DNA双链的迭代优化以促进SeqA-DNA复合物的结晶

本实验详细介绍了如何获得含有串联半甲基化GATC重复序列的蛋白-DNA复合物的衍射级晶体，以促进蛋白-DNA复合物的晶体堆积。首先合理设计DNA长度、GATC序列间距及DNA末端，随后使用互补的单链寡核苷酸纯化DNA，再退火形成半甲基化DNA双链，最后加入纯化的SeqA蛋白以形成复合物。

接下来，通过使用商业化稀疏矩阵筛选试剂盒进行结晶试验，寻找生长蛋白质-DNA复合物衍射级晶体的最优条件。展示实验结果，并分享DNA长度、GATC序列间距及末端结构的变化对CQ A DNA晶体衍射质量的影响。

本研究的目标是获得可用于衍射分析的CK与DNA复合物的晶体，同时也有助于理解在设计用于其他蛋白质-DNA复合物结晶的DNA双链时需要考虑的一般变量。本实验操作流程将由我实验室的博士生Chang, A使用。本研究采用了一种DNA复制调控蛋白的变体——Seek a，该蛋白可形成稳定的二聚体，并且其二聚化结构域与DNA结合结构域之间的连接区较短。

该变体将 DNA 结合限制于由 DNA 上一个螺旋间隔分隔的串联 GATC 重复序列。首先，将含有在 T7 启动子控制下编码 DEMETRIC seq A 的质粒转化至 BBL 20 1D 三型细胞中。将转化反应物涂布于含有 100 微克/毫升氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上，并置于细菌培养箱中过夜培养。挑取混合菌落，开始小规模过夜培养。

次日早晨，用10毫升过夜培养的接种物接种一升培养液。当培养物处于对数生长期时，加入2毫升0.5摩尔的IPTG以诱导蛋白表达。随后在37°C摇床中继续孵育三小时。

然后在3,300 ×g条件下离心10分钟，收集细胞。将细胞沉淀重悬于纯化缓冲液中，通过超声处理裂解，并在39,000 ×g条件下离心40分钟，清除裂解液。随后将上清液上样至预先用纯化缓冲液平衡的肝素柱。

为了洗脱CK蛋白，使用线性梯度洗脱至1摩尔氯化钠，CK蛋白在约0.7摩尔氯化钠时被洗脱。收集含有CK的组分，并进行稀释以降低样品的离子强度。

然后将样品上样至已用纯化缓冲液平衡的阳离子交换层析柱 E。施加线性盐梯度以洗脱纯的 CK 蛋白，洗脱峰约在 0.4 mol/L 氯化钠处。合并含有 CK 的组分。

浓缩至三毫克每毫升，并在储存条件下保存。缓冲液设计需包含互补的非甲基化和甲基化寡核苷酸。将每种冻干的单链DNA各一微摩尔溶于800微升经高压灭菌的双蒸水中，涡旋混匀，静置15分钟，现用800微升。

对于长度为20至30个核苷酸的寡核苷酸样品，向每个样品中加入两倍体积的上样缓冲液并预先加热。制备一块较大的10%变性凝胶。待凝胶聚合后，取出梳子并彻底冲洗加样孔。将凝胶组装好，用一倍浓度的TBE电泳缓冲液注满上下两个电泳槽。

以750伏预电泳，使凝胶升温至55摄氏度。然后停止电泳，并用运行缓冲液彻底冲洗加样孔。现在将寡核苷酸在90摄氏度加热两分钟。

涡旋并离心。立即将样品上样至凝胶。以约700伏电压电泳，直至寡核苷酸迁移。

在10%聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝的迁移位置相当于约20个碱基长度的寡核苷酸，而二甲苯蓝的迁移位置相当于约60个碱基长度的寡核苷酸。将凝胶从装置上拆下，并在平坦表面上移除间隔条。取下一块玻璃板，用塑料膜覆盖凝胶。

然后将凝胶翻转，取下另一块玻璃板，并用塑料膜覆盖凝胶。接着，使用紫外光和凝胶背后的荧光板标记条带。用剃刀观察DNA阴影，切下目标条带并将其切成小块。

将每个样品转移至无菌的15毫升离心管中。加入9毫升洗脱缓冲液，在37摄氏度下振荡过夜稀释。使用加样吸头小心地将溶液转移至高压灭菌的离心管中。

为避免转移丙烯酰胺碎片，加入1 mL 3 mM乙酸钠（pH 7）和25 mL预冷的100%乙醇，在-20 °C孵育至少3小时。离心沉淀DNA，然后在中等加热条件下用真空浓缩仪干燥沉淀物，将每个沉淀重悬于400 µL经高压灭菌的双蒸水中，并转移至新离心管中。

加入40微升pH为7的3摩尔乙酸钠和1毫升100%乙醇，涡旋混匀，在-20摄氏度孵育30分钟，然后在18,000 × g离心15分钟。用100微升70%冷乙醇清洗DNA沉淀，以去除任何残留盐分，在18,000 × g离心6分钟，随后弃去乙醇，并在真空浓缩仪中干燥沉淀。

现在将每个沉淀重悬于100 µL灭菌双蒸水中。通过光谱法测定寡核苷酸的浓度。为制备半甲基化DNA双链，首先将等摩尔浓度的互补单链混合。

然后将混合物在水浴中加热至95摄氏度，持续5分钟，以变性DNA链。让样品在水浴中缓慢冷却至室温。取等体积的81微摩尔纯化的CQ蛋白溶液与81微摩尔半甲基化DNA混合。

然后在室温下孵育15分钟。将样品储存于4摄氏度直至使用，利用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒筛选结晶条件。一旦确定初步的结晶条件，需优化条件以获得可用于衍射的晶体。对所得的CK DNA晶体进行冷冻保护处理。

可将结晶溶液中 PEG 400 的含量增加至终浓度 25%，或向结晶溶液中添加 20% 甘油。用尼龙环快速捞取单个晶体。将样品在液氮中冷冻。

现在在 100 K 下测试每颗晶体的衍射极限。为了获得 CK 缩短突变体与半甲基化 DNA 结合的晶体结构，我们连续优化了 DNA 上的三个参数：半甲基化 GATC 序列之间的间距、双链的长度，以及是否存在 5' 突出端。本研究使用了一种 DME 变体的 seek a，其末端结构域含有一个点突变，可阻止进一步的连接化，同时采用缩短的连接子，将 DNA 结合限制在串联序列上。

DNA电泳迁移率偏移实验表明，GATC重复序列仅在相隔一个螺旋周期时，修饰后的CK蛋白才会优先结合于相隔9至10个碱基对的GATC重复序列。因此，初步筛选采用长度为23至24个碱基对的双链寡核苷酸，其中包含两个半甲基化的GATC重复序列，且这两个重复序列之间相隔9或10个碱基对。

三个双链体均获得了形态良好的晶体，但这些晶体均未获得高分辨率衍射数据。实验结果表明，A-G-A-T-C序列间隔九个碱基对更有利于结晶，出乎意料地增强了沟槽骨架相互作用；在两个GATC位点之间引入一个CG二核苷酸并未改变晶体的衍射极限。

相比之下，优化突出端的长度显著改变了分子间接触和晶体形态。该CK蛋白与半甲基化DNA双链结合的晶体结构证实，尽管蛋白质与DNA的相对尺寸较大，DNA双链的游离面并未参与晶体接触，大多数对称相关分子间的相互作用均由蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA相互作用介导。有趣的是，在此特定情况下，5′端二核苷酸突出端的有利效应并非源于形成拟连续的DNA结构。

相反，甲基化链的5'端从DNA轴向外延伸，并与复合物中相邻的CK分子相互作用，这解释了为何严格需要两个核苷酸来改变晶体堆积方式。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化蛋白质以及如何设计用于蛋白质-DNA复合物结晶的DNA双链。需要牢记的是，尽管本实验方案旨在用于CK-DNA复合物的结晶，但对DNA长度、序列和末端进行理性优化的方法，为其他蛋白质-DNA复合物结晶所用DNA双链的设计提供了一个通用框架。