利用膜片钳电生理学和压力肌动图研究动脉平滑肌Kv7钾通道功能

本实验的总体目标是测量 freshly dissociated 肠系膜动脉平滑肌细胞中 KV 七型钾通道的活性，并将其与生理条件下记录的动脉直径变化相关联。首先通过手术从大鼠体内取出肠系膜血管弓，第二步是分离并清理肠系膜动脉的血管段。

接下来，利用部分血管段分离单个平滑肌细胞，用于膜片钳电生理记录KV7钾通道电流。最后一步是将完整的动脉段进行套管插管，以通过压力肌动图检测动脉在KV7钾通道药理学调节剂作用下的收缩或舒张反应。最终，结合膜片钳电生理技术和压力肌动图，揭示KV7钾通道活性的增强或减弱如何影响肠系膜动脉的收缩功能。

与现有方法（如使用在细胞系中表达的克隆通道）相比，该技术的主要优势在于记录的是来自非培养细胞的电流，这些细胞天然表达通道，并且可将 KV 电流与其他可能在同一细胞中被激活的钾通道类型分离开来。压力肌动图技术能够从分离细胞所来源的同一组织中记录其功能反应，该方法相较于动脉环或动脉条等其他制备方式，具有更高的敏感性和更接近生理状态的特点。我实验室的博士后研究员 Dr. Bareth Mani 将演示动脉插管和压力肌动图技术，我实验室的研究助理教授 Dr. Luba Brueggeman 将演示细胞分离和膜片钳制备操作。

开始此操作时，使用手术剪在大鼠小肠两端各截取10至12厘米的肠段。然后连同其附着的血管一起分离小肠。接下来，将小肠段固定在固定板上。

将肠系膜铺展在灌流室的近侧，使肠系膜上动脉的主干位于中央，其二至四级分支由中心向外周呈放射状延伸。然后在解剖显微镜照明下，仅将固定针插入可见的肠段部分。使用显微镊子和显微剪刀，仔细清除靠近肠道的二至四级动脉周围的脂肪组织和结缔组织。

握住邻近的静脉，以方便清除脂肪组织和结缔组织，并避免动脉受到不必要的牵拉。随后将两到三段肠系膜动脉转移至一个含有2毫升冰浴分离液的35毫米组织培养皿中。之后将培养皿置于冰上，使用带有火焰抛光尖端的移液管将肠系膜动脉段切成3至4毫米长的小段。

将动脉节段转移至含有两毫升预热至37摄氏度分离液的玻璃小瓶中。随后在37摄氏度下孵育30分钟。30分钟后，用移液枪小心吸除37摄氏度的分离液。

加入 2 mL 温热的酶溶液，然后在 37 摄氏度下孵育 35 分钟。酶溶液孵育 35 分钟后，立即将小管置于冰上，吸除酶溶液，并加入 2 mL 冰冷的分离溶液。重复此步骤四次。

然后，在1毫升冰冷的分离液中，用抛光的后部移液管轻轻吹打动脉节段10至20次，以分离出单个肠系膜动脉平滑肌细胞。定期取一滴细胞悬液置于35毫米培养皿中，在显微镜下观察，以确认肌细胞的形态。

健康的MA SMC应具有光滑的细长形态。接下来，用抛光的巴斯德移液管将约100至200微升细胞悬液转移至记录室，并让细胞贴壁15分钟。在此步骤中，将膜片移液管的尖端浸入两性霉素B无内液溶液中，使移液管尖端充满该溶液。

然后，使用一段连接的管路将10毫升注射器接到另一端，从顶部向含有试剂B的移液管溶液中施加负压。使用Einor微载移液枪头，直至移液管中溶液填充至约一半体积。轻轻敲击移液管，以去除任何气泡。

随后，将移液管插入电极架中。使用显微操作器将移液管缓慢下降至细长心肌细胞表面。当移液管电阻升高至6到10兆欧时，施加负压以形成吉欧封接。

同时，在等待膜穿孔期间，将钳制电压设为零毫伏。接着，施加持续100毫秒的电压阶跃，先至正10毫伏，再至负10毫伏。使用放大器补偿与全细胞电容同时出现的快速移液管电容瞬变。

微弱、持续的瞬时正向电流，大小为2至10皮安，其存在和幅度表明功能性KV7通道的存在。使用两性霉素B成功穿孔后，通路电阻将降低至35兆欧姆或更低。为记录KV7电流的电压关系，施加持续5秒的电压阶跃，电压范围从-84毫伏（此时KV7通道开放概率最低）至+16毫伏（此时KV7通道开放概率达到平台期）。在每个测试电压下维持5秒后，返回至-4毫伏的保持电压，持续10秒。

在此操作中，将预先制备好的细尼龙缝线在两侧各松松地悬挂两根。用显微镊夹住分离出的肠系膜动脉段一端，在玻璃插管附近小心地将该动脉段从解剖槽转移至压力肌动描记装置槽中。接着，在透射光源解剖显微镜下观察，夹住动脉段的一端，并轻轻将其套入左侧玻璃插管上。

使用尼龙缝线固定末端。然后轻轻冲洗灌注血管的管腔液体，以清除血液和碎片。随后关闭左侧注射器的阀门，使该侧形成静止的液柱，通过右侧调节压力，使用显微操作器将可移动的右侧玻璃套管靠近动脉节段，并将节段的右端拉至套管上。

最后，用尼龙缝线固定动脉段，并剪去多余的缝线。现在将压力图记录单元安装在压力显微镜上方的载物台上。将压力柱连接到图记录室的右侧，然后将盖子盖在记录室上。

在15分钟内逐渐升高10毫升注射器，检查血管装置是否存在任何泄漏，直至P1压力传感器读数达到80毫米汞柱；必要时调整套管之间的距离，调整时应使加压的动脉节段大致呈直线，并在结扎处形成类似肩部的形态。通过瞬时灌流60毫摩尔氯化钾溶液30秒，检测安装好的血管的活性。活性良好的血管在加入氯化钾后会迅速收缩，并在洗脱后立即舒张。

接下来，将浓缩的待测物质直接加入浴液中，并在腔室末端附近轻轻反复吹打，以使待测物质与浴液充分混匀，从而在10毫升的腔室中达到适当的终浓度。加入待测物质后，血管直径的变化可在实验进行过程中通过实时视频图像进行监测，同时也可在图像分析窗口中绘制成图表。该图显示了在单个肠系膜动脉肌细胞中，处理前（黑色曲线）和加入100 nmol/L锌离子并达到稳定状态后（红色曲线）响应电压阶跃所记录的一系列连续电流轨迹，此处展示的是对照组和100 nmol/L锌离子条件下的代表性电流。

灰色条表示测量平均电流幅度的时间区间。对于电流-电压曲线图，阶跃电压由右侧的箭头指示。这是在–20毫伏持续电压钳制条件下测得的100纳摩尔锌离子对KV7电流增强作用的时间过程。此处显示的是基于KV7电流密度得出的平均电流-电压曲线，这些数据记录于处理前、100纳摩尔锌离子处理期间，以及10微摩尔KV7通道阻断剂XC 991处理期间。锌离子诱导由100皮摩尔精氨酸加压素预收缩的肠系膜动脉的舒张。

该图显示了血管外径在施加100皮摩尔精氨酸加压素后，继而施加100纳摩尔锌离子时的变化过程。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备动脉以分离单个细胞，或用于动脉收缩和舒张反应的压力肌图测量。此外，您还应掌握如何在 freshly 分离的动脉平滑肌细胞中记录KV7电流，并将其与其他电流分离开来。