Name: 粒细胞相关的自身抗体引起的皮肤起泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 了解通过被动转移抗VII型胶原抗体在小鼠中诱导皮肤起泡的方法，用于研究获得性大疱性表皮松解症的发病机制。该模型可重现人类EBA的临床和组织病理学特征，为自身免疫性皮肤病研究提供重要工具。

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作者感谢来自德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1）以及弗莱堡大学医学院BIOSS项目的资助（资助对象：CS）。

1. 致病性抗体的制备
注意：抗体的纯化和浓缩应在同一天内完成，因为抗体不能在0.1 M甘氨酸pH 2.5-3（洗脱缓冲液）中过夜（ON）保存。
IgG 的亲和纯化：使用 25 ml 免疫兔血清：
<ol>
 <li>在4 °C条件下过夜解冻兔血清，按1:1比例加入1×PBS（运行缓冲液），在20 °C下以1260 × g离心10分钟。若血清含脂肪较多，离心后可选择使用滤纸进行过滤。</li>
 <li>同时，用10倍柱床体积（柱床体积 = 填料体积）的1×PBS（运行缓冲液）清洗蛋白G填料柱。</li>
 <li>将稀释并过滤后的血清上样至柱中，在室温（RT）下于摇床上孵育1小时。</li>
 <li>用50 ml Falcon管收集穿流液（FT）。在确定纯化后的IgG浓度和效价之前，请勿丢弃该穿流液。</li>
 <li>用5倍柱床体积的1×PBS洗涤填料，同时准备50 ml Falcon管用于收集洗脱的IgG组分。每管中加入1 ml pH中和缓冲液：1 M TRIS，pH 10（或按洗脱液体积的1:20比例加入TRIS缓冲液）。</li>
 <li>向柱中加入100–150 ml洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 2.5–3，收集50 ml洗脱组分。将收集管翻转混匀2–3次，测定pH值，并加入中和缓冲液调节至pH 7.2–7.4。</li>
 <li>取少量IgG洗脱液，以洗脱缓冲液作为空白对照，在280 nm处测定OD值。若OD值&lt;0.1，则停止收集。</li>
 <li>按照生产商说明书对蛋白G填料进行再生并储存。</li>
</ol>
使用 Amicon 管进行超滤浓缩：
<ol>
 <li>用 1×PBS 清洗 Amicon Ultra（15 ml /30KDa）超滤管，在 4 °C 条件下以 3,220 × g 离心 15–20 分钟。弃去 Amicon 中的穿滤液（FT）。</li>
 <li>将洗脱的 IgG 组分加至 Amicon 中，体积为 15 ml，在 4 °C 条件下以 3,220 × g 离心 25–30 分钟；离心时间需根据洗脱液中的蛋白含量进行调整。</li>
 <li>弃去穿滤液（FT），重复超滤操作，直至无洗脱组分残留。</li>
 <li>用 1×PBS 对浓缩后的 IgG 进行充分洗涤，共洗涤两次，每次离心 25–30 分钟。</li>
 <li>从 Amicon 滤器中收集呈“黏稠状”的黄褐色抗体溶液，最终体积为 1,500–2,000 μl 的 1×PBS 溶液。</li>
 <li>使用分光光度计或 NanoDrop 测定 IgG 制品的浓度： 
 浓度（mg/ml）= A(280 nm) × 稀释倍数 /1.4 </li>
 <li>按照生产商的说明对 Amicon 进行清洗并储存。</li>
</ol>
2. 将Ⅶ型胶原特异性IgG注射入小鼠
在开始实际的实验操作之前，确保已撰写好实验方案，并准备好实验所需的所有材料。
<ol>
 <li>准备用于疾病评分、ELISA、免疫荧光（IF）分析和髓过氧化物酶（MPO）检测的数据记录表4。</li>
 <li>标记用于血液和器官、冷冻模具以及组织学处理和包埋盒的管子。</li>
 <li>抗体溶液应新鲜配制或从库存中解冻，并通过反应性（通过免疫荧光显微镜和/或ELISA测定的滴度）进行表征。无菌过滤后的抗体溶液应使用PBS稀释，使注射所需剂量在250–1000 μl之间。确保有足够的IgG以完成整个实验。</li>
 <li>新鲜配制抗凝剂：肝素20 U/ml，以及用于麻醉的8.7 mg/ml氯胺酮和1.3 mg/ml赛拉嗪混合液。在处死小鼠时，准备好标记好的含有3.7%甲醛的试管。</li>
 <li>对手术器械（手术刀、剪刀、细头镊子和弯头镊子）进行灭菌，并准备注射器（胰岛素注射器、1 ml和2 ml注射器）、针头、数码相机及备用存储卡。</li>
</ol>
注意：所有操作均需在经氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷麻醉的小鼠上进行。异氟烷是日常皮肤检查的首选麻醉方式，因为小鼠恢复迅速。但在拍照时，通常需皮下注射 87 mg/kg 氯胺酮和 13 mg/kg 赛拉嗪。实施安乐死时，氯胺酮/赛拉嗪的剂量应增加至 130 mg/kg 氯胺酮和 20 mg/kg 赛拉嗪。 
<ol>
 <li>检查已标记动物的一般健康状况、皮肤和毛发外观，称量其体重并测量耳厚度（始终使用同一只耳朵）。</li>
 <li>在临床评估表中记录观察到的数值和变化。</li>
 <li>用含有等体积抗凝剂的注射器从尾静脉采集 20–30 μl（2–3 滴）血液。</li>
 <li>使用 80% 乙醇对毛发和皮肤进行消毒。</li>
 <li>使用胰岛素注射器将抗体溶液皮下注射至背部。（对于某些部位（例如，耳朵），仅可注射小体积（10–50 μl）溶液。）</li>
</ol>
应每两天重复注射一次，共注射4次。体重约为20 g的Balb/c和C57BL6小鼠在首次注射400-500至750 μg/g体重剂量的自身抗体后3-4天开始出现疾病症状。

完成实验时：
<ol>
 <li>通过皮下注射130 mg/kg和20 mg/kg的氯胺酮/赛拉嗪，使小鼠进入深度麻醉状态，从后腔静脉放血并取出心脏。</li>
 <li>采集皮肤、尾部、耳部、血液和食管等器官/组织样本，并放入预先标记并装有PBS或3.7%甲醛的试管中。</li>
</ol>
返回实验室后：
<ol>
 <li>在室温下以 1,200 × g 离心血液 10 分钟，分离血浆，将血浆转移至正确标记的试管中，并按规定储存。</li>
 <li>使用冷冻模具将皮肤活检组织包埋于最佳切割温度介质（Optimal Cut Temperature medium）中，正确标记后于 -80 °C 保存。</li>
 <li>将用于组织学检查的组织样本置于标记好的包埋模具中，用 3.7% 甲醛固定，直至进行石蜡包埋。</li>
</ol>
3. 疾病严重程度的临床评估
应每天检查小鼠皮肤和黏膜的病变，并使用适当的表格记录检查结果。早期安乐死的标准是皮肤病变面积超过体表面积的20%，以及连续三天体重下降达到总体重的5-10%，上述情况对应的疾病评分为5（表1）。
<ol>
 <li>将小鼠置于腹部位置。从头部区域开始检查，先检查右耳，观察内侧和外侧是否存在水疱、糜烂或结痂。以相同方式继续检查左耳。</li>
 <li>检查左右眼是否存在红斑、脱毛、糜烂和/或结痂等表现。</li>
 <li>接下来梳理前额和吻部区域，继续检查吻部腹侧、嘴唇以及口腔黏膜。</li>
 <li>从右前肢的足垫开始向上检查；随后切换至左前肢。以相同方法检查右后肢和左后肢。</li>
 <li>使用弯头精细镊子梳理颈部和背部区域的毛发。</li>
 <li>将小鼠翻转至仰卧位，以同样方法检查腹部以及四肢的腹侧区域。</li>
 <li>检查尾巴。</li>
 <li>对小鼠出现病变的相关身体部位拍照。需特别注意照片的质量和数量。</li>
 <li>计算临床疾病评分。</li>
</ol>
4. 皮肤和血浆样本的分析
<ol>
 <li>根据计划准备、储存和/或处理所有采集的组织。</li>
 <li>切取冷冻组织切片，用于检测兔抗体和小鼠补体系统组分的免疫荧光（IF）分析。</li>
 <li>分析冷冻组织和/或器官提取物中不同蛋白质和酶的含量（MPO 检测）。</li>
 <li>对石蜡包埋的组织进行切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色，以观察组织损伤程度。</li>
 <li>通过 ELISA 和免疫印迹法（immunoblot）分析血浆。</li>
</ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
<li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%CE%B2+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li>
<li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li>
<li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li>
<li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li>
<li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li>
<li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li>
<li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc%CE%B3-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes%2C+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066(2012).</li>
<li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease%2C+bullous+pemphigoid%2C+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen%2C+BP180%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li>
<li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li>
<li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis%3A+passive+transfer+from+man+to+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li>
<li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+%28Witebsky%27s+postulates+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).</li>
<li>Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita.</a> Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).</li>
<li>Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+type+VII+collagen+mediate+Fcgamma-dependent+neutrophil+activation+and+induce+dermal-epidermal+separation+in+cryosections+of+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin.</a> Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).</li>
<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

将自身抗体被动转移至实验动物是证明其致病性的主要方法7, -12。通过该方法获得的动物模型，除了可作为自身免疫的间接证据13外，还可用于研究致病机制的效应阶段。抗体诱导中性粒细胞依赖性皮肤水疱形成的获得性大疱性表皮松解症（EBA）被动转移模型，已被用于解析自身免疫性皮肤病中的组织损伤机制。该模型还成为一种极具教学意义的疾病模型，可用于研究抗体介导的器官特异性自身免疫病中若干基础性、生物学及临床关键问题，其意义远超针对Ⅶ型胶原自身免疫的范畴。最后，该模型也可用于研究包括基底膜生物学、免疫复合物对粒细胞的激活以及补体激活在内的基本生物学与病理生理学过程。
尽管已有多种实验条件可用于研究自身免疫性皮肤疾病EBA，包括ex vivo模型和动物模型14，但迄今为止最适合研究粒细胞依赖性炎症通路的方法是将自身抗体被动转移至动物体内。与ex vivo模型相比，在后者中需将粒细胞添加至预先与自身抗体孵育的皮肤切片中15，而在此动物模型中，小鼠可自发重现白细胞的浸润过程。此外，...

<table><tbody><tr><td>重组抗原 </td><td></td><td></td><td>编码小鼠VII型胶原重组形式的质粒可向通讯作者索取。</td></tr><tr><td>免疫兔血清</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.eurogentec.com/&quot; target=&quot;_blank">www.eurogentec.com&lt;/a&gt;</td><td></td><td>我们使用200 &amp;mu;g抗原对新西兰白兔进行免疫，每两周一次，共三次。此项工作由比利时Eurogentec S.A.公司提供服务完成。</td></tr><tr><td>Protein G 琼脂糖</td><td>Roche Applied Science</td><td>11243233001</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c 小鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT包埋剂，Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>OCT，最佳切削温度</td></tr><tr><td>标准冷冻模具</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td>25 mm &amp;#215; 20 mm &amp;#215; 5 mm</td></tr><tr><td>中号冷冻模具</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td>15 mm &amp;#215; 15 mm &amp;#215; 5 mm</td></tr><tr><td>Uni-Link组织包埋盒</td><td>R. Langenbrinck</td><td>09-0503</td><td>组织学处理与包埋用包埋盒</td></tr><tr><td>专用纹身墨水黑色</td><td>H. Hauptner und Richard Herberholz GmbH & Co. KG</td><td>71492000</td><td>纹身糊</td></tr><tr><td>纹身钳 TZ1</td><td>EBECO E. Becker & Co GmbH</td><td></td><td>纹身装置</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Carl Roth GmbH & Co.</td><td>7692.1</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 37%</td><td>Carl Roth GmbH & Co.</td><td>7386</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>K2753-1G</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>无菌PBS</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 5400</td><td></td></tr><tr><td>注射器驱动式滤器单元 0.45 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡尺 </td><td>Mitutoyo 7309</td><td>1667338</td><td>Farnell（经销商）</td></tr><tr><td>疾病评分表</td><td></td><td></td><td>附示例 </td></tr></tbody></table>

粒细胞依赖性自身抗体诱导的皮肤水疱形成

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

自身免疫现象可发生于健康个体，但当自身耐受失效时，自身免疫反应可能导致特定病理改变。根据Witebsky准则，将疾病诊断为自身免疫性疾病的依据之一，是通过被动转移自身抗体在实验动物中复制出该疾病。对于获得性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa acquisita, EBA）——一种典型的累及皮肤和黏膜的器官特异性自身免疫病——近年来已建立多种实验模型。在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白第757至967位氨基酸（200个氨基酸片段）的纯化IgG抗体反复注射入小鼠体内，可复制出与人类EBA相似的大疱表型以及组织病理学和免疫病理学特征。 1全面发作的广泛性病变通常在首次注射后5-6天出现，疾病严重程度与给予的VII型胶原特异性IgG剂量相关。实验性获得性大疱性表皮松解症（EBA）中的组织损伤（水疱形成）依赖于组织结合的自身抗体对粒细胞的募集和激活 2,-4因此，该模型可用于解析粒细胞依赖性炎症通路在自身免疫性组织损伤中的作用，因为该模型仅重现了效应性自身免疫反应中T细胞非依赖的阶段。此外，多项研究证实了自身抗体具有诱导水疱形成的能力，进一步凸显了该模型的价值。 体内 并研究EBA中水疱形成的机制 1,3,-6最后，该模型将极大地促进针对自身抗体介导疾病的新抗炎疗法的开发。总体而言，大疱性类天疱疮（EBA）的被动转移动物模型是一种易于建立且具有教学意义的疾病模型，不仅有助于研究人员分析EBA的发病机制，还将帮助回答生物学和临床免疫学中一系列基础而关键的自身免疫问题。

抗原特异性抗体的被动转移可在小鼠中引发完全型疾病，在临床表现、组织学及免疫病理学水平上均类似于人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）。小鼠的耳朵、鼻吻部、足部、腿部、背部及眼周会出现水疱、结痂、糜烂和脱发。疾病的首发临床症状最常出现在耳朵和/或头部区域。通过直接免疫荧光法在病变周围皮肤冷冻切片的真皮-表皮交界处可检测到特异性兔IgG和小鼠补体C3的沉积。组织学检查可见病变皮肤存在表皮下水疱及炎性细胞浸润。
然而，如果停止注射致病性的VII型胶原特异性抗体，疾病活动会逐渐减弱，并在数周内病变愈合。尽管如此，一定程度的炎症后瘢痕性脱发可能会无限期持续存在。
重组自身抗原（及致病性 IgG）的表征
小鼠胶原特异性 IgG 结合于真皮-表皮连接处（图 2B）。通过免疫印迹评估其特异性（图 2C，泳道 3、4 和 7）。
评估疾病活动度
<p class="jove...

在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白一段200个氨基酸（aa 757-967）区域的纯化IgG抗体反复注射到小鼠体内，可复制出水疱表型以及组织学和免疫病理学特征，这些特征与人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）的特征相似1。

健康个体中也可能出现自身免疫现象，但当自身耐受性失效时，自身免疫反应可能导致特定的病理改变。根据……

我是来自德国弗赖堡大学皮肤科的 Cassian RO。我们实验室的研究重点是自身免疫性皮肤病的发病机制。我们感兴趣的一种自身免疫性疾病是表皮松解性大疱病（Epidermolysis QUISTA），或称 EBAA，这是一种器官特异性的自身免疫性疾病，具有明确的抗原-自身抗体系统，并且该疾病已有相互补充的离体（ex vivo）和动物模型可供研究。通过将抗Ⅶ型胶原的抗体被动转移至小鼠体内，可以重现获得性大疱性表皮松解症（EBA）的水疱形成。因此，在本视频文章中，我们将展示通过被动转移特异性抗Ⅶ型胶原抗体在小鼠中诱导并分析皮肤水疱的方法。大家好，我是来自弗莱堡大学医院皮肤科CAS研究组的King OBA。在本视频中，我们将向您展示如何通过被动转移致病性自身抗体来诱导实验性小鼠大疱性类天疱疮（EBA）模型。我们在研究自身免疫性皮肤疾病可能的致病机制或寻找致病性表位时，会采用这一实验方法。在建立EBA的被动转移模型时，需在将自身抗体注射到野生型掌跖小鼠之前，完成若干额外步骤。首先，将纯化的重组抗原通过皮下注射的方式免疫白兔。通过亲和柱色谱法从兔血清中分离总IgG，并将其注入野生型小鼠体内。每隔一天进行一次皮下注射，共注射四次，每间隔两天采集一次血液样本。每天观察小鼠的一般状况以及皮肤病变的迹象。实验期间，对每只小鼠计算反映疾病活动的临床评分；在首次注射两周后，处死动物，采集血清样本和皮肤活检组织并进行进一步分析。孵育时间结束后，将层析柱置于垂直支架上，打开底部，轻敲并收集流出液。在50毫升离心管中保留流穿液，直至免疫荧光分析确认其为不含特异性抗体的IgG浓缩液；随后在特殊Amicon超滤管中，于4摄氏度条件下以3,220 × g离心30分钟进行超滤浓缩。浓缩过程包括让洗脱液通过滤膜，弃去滤过液，重新加液至管中并重复此步骤，直至无洗脱液残留。最后一步为用1倍PBS洗涤，收集呈淡黄色黏稠状的浓缩IgG，测定其浓度，并分装至正确标记的离心管中保存。在开始实际注射自身抗体之前，通过间接免疫荧光法评估其特异性和滴度。将浓缩的IGT制剂进行系列稀释后，与正常小鼠皮肤的冷冻切片共同孵育，并使用适当标记的荧光二抗通过免疫荧光观察其沉积情况，在进入动物实验设施前拍照记录结果。确保已撰写动物实验方案并准备好所有材料。用于疾病活动临床评分的数据表，标记用于血液和组织样本的试管。将抗体溶液稀释至可注射的适当体积。准备新鲜抗凝剂，以及经灭菌的手术器械和注射器用于麻醉。还应在清单中包括游标卡尺和数码相机。清洁工作台面并准备好异氟烷麻醉装置后，用肝素处理注射器以用于采血，并用胰岛素注射器吸取抗体溶液。将小鼠从笼中取出，核对编号并称重。将所有测量和观察到的数据记录在小鼠个人数据和临床评分表中。当小鼠已处于麻醉状态时，测量耳部厚度，然后检查动物的皮肤和毛发外观。需特别注意头部、背部、腹部及四肢区域。在尾静脉上三分之一处做一小切口，从该处采血，消毒毛发后，提起背部皮肤，将IgG溶液小心地皮下注射。返回实验室后，将血液在室温下以1,200 × g离心10分钟，以获取血清。将样品转移至正确标记的试管中，并根据计划进行储存。当小鼠开始出现红斑性脱毛和皮肤病变时，每天观察其疾病迹象。除测量体重外，还需评估疾病活动度。皮下注射氯胺酮与甲苯噻嗪混合物，使小鼠进入麻醉状态。测量耳部厚度，随后开始全身检查。使用弯头精细镊子逆着毛发生长方向轻刷毛发，以暴露可能的病变区域。依次检查面部各个部位。眼睛从吻部移向耳部的外侧和内侧，然后检查头部另一侧。继续检查口腔黏膜、吻部腹侧及腹部区域、体侧背部、背部和颈部区域，以及前肢和手部肢体。在记录中量化病变程度，根据皮肤覆盖面积、特定身体部位和区域占小鼠总体表面积的百分比，在表格中记录检查结果。根据受累皮肤和黏膜的总面积计算临床疾病评分。最后，拍摄相关身体部位和病变区域的照片。实验结束时，在深度麻醉下处死动物，并采集血液及组织样本。在此实验条件下，最常采集的组织包括耳部、尾部和食管。将病变皮肤活检组织切成更小的条状。将它们放入组织学处理和包埋盒中，并在3.7%甲醛中保存至石蜡包埋。随后，对样本进行苏木精和伊红（H&E）染色处理，用于免疫荧光分析。将珍珠皮条包埋于最佳切割温度介质中，并使用冷冻切片机切制六微米（6 µm）切片。通过直接免疫荧光分析，观察组织中结合的特异性兔抗体及小鼠补体成分；同时采用酶联免疫吸附试验（ELISA），使用重组抗原包被的微量滴定板以及小鼠血清的系列稀释，检测循环中自身抗体的水平。将抗Ⅶ型胶原特异性抗体被动转移至小鼠体内，可诱导出在临床表现、组织学及免疫病理学水平上均类似于人类获得性大疱性表皮松解症（EBA）的完整疾病模型。小鼠在耳部、眼周、鼻部、爪部、腿部及背部出现类似人类EBA的水疱、结痂、糜烂及脱发症状。疾病活动度在整个实验过程中呈现上升趋势，其计算依据为受累的皮肤和黏膜面积。代表性结果展示了通过间接免疫荧光法在皮肤冷冻切片的真皮-表皮连接处检测到的特异性兔IgG和小鼠补体C3的沉积情况，结果如图所示。对照组中未检测到IgG或补体C3。对病变皮肤进行后续组织学分析，显示表皮下水疱及炎性浸润。然而，在对照组中未观察到表皮下水疱形成。如图所示，当前使用的自身抗体诱导表皮下水疱模型将极大促进对自身抗体引发的组织损伤中依赖于 ROY 的炎症通路的解析。该模型设计严谨、操作简便，也适用于自身抗体诱导性疾病的新型抗炎疗法的开发与验证。

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

粒细胞相关的自身抗体引起的皮肤起泡

疱疹样皮炎（DH）是一种慢性炎症性疾病，其特征是IgA与表皮转谷氨酰胺酶（eTG）之间发生自身免疫反应。DH仅在极少数对麸质敏感和/或患有乳糜泻的患者中发生。本研究结果表明，DH也可能在患有特发性皮炎症状的恒河猴宿主中发生。...

一例罕见的Rhesus皮炎中IgA抗体及组织转谷氨酰胺酶2抗体对表皮转谷氨酰胺酶的识别

间接免疫荧光（IIF）检测法传统上用于检测人血清中的抗核抗体（ANA）。这些抗体的存在有助于系统性自身免疫性风湿病（SARD）的诊断。本方案展示了如何有效进行IIF技术，以准确检测这些自身抗体。...

使用 HEp-2 细胞进行抗核抗体筛查

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。...

C57BL/6小鼠中系统性红斑狼疮（SLE）的bm12可诱导模型

在此，我们展示了吸疱皮肤回忆反应模型的操作方法。该模型为研究人类皮肤免疫反应提供了简便的途径 体内...

一种用于研究人类T细胞记忆应答的负压水疱实验方案 体内

本方案描述了生成具有自发性自身免疫生发中心的混合型小鼠骨髓嵌合体的方法，其中自身反应性淋巴细胞携带一种光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）报告基因。该系统能够将组织中细胞的定位与后续的分子及功能分析相联系。...

通过光激活在混合嵌合型自身免疫模型中探究单个自身反应性生发中心

嗜碱性粒细胞活化试验是一种补充性 体外 基于流式细胞术检测特定刺激下嗜碱性粒细胞活化标志物，用于评估IgE介导的过敏反应的诊断试验。...

嗜碱性粒细胞活化试验在过敏诊断中的应用

该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。...

经皮诱导免疫调节的小鼠模型

皮肤病变在许多风湿性疾病中常见且具有重要意义，活检结合病理学分析在诊断中起着关键作用。本文详细概述了标准化的皮肤活检操作流程，并以盘状红斑狼疮为例，强调了皮肤病理学在诊断风湿性疾病中的重要作用。...

皮肤活检在盘状红斑狼疮诊断中的应用

通过在背部皮肤进行皮内注射Leishmania前鞭毛体，优化用于皮肤利什曼病的实验性仓鼠模型。该方法在接种、后续观察、病灶特征描述、治疗实施以及临床样本采集过程中均具有优势。动物的运动能力、觅食与饮水行为、嬉戏及社交活动均保持正常。...

仓鼠背部皮肤的皮肤利什曼病：一种用于抗利什曼原虫药物筛选的有效模型

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

了解通过被动转移抗VII型胶原抗体在小鼠中诱导皮肤起泡的方法，用于研究获得性大疱性表皮松解症的发病机制。该模型可重现人类EBA的临床和组织病理学特征，为自身免疫性皮肤病研究提供重要工具。

粒细胞依赖性自身抗体诱导的皮肤水疱形成

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