Name: 电压敏感染料记录单个神经元在大脑切片的轴突，树突和树突棘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 了解电压敏感染料成像技术，用于监测单个神经元的膜电位变化。该方法可在轴突、树突和树突棘实现亚微米空间分辨率和亚毫秒时间分辨率的光学记录。

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我们感谢 Knut Holthoff、Arthur Konnerth 和 Marco Canepari 参与了本技术的初步开发工作，同时感谢 Leslie M. Loew 慷慨提供染料。本研究得到美国国家科学基金会（NSF）资助项目 IOS-0817969、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NS068407 和 M136043，以及耶鲁大学卡夫利神经科学研究所的支持。

1. 仪器设置
步骤 1.1. 成像装置设置
记录电压敏感染料信号的关键在于合理的装置设计。我们使用配备三个相机的 upright 显微镜（BX51WI Olympus 或 Zeiss AxioExaminer）。该装置设计用于在脑切片中通过倒置荧光宽场显微成像模式，利用 Nikon 60X/1.0 NA 或 Zeiss 63X/1.0 NA 水浸物镜，对单个神经元进行激发光照明。我们的显微镜固定在防震台上，并配备电动可移动载物台。每台显微镜均配有三个相机接口。其中一个接口连接标准高空间分辨率 CCD 相机，用于红外微分干涉差视频显微成像（IR-1000, Dage MTI, USA）。第二个接口连接高速数据采集相机（最高帧速达 20 kHz），其空间分辨率相对较低（80 x 80 像素），但具有出色的动态范围（14 位）和极低的读出噪声（NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA）。第三个接口连接高空间分辨率 CCD 相机（PixelFly, 1392x1024 像素；PCO AG, Germany），该相机安装在转盘共聚焦扫描仪（CSU-10, Yokogawa, Japan）上，用于采集共聚焦 z 轴层扫图像，以实现对染色细胞的精细形态重建。激发光源为波长 532 nm 的倍频二极管泵浦 Nd:YVO4 连续波激光器（400 mW）（MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China）。由快门（LS6; Vincent Associates）控制的直径为 2 mm 的激光束，经由单端口倒置荧光聚光镜（TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Germany）导入显微镜，设计上可完全覆盖物镜后焦面，从而实现对样品平面近乎均匀的照明。采用激光光源替代传统的氙弧灯，以最大限度提高 Vm 成像的灵敏度，具体体现在两个方面：（1）使用染料吸收光谱红移区域的单色激发光，以最大化染料的 Vm 灵敏度9, 10；（2）将激发光强度提升至超过弧灯所能达到的水平。激发光由中心波长为 560 nm 的二向色镜反射至样品，所采集的荧光信号则通过 610 nm 截止滤光片（Schott RG610）。通过提高光照强度并结合接近最优的单色激发波长，电压成像的灵敏度相比以往测量提高了约 50 倍6。
步骤 1.2：调整以获得均匀照明
使用荧光玻片标准品（绿色激发/红色发射）。在激光光路中插入适当的中性密度滤光片，以确保CCD不发生饱和。将物镜聚焦在玻片表面。调节石英导光管接收端在激光发射器物镜前方的位置，并利用落射荧光聚光镜上的适当执行器调节连接至显微镜的导光管输出端的位置，以实现视场中心对齐且照明均匀。
步骤 1.3. 确定振动噪声
在荧光载玻片表面放置一个微小的黑色墨水标记。使用 NeuroCCD 以连续记录模式记录光强度。将物镜聚焦于黑色墨水标记的暗边处。以 2 kHz 的帧率记录约 100 毫秒的光强度。显示来自均匀照明区域约 20 个像素的光强度相对变化（ΔF/F）的空间平均迹线，以及沿墨水标记边缘约 20 个像素的相应迹线。来自高对比度边缘像素记录中的额外噪声反映了系统的振动噪声。
步骤 1.4. 振动隔离
必须使用隔振台将振动降低至低于实验记录条件下光强水平的散粒噪声水平。调节隔振台，直至图像锐利边缘所覆盖像素的光强信号中的振动噪声可忽略不计。任何带有运动部件的设备（如机械快门、风扇）均不得安装在隔振台上。安装在隔振台上的设备与其他未进行隔振的组件之间的连接电缆必须保持松弛，以免将机械振动传递至显微镜系统。
2. 用于V的合适神经元的选择m-成像
步骤 2.1. 神经元的选择
按照标准操作流程制备脑切片。使用在特定神经元中表达EGFP的小鼠品系。利用转盘共聚焦成像系统，在切片中观察EGFP标记的神经元。选择具有完整树突和轴突结构、且其突起与切片表面平行且靠近表面的神经元进行膜电位（Vm）成像。在野生型小鼠中无法实现此目标，因为在微分干涉差（DIC）显微镜模式下，轴突和细小树突大多不可见。
3. 使用电压敏感性染料标记神经元
步骤 3.1. 填充膜片移液管
从尖端开始用无染料的细胞内溶液填充玻璃膜片电极，施加负压约15秒，填充至电极锥形部分的约2/3处。尖端使用无染料溶液是必要的，以防止染料泄漏到脑片上，从而避免背景荧光增加并显著降低信噪比。随后，用含有膜非通透性电压敏感染料JPW3028（溶于细胞内溶液，终浓度0.8 mM）的溶液反向填充电极。
JPW3028 是用于细胞内检测最成功的电压探针，属于 ANEP 系列亲脂性苯乙烯类染料的双正电荷类似物，其水溶性仍足以用于显微注射。该染料的二乙基类似物具有几乎相同的特性（包括电压敏感性），并作为 JPW1114 商业化供应（见表1）。我们以蒸馏 H2O 配制 20 mM 的储备液。将 50 μl 的储备液分装后于 -20 °C 冷冻保存。实验当天，将 2 μl 储备液溶于 50 μl 细胞内液中，以获得 0.8 mM 的终浓度染料溶液。该储备液稳定，可在室温下保存数月。因此，我们会留取一份 50 μl 的分装储备液置于室温，直至用完。
步骤 3.2. 快速建立吉欧封接
对先前选定的神经元进行膜片钳记录，在全细胞模式下使染料从胞体膜片电极自由扩散至胞体，持续20-45分钟。必须尽快形成封接，以尽量减少电极尖端中无染料溶液的体积。首先练习不加染料的电极快速封接操作。随后，练习使用含染料的电极进行封接并加载神经元，目标是尽可能减少电极尖端无染料溶液的使用量，同时避免污染周围组织。通过练习，可在1-2分钟内建立封接。
步骤 3.3. 监测染色程度
在全细胞构型中进行染料扩散时，通过在电流钳模式下记录诱发的动作电位来监测神经元的生理状态。此外，通过以2 kHz的帧率并使用中性密度滤光片调节至部分全光强度（我们采用400 mW激光器激光强度的0.04%）记录细胞胞体的静息光强度（RLI），来监测染色程度。持续进行染料加载，直至动作电位开始变宽，通常在20至40分钟后发生，具体时间取决于电极的大小和电阻。
峰电位的展宽是完全可逆的，最可能源于染料在胞体膜上达到饱和浓度时的电容负载效应。当染料浓度在神经元内达到平衡后，峰电位的波形即可完全恢复。
步骤 3.4. 移除染料电极
染色结束后，在电压钳制模式下小心地将记录电极从细胞体上移开，确保在此过程中实现从全细胞模式到外向膜片模式的转换。
步骤 3.5。等待染料扩散
将切片在室温下继续孵育1.5-2小时，以使电压敏感性染料扩散至神经元突起中。当大量染料从胞体扩散至树突和轴突过程后，动作电位的波形将完全恢复。
4. 光学记录
步骤 4.1. 选择用于成像的细胞区室
在低光照荧光条件下找到染色神经元的胞体，并在微分干涉差（DIC）下使用标准（无染料）膜片电极重新封接该神经元。以10-40 Hz的帧率，在CCD电压成像的连续记录模式下观察神经元突起。使用中性密度滤光片将光照强度降低至能够观察目标结构所需的最低水平。在定位染色神经元时，我们采用400 mW激光强度的0.01%。通过X-Y载物台，将感兴趣的神经元突起置于成像区域中央。利用显微镜部分关闭的视场光阑遮挡胞体，避免其受到激发光照射。遮蔽胞体以避免高强度激发光照射，可显著减少记录过程中的光动力学损伤。
步骤 4.2 记录与膜电位瞬变相关的光学信号
记录与单个树突分支中逆向传播的动作电位（AP）相关的光学信号。记录与轴突中动作电位（AP）相关的光学信号。记录与树突棘中逆向传播的动作电位（AP）相关的光学信号。采用适合准确重建信号波形的帧率，并尽可能缩短记录时间和高强度激发光的暴露时间，以最大限度减少染料漂白和光动力损伤。例如，研究单个动作电位在轴突中启动和传播的序列时，需要5-10毫秒的记录时间。记录期间的激发光强度需在信噪比与染料漂白及光动力损伤程度之间取得平衡。当使用400 mW激光照射直径为300 μm的区域以记录较长轴突段时，我们采用100%的激光强度。当激发光聚焦于直径为30 μm的区域用于树突棘成像时，我们使用10-25%的激光强度。记录所需的时间长度是决定最佳激发光强度的重要因素；较短的记录时间允许使用更高的光强度。最佳照明强度应根据每种样品和测量条件通过实验经验确定。
5. 数据分析
步骤 5.1. 对原始数据校正已知误差
数据的分析与显示使用 NeuroPlex 程序（RedShirtImaging）完成，该程序以 IDL（ITT Visual Information Solutions，Boulder，Colorado）编写，并结合了自定义的 Visual Basic 例程。在低光照水平条件下，背景荧光成为影响 ΔF/F 信号大小的重要因素。原始数据首先通过减去从切片无染色区域测定的平均背景荧光强度来校正此效应。随后，使用信号对齐软件校正动作电位（AP）起始的时间抖动，以及在信号平均过程中可能发生的微小标本移动。在时间域上，通过将每次试验中电记录的动作电位与平均开始时获取的参考信号进行互相关分析，实现 AP 信号的对齐（图 1B）。在空间域上，通过图像互相关方法对图像进行二维离线对齐，以补偿标本可能发生的微小横向移动。每次单独试验前均需验证图像在 z 轴方向上的正确聚焦，通常需要进行微调。空间和时间对齐后的信号按如图所示方式进行平均（图 1B）。由于染料漂白引起的光强度缓慢变化，通过将数据除以从无刺激记录试验中获得的适当双指数函数进行校正（图 1B）。动作电位信号的波形通过立方样条插值法从一组数据点重建，该方法生成一条逐段连续并通过每个数据点的曲线。为了验证电压敏感性染料信号在毫秒时间尺度上对膜电位的追踪无显著失真，将胞体的电学动作电位信号与邻近轴突起始段的光学动作电位信号进行了比较（图 3B）。两种信号高度重合，仅存在光学记录中的散粒噪声差异。
<img alt="神经信号分析；时间抖动、电学与光学数据；胞体、轴突始段与郎飞结比较。" src="/files/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. 数据分析（动画）。(A) 上图：处于记录位置的染色神经元的高分辨率共聚焦图像，示意图显示记录电极连接胞体，胞外刺激电极位于基底树突附近。通过胞外突触刺激诱发动作电位。下图：使用CCD获取的轴突低空间分辨率荧光图像，用于Vm成像。(B) 来自胞体的电极记录（黑色轨迹）、来自轴突始段（AIS）的光学记录（红色轨迹）以及来自郎飞结的光学记录（绿色轨迹）。最上一排：9次试验的原始数据，显示动作电位起始的时间抖动。第二排：时间对齐后的信号。第三排：平均信号。第四排：漂白校正信号。最下一排：经一次时间平滑处理的三次样条插值结果。

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</ol>

Dejan Zecevic 宣布他是 RedShirtImaging LLC. 的共同所有人，该公司专门生产用于电压敏感染料记录的高速、低噪声 CCD 相机。其他所有作者均声明在本研究中不存在经济利益或潜在的利益冲突。

本文介绍了一种电压敏感染料记录方法，可用于以亚微米级空间分辨率和亚毫秒级时间分辨率监测单个神经元的电活动。采用接近最优波长（就信号幅度而言）的激光激发，使记录灵敏度比以往方法提高了约50倍。当前的灵敏度可实现对单个神经元所有部位的电信号监测，包括树突、轴突、轴突侧支、轴突末梢以及单个树突棘。在现有灵敏度下，膜电位瞬变的记录帧率可达每秒20,000帧。通过适度的信号平均（4至25次试验），即可将信噪比表示的记录灵敏度进一步提高2至5倍。电压成像的主要局限在于，无法在绝对电压尺度上对来自多个位置的光学信号进行简单的校准。在某些实验条件下，可通过寻找在所有位置均具有已知幅度的膜电位信号来解决此问题。轴突以及某些完全可兴奋树突中的动作电位信号6可作为极佳的校准标准。
该方法应用中的关键步骤包括：
<ol class="lalpha">
	<li>通过将记录限制在急性脑切片表面附近（&lt; 30 μm）的神经元，以最小化光散射效应。这需要优化切片程序，以在切片的上层获得较高比例的健康神经元1。</li>
	<li>优化电极尖端透明溶液的用量，以...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;装置组件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus Inc.</td><td>BX51WI</td><td>配备三个相机接口</td></tr><tr><td>电动可移动载物台</td><td>Siskiyou</td><td>MXOPi.2</td><td></td></tr><tr><td>适用于 Olympus BX51 的落射荧光聚光镜</td><td>TILL Photonics</td><td>0000-560-11659</td><td></td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Carl Zeiss, LLC</td><td>AxioExaminer D1</td><td>配备三个相机接口</td></tr><tr><td>电动顶板</td><td>Scientifica Limited</td><td>MMBP</td><td></td></tr><tr><td>适用于 Zeiss Axi&amp;#8211;xaminer 的落射荧光聚光镜</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集相机</td><td>RedShirtImaging LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td>高速、低读出噪声</td></tr><tr><td>用于红外微分干涉相衬（IR-DIC）的 CCD</td><td>Dage-MTI</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦扫描仪</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-10</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦扫描仪上的高空间分辨率 CCD</td><td>PCO AG</td><td>PixelFly</td><td>1392×1024 像素</td></tr><tr><td>DPSS 连续波激光器（532 nm）</td><td>CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd</td><td>MLL-III-532 400mW</td><td>激发光源</td></tr><tr><td>多模光纤耦合器</td><td>Siskiyou</td><td>SM-CFT</td><td></td></tr><tr><td>导光管</td><td>TILL Photonics</td><td>0000-515-11524</td><td></td></tr><tr><td>快门</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6</td><td></td></tr><tr><td>隔振台</td><td>Minus k Technology</td><td>MK26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;特定试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Di-2-ANEPEQ（JPW 1114）</td><td>Life Technologies</td><td>D-6923</td><td>电压敏感性染料</td></tr><tr><td>Crym-EGFP 小鼠品系</td><td>GENSAT（MMRRC）</td><td>STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd</td><td>在皮层第5层神经元中稀疏表达 EGFP</td></tr></tbody></table>

脑片中单个神经元轴突、树突及树突棘的电压敏感染料记录

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

了解单个神经元的生物物理特性及其功能组织，以及它们如何处理信息，是理解大脑工作原理的基础。任何神经细胞的主要功能都是处理电信号，这些信号通常来自多个来源。神经元过程的电学特性极为复杂、动态变化，在一般情况下，若无详细测量则无法预测。理想情况下，为了获得此类测量数据，人们希望能够同时在多个位点监测亚阈值事件，观察这些事件如何从神经元过程上的起源部位传播并在特定位置进行整合，从而影响动作电位的产生。由于使用电极进行测量存在技术局限性，这一目标在任何神经元中尚未完全实现。为克服这一缺陷，非常有必要将膜片钳电极技术与成像技术相结合，后者能够实现对神经元各个部分的大规模并行记录。在此，我们描述了一种此类技术——利用有机电压敏感染料进行膜电位瞬变的光学记录（Vm-成像），该技术具有亚毫秒级和亚微米级的空间与时间分辨率。我们的方法基于电压敏感分子探针领域的开创性研究2。几十年来，该技术的许多方面持续得到不断改进3, 5, 11。此外，先前的研究已证实Vm-成像具备两个关键特性：第一，荧光信号在整个生理范围内（-100 mV 至 +100 mV）与膜电位呈线性关系10, 14, 16；第二，使用本研究中的电压敏感染料（JPW 3028）对神经元染色不会产生可检测到的药理学效应。染色过程中观察到的动作电位展宽现象是完全可逆的4, 7。此外，实验证据表明，在出现任何可检测的光毒性效应之前，可以获得大量（多达数百次）的记录4, 6, 12, 13。目前，我们利用在接近最优波长下具有卓越亮度和稳定性的激光光源，以最大化Vm-成像技术的灵敏度。当前的灵敏度允许对神经元所有部分（包括轴突及轴突侧支、末端树突分支以及单个树突棘）的Vm瞬变进行多点光学记录。所获取的信号相互作用信息既可进行定量分析，也可直接以视频形式可视化呈现。

成功的共聚焦显微镜观察应能够清晰识别出靠近脑片表面且位于同一焦平面内的完整神经元突起。在加载电压敏感性染料之前，选择适合进行电压成像的神经元至关重要。图2展示了皮层脑片中表达EGFP的L5锥体神经元的共聚焦图像（Crym转基因小鼠品系）。单个神经元的轴突清晰可见。选择那些在靠近脑片表面的同一焦平面内具有长而完整轴突的细胞（白色箭头所示）。
<img alt="荧光显微镜下的神经元结构；树突可视化，50 μm 比例尺，科学研究。" src="/files/ftp_upload/4261/4261fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 用于轴突动作电位信号膜电位（Vm）成像的第5层皮层神经元筛选。同一脑片区域的低倍（左）和高倍（右）放大图像；使用Yokogawa转盘扫描仪，488 nm激发光。
<p class="jove_...

本文描述了一种用于监测膜电位变化的成像技术，其空间分辨率达到亚微米级，时间分辨率达到亚毫秒级。该技术基于激光激发电压敏感性染料，可对轴突及轴突侧支、终末树突分支以及单个树突棘中的信号进行测量。

理解单个神经元的生物物理特性、功能组织及其信息处理机制，是理解……的基础

所述实验的总体目标是利用光学方法，以亚微米和亚毫秒级分辨率，从神经元多个位点对单个神经细胞的膜电位信号整合及信息处理过程进行监测。首先需构建一个具有适当灵敏度的成像系统，以记录与膜电位瞬变相对应的微弱光强变化；随后，选择具有合适形态结构的神经元，使其具有较长且完整的突起，并位于切片表面附近单一焦平面上，以实现高效成像。然后用膜电位敏感染料加载预先选定的神经元，以实现对膜电位变化的光学追踪。结果表明，该方法具有独特的能力，可通过监测轴突、树突和树突棘的膜电位信号，获取单个神经细胞电信号整合的信息。在细胞神经生理学中。由于传统电生理学存在两个长期局限性——电极测量的空间分辨率低，以及无法记录轴突侧支或树突棘等微小结构的信号，新的研究工具正在被开发。为克服这些缺点，可将膜片钳电极技术与光学方法相结合，从而实现对神经元所有部分进行并行记录。本文介绍了一种此类技术：以单个树突棘分辨率对膜电位瞬变进行多侧面光学记录。本实验中，使用正置显微镜和三台相机来调节均匀照明。首先，在激光光路中插入适当的中性密度滤光片。然后，将物镜聚焦在标准荧光载玻片的表面。在监视器屏幕上观察视场的CCD图像时，通过调节落射荧光聚光镜上的相应驱动装置，调整石英导光管接收端和输出端的位置，以实现视场内照明的居中且均匀。为测定振动噪声，使用表面带有非荧光标记的标准荧光载玻片，在神经CCD的连续模式下记录光强度。将物镜聚焦在黑色标记的暗边缘处，并以每秒2000帧的速率记录约100毫秒的光强。然后显示来自均匀照明区域约20个像素的归一化光强轨迹的空间平均值，以及沿黑色标记边缘约20个像素的归一化光强轨迹的空间平均值。在高对比度边缘处像素的空间平均值中出现的额外噪声反映了系统的振动噪声。必须将机械快门安装在隔振台之外，以确保快门开启时不会在光学记录中引入振动噪声。这是关键步骤。使用塑料螺钉和隔振材料安装快门，以减少光学记录系统可能接收到的声学振动噪声。为隔离振动，调节隔振台直至覆盖图像锐利边缘的像素振动噪声小于散粒噪声。台面上的设备线缆必须保持松弛，以避免将机械振动传递至显微镜。本实验步骤中，按照标准操作制备厚度为 300 至 400 微米的脑切片，使用在特定神经元中表达 EGFP 的小鼠品系，并结合转盘共聚焦成像系统进行观察。在切片中观察 EGFP 标记的神经元。接着，选择具有完整树突和轴突结构、且其突起与切片表面平行并靠近表面的神经元，用于膜电位成像。然后，通过施加约 15 秒的负压，从尖端开始用不含染料的细胞内液填充玻璃膜片电极，直至电极锥形部分的三分之二处。随后，用含有膜通透性电压敏感染料的细胞内溶液回填电极。现在，在将染料装入电极后一分钟内，对预先选定的神经元进行贴附。在将移液管放入灌流槽之前，施加约10毫米汞柱的低正压，并在将电极定位至脑片过程中保持该压力，以确保在形成封接前无染料从电极中泄漏。

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