您的观看，祝您好运。