脑片中单个神经元轴突、树突及树突棘的电压敏感染料记录

所述实验的总体目标是通过光学手段，以亚微米和亚毫秒级分辨率，从神经元多个位点对单个神经细胞的膜电位信号整合与信息处理进行监测。首先需构建一个具备适当灵敏度的成像系统，以记录与膜电位瞬变相对应的微小光强变化。随后，选择具有合适形态结构的神经元，使其具有较长且完整的突起，并位于切片表面附近的单一焦平面上，以便实现有效的成像。

然后用电压敏感性染料加载预先选定的神经元，以实现对膜电位变化的光学追踪。结果表明，该方法具有独特的能力，可通过监测来自轴突、树突和树突棘的膜电位信号，获取单个神经细胞电学信号整合的信息。在细胞神经生理学中。

由于传统电生理学存在两个长期局限性——电极测量的空间分辨率低，以及无法记录轴突侧支或树突棘等微小结构的信号，新的研究工具正在被开发。为克服这些缺点，可将膜片钳电极技术与光学方法相结合，从而实现对神经元各个部分的并行记录。本文介绍了一种此类技术，即以单个树突棘分辨率为标准的膜电位瞬变的多侧位光学记录。

在本实验中，使用正置显微镜和三台相机来调节均匀照明。首先，在激光光路中插入适当的中性密度滤光片。然后，将物镜聚焦在标准荧光玻片的表面。

在监视器屏幕上观察CCD视野图像的同时，使用落射荧光聚光镜上的适当调节装置，调整石英导光管接收端和导光管输出端的位置，以实现视野的居中且均匀照明。为测定振动噪声，使用表面带有非荧光标记的标准荧光玻片。利用神经CCD以连续模式记录光强度。

将物镜聚焦在黑色标记的暗边处，并以每秒2000帧的帧率记录约100毫秒的光强。然后显示来自均匀照明区域约20个像素的归一化光强轨迹的空间平均值，以及沿黑色标记边缘约20个像素的归一化光强轨迹的空间平均值。来自高对比度边缘像素的空间平均值中的额外噪声反映了系统的振动噪声。

必须将机械快门安装在隔振光学平台之外，以确保快门开启时不会在光学记录中引入振动噪声。这是关键步骤。使用塑料螺钉和隔振材料安装快门，以减少光学记录系统可能接收到的声学振动噪声。

为了隔离振动，调节振动隔离台，直至覆盖图像锐利边缘的像素振动噪声小于散粒噪声。台面上的设备线缆必须保持松弛，以避免将机械振动传递至显微镜。本实验步骤中，使用在特定神经元中表达EGFP的小鼠品系，按照标准操作制备厚度为300至400微米的脑切片，并采用转盘共聚焦显微系统进行观察。

在切片中观察EGFP标记的神经元。接着，选择具有完整树突和轴突结构、且其突起与切片表面平行并靠近表面的神经元，用于膜电位成像。然后，通过施加约15秒的负压，从尖端开始用不含染料的细胞内液填充玻璃膜片电极，填充至电极锥形部分的三分之二处。

随后，用含有溶解于细胞内液中的膜片透性电压敏感染料的溶液回填电极。现在，在将染料装入电极后一分钟内，对先前选定的神经元进行膜片钳制。在将移液管放入浴液之前，施加约10毫米汞柱的低正压，并在将电极定位至脑片过程中保持该压力，以确保在形成封接之前染料不会从电极中泄漏。

在电极接触细胞表面之前，将压力升高至约100毫米汞柱的较高压力。在全细胞构型下形成封接后，使荧光染料从体细胞膜片电极自由扩散至胞体，持续20至45分钟。在染料扩散过程中，通过电流钳模式记录诱发电位，监测神经元的生理状态。

此外，通过以每秒两千帧的帧率并使用中性密度滤光片调节至部分全光强，记录细胞胞体的静息光强度，来监测染色程度。持续下载过程，直至动作电位开始变宽。染色结束时，在电压钳制模式下小心地将膜片电极从胞体移开，以确保在此过程中实现从全细胞记录模式向外向膜片记录模式的转换。

然后将切片在室温下再孵育1.5至2小时，以使电压敏感性染料扩散至神经元的突起中。当大量染料从胞体扩散至树突和轴突后，动作电位的波形应完全恢复。下一步，在低强度荧光下定位染色神经元的胞体。

使用中性密度滤光片将光照强度降低至仅能观察到目标结构所需的最低水平，利用XY载物台扫描脑片中含有荧光神经元的区域，直至识别出荧光标记的胞体。将染色细胞的胞体置于显微镜视野中央，在微分干涉差（DIC）模式下，用不含染料的标准膜片钳电极对神经元进行封接。随后，在连续记录模式下，以每秒10至40帧的速率，在低强度荧光照明下观察神经元的突起结构，用于电压成像。

使用XY轴载物台位置，将成像区域中央的感兴趣神经元突起置于视野中心。此外，通过显微镜部分关闭的视场光阑来遮蔽细胞体（SOMA），以减少光动力损伤。随后，记录与单个树突分支中逆向传播的动作电位相关的光学信号。

然后记录与轴突中动作电位相关的光学信号。接着，记录与树突棘中逆向传播动作电位相关的光学信号。使用适当的帧率以准确重建信号波形。

同时，应尽可能缩短记录时间并减少暴露于高强度激发光的时间，以最大限度地减少染料漂白和光动力损伤。此处展示了光学信号的记录过程。上方图显示了处于记录位置的染色神经元及其轴突的高分辨率共聚焦图像。

上方的图示展示了用于膜电位成像的CCD所获取的轴突低空间分辨率荧光图像，下方图示则呈现了来自胞体的电极记录以及来自轴突起始段（A IS）和rvi节点的光学记录。原始数据与处理后的信号均显示于此。该图展示了负载电压敏感染料action的L五皮层神经元轴突产生的动作电位信号。

在10千赫兹的帧率下记录了可能的相关信号。这些迹线显示了来自三个位置的动作电位瞬变。其一，电极记录自细胞体。

两个来自轴突起始段的光学记录，以及三个来自第一维节点的光学记录，此处为来自相同三个位置的叠加信号。该图显示了由100赫兹短促去极化电流脉冲在L5皮层神经元树突分支多个位置引发的四次逆向传播动作电位信号的爆发。此处展示的是来自单个树突棘的动作电位信号。

这是从转盘共聚焦图像序列获得的解剖结构重建图像，右侧为使用CCD相机获取的同一区域的荧光图像。在膜电位成像中，右侧图显示了CCD图像中标记的1至3位置处对应的回传动作电位的荧光强度变化轨迹。底部轨迹表示来自胞体的电极记录结果。

预录制准备大约需要三小时，包括等待染料扩散至远端突起的时间。记录时间受限于制备样本的正常衰减以及光敏剂（PO）的光动力学损伤。光动力学损伤的程度与激发光强度、单次记录的持续时间以及记录试验的次数成正比。

在某些实验中，可以在一到两个小时之内完成超过 50 次的记录试验。其他测量需要高强度激发光和更长的记录时间，由于光动力损伤的限制，只能进行数次记录试验。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在脑片中对单个神经元的整个轴突和末端结构进行电压成像。