Name: 迭代优化的DNA双链的SeqA-DNA复合物的结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习优化DNA长度、GATC间距和末端设计以获得SeqA-DNA复合物的高质量衍射晶体。本方法通过理性设计半甲基化DNA双链，结合稀疏矩阵筛选，为蛋白质-DNA复合物结晶提供通用框架。

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作者感谢NSLS（布鲁克海文国家实验室）PXRR工作人员在数据收集过程中提供的帮助，以及Monica Pillon在DNA纯化方面的协助。本工作由加拿大卫生研究院（MOP 67189）提供资助。

1. 蛋白质纯化
SeqA蛋白的N端（寡聚化结构域）与C端（DNA结合结构域）之间由一段柔性连接区相连，有助于识别DNA上相隔一到三个螺旋圈的半甲基化GATC重复序列。在本研究中，我们使用了一种SeqA的二聚体变体（SeqAΔ(41-59)-A25R），其N端结构域含有一个点突变，可阻止进一步的寡聚化，同时连接区较短，使得该蛋白仅能结合DNA上恰好相隔一个螺旋圈的串联GATC重复序列（图1）2,8。
<ol>
 <li>将带有T7启动子控制的SeqA编码质粒转化至BL21 (DE3)感受态细胞中，</li>
 <li>将转化产物涂布于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，</li>
 <li>挑取混合菌落接种至含100 μg/ml氨苄青霉素的小规模LB培养基中，过夜培养，</li>
 <li>次日用过夜培养物以1:100的比例接种1 L新鲜培养基，</li>
 <li>将细胞培养至OD600约为0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mM以诱导蛋白表达，</li>
 <li>在37 °C下继续振荡培养3小时，随后通过离心（3,300 g，10分钟）收集细胞，</li>
 <li>用纯化缓冲液A重悬菌体沉淀，并通过超声破碎细胞，</li>
 <li>将裂解液离心（39,000 g，40分钟）澄清后，上清液上样至已用纯化缓冲液平衡的肝素柱，</li>
 <li>采用线性梯度洗脱至1 M NaCl（SeqA在约0.7 M NaCl时洗脱），</li>
 <li>合并含SeqA的洗脱组分，稀释以降低样品离子强度，然后上样至已用纯化缓冲液平衡的阳离子交换层析柱，</li>
 <li>通过线性盐梯度洗脱，纯化的SeqA在约0.4 M NaCl时洗脱，</li>
 <li>合并含SeqA的组分，浓缩至3 mg/ml，并储存于储存缓冲液中。</li>
</ol>
2. DNA 纯化
<ol>
 <li>从您常用公司订购互补的未甲基化和甲基化寡核苷酸，</li>
 <li>将每种冻干的单链DNA 1 μmol溶解于800 μl灭菌去离子水（ddH2O）中，涡旋混匀并静置10–20分钟，</li>
 <li>向每种寡核苷酸中加入800 μl预热的2×上样缓冲液，</li>
 <li>对于长度为20–30个核苷酸的寡核苷酸，制备一块较大的10%变性凝胶（160 × 250 × 1 mm）： 
 * 每块凝胶中充分混合80 ml 10% PAGE混合液、80 μl TEMED和800 μl过硫酸铵，混匀后灌胶， 
 * 待凝胶聚合后，取出梳子，并用ddH2O彻底冲洗加样孔， 
 * 将凝胶安装至凝胶模具中（含冷却板），然后向上下储液槽中加入电泳缓冲液（1× TBE）， 
 * 以700–750 V预电泳，使凝胶温度升至55 °C， 
 * 停止电泳，并用运行缓冲液彻底冲洗加样孔。</li>
 <li>将寡核苷酸在90 °C加热2分钟，</li>
 <li>涡旋混匀样品并短暂离心，立即上样至凝胶，</li>
 <li>以约700 V电压进行电泳，当寡核苷酸迁移至凝胶中部时停止（注意：在10%聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝与约20个碱基长的寡核苷酸共迁移，二甲苯青FF与约60个碱基长的寡核苷酸共迁移），</li>
 <li>停止电泳，从电泳槽中拆下凝胶并移除间隔条，</li>
 <li>在平坦表面上取下一块玻璃板，用保鲜膜覆盖凝胶，</li>
 <li>将凝胶翻转，取下另一块玻璃板，并用保鲜膜覆盖，</li>
 <li>使用紫外灯和凝胶后方的荧光板标记条带，以观察DNA阴影，</li>
 <li>用剃刀将目标条带切下并切成小块，转移至无菌15 ml离心管中，</li>
 <li>加入9 ml洗脱缓冲液，于37 °C振荡过夜洗脱，</li>
 <li>用移液枪尖小心将溶液转移至灭菌离心管中，避免转移丙烯酰胺碎片，然后加入1 ml pH 7的3 M醋酸钠（1:10稀释）和25 ml预冷的100%乙醇（2.5倍体积），</li>
 <li>于-20 °C孵育至少3小时，</li>
 <li>离心后将上清液转移至另一管中，</li>
 <li>在中等加热条件下用真空浓缩仪干燥沉淀，</li>
 <li>将沉淀重悬于400 μl灭菌去离子水（ddH2O）中，并转移至新离心管，</li>
 <li>加入40 μl pH 7的3 M醋酸钠和1 ml 100%乙醇；充分混匀（涡旋），室温孵育30分钟，随后于-20 °C孵育30分钟，</li>
 <li>在18,000 g下离心15分钟，弃去上清液，</li>
 <li>用100 μl预冷的70%乙醇洗涤沉淀，以去除残留盐分，在18,000 g下离心6分钟，弃去乙醇，并用真空浓缩仪干燥沉淀，</li>
 <li>将沉淀重悬于总共100 μl灭菌去离子水（ddH2O）中，测定寡核苷酸浓度，</li>
 <li>为退火半甲基化DNA双链，将互补单链以等摩尔浓度混合，在水浴中95 °C加热5分钟，随后让混合物在水浴中缓慢冷却至室温。</li>
</ol>
3. 蛋白质-DNA 复合物的形成与分析
<ol>
 <li>取等体积的纯化 SeqAΔ(41-59)-A25（81 μM）与半甲基化 DNA（81 μM）混合，</li>
 <li>室温孵育 15 分钟，随后于 4 °C 保存，直至准备使用，</li>
 <li>使用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒筛选结晶条件，</li>
 <li>在获得初步结晶苗头后，优化条件以获得可用于衍射的优质晶体，</li>
 <li>通过将结晶溶液中 PEG 400 的终浓度提高至 25%（v/v），或向结晶溶液中添加 20% 甘油（v/v），对所得的 SeqA-DNA 晶体进行冷冻保护，</li>
 <li>用尼龙环捞取单个晶体，并在液氮中快速冷冻，</li>
 <li>在 100 K 条件下检测每颗晶体的衍射能力。</li>
</ol>
4. 代表性结果
为了获得SeqAΔ(41-59)-A25R与半甲基化DNA结合的晶体结构，我们依次优化了DNA的三个参数：（i）半甲基化GATC序列之间的间隔；（ii）双链的长度；（iii）5'突出端的有无。
电泳迁移率偏移实验表明，SeqAΔ(41-59)-A25R 优先结合间隔为 9-10 个碱基对的 GATC 重复序列（图 1）。因此，我们最初筛选了长度为 23-24 个碱基对（bps）的双链 DNA，其中包含两个半甲基化的 GATC 序列，且两者之间间隔为 9 或 10 个 bps。三种双链产生了形态良好的晶体（图 2）。尽管这些晶体均未达到高分辨率衍射，但长度为 23 个 bps 且两个 GATC 位点间隔为 9 个 bps 的双链衍射 X 射线的效果优于其他样品，表明 9 个 bps 的 GATC 间隔更有利于结晶。因此，我们在后续所有筛选中固定 GATC 位点间的间隔为 9 个 bps。
通常，当双链DNA的长度恰好对应于完整的螺旋圈数时，更有利于其结晶，因为多个DNA分子能够首尾堆叠，从而在晶体中形成连续的B型DNA结构9因此，我们将双链的整体长度缩短至21 bp（即 两个螺旋周期）。尽管具有平末端的21个碱基对（bps）双链未能获得可用于衍射的晶体（数据未显示），但两端各带有一个5'突出核苷酸的21 bps双链却成功获得了晶体，且在我们的实验室X射线源下衍射至5 Å分辨率。衍射极限的改善表明，双链末端之间的相互连接确实在促进晶体堆积。
由于SeqA与位于DNA同一面的GATC序列相互作用，因此DNA双链的另一面应暴露于溶剂中。为了进一步改善该复合物的晶体质量，我们随后修改了双链序列，在两个GATC位点之间引入一个CG二核苷酸，以通过双链的相反面促进相邻DNA分子之间的沟槽-骨架相互作用，该方法此前已被用于增强DNA结晶10。然而，含有CG二核苷酸的双链所生长出的晶体衍射极限与不含CG二核苷酸的类似DNA双链所生长出的晶体相同（图3）。该结果表明，在此情况下沟槽-骨架相互作用并不重要。随后，我们通过比较在每条5'端各增加两个核苷酸的DNA双链所生长的晶体，优化了突出端的长度。这一改变对晶体形态以及衍射极限均产生了显著影响，表明额外的核苷酸显著改变了分子间接触并增强了晶体的有序性（图3）。
SeqAΔ(41-59)-A25R 与最后一条 DNA 双链结合的晶体结构证实，DNA 双链的游离面未参与晶格接触，这与引入 CG 二核苷酸所产生的有限影响相符。尽管蛋白质与 DNA 的相对尺寸较大，但大多数对称相关分子间的相互作用均由蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA 相互作用介导（图4）。有趣的是，在此特定情况下，5' 端二核苷酸突出端的有利作用并非源于形成拟连续 DNA 结构，而是因为甲基化链的 5' 端从 DNA 轴向外延伸，并与复合物中相邻的 SeqA 分子发生相互作用，这解释了为何严格需要两个核苷酸才能改变晶体堆积方式8,11。
<img alt="SeqA-DNA复合物分析；凝胶电泳结果；寡聚化，GATC识别位点。" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. SeqAΔ(41-59)-A25R与半甲基化DNA的结合。(A) 介导SeqA蛋白寡聚化和DNA结合的结构域示意图。(B) SeqAΔ(41-59)-A25R与含有两个半甲基化GATC序列的DNA进行电泳迁移率变动分析，两个GATC序列之间的碱基对数目（X）逐渐增加。最左侧泳道（标记为Blank）包含等摩尔混合的DNA，其两个GATC序列之间的间隔分别为5、7、12、21、25和34个碱基对，且未加入SeqAΔ(41-59)-A25R。(C) 为获得可用于衍射的晶体，在DNA双链上优化的三个变量示意图。
<img alt="晶体学数据表：DNA序列、晶体图像、衍射图样、分辨率极限。" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig2.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 改变GATC位点间距的影响。 总结了所使用的寡核苷酸以及通过含有两个半甲基化GATC位点、长度为23-24 bp的双链DNA获得的晶体，其中GATC位点之间相隔9或10个碱基对。所有晶体图像均在相同放大倍数下拍摄，比例尺表示100 μm。每个SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA晶体的分辨率极限均基于在Rigaku RU-300 X射线发生器系统上收集的衍射图像确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="DNA序列分析、晶体生长结果、衍射图样、埃单位的分辨率极限。" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. DNA末端变化的影响。 本图总结了所使用的寡核苷酸以及通过包含两个半甲基化GATC位点（相隔9个碱基对）且具有0、1或2个核苷酸5'端突出的21 bp双链DNA获得的晶体。所有晶体图像均在相同放大倍数下拍摄，比例尺表示100 μm。每个SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA晶体的分辨率极限基于在NSLS（BNL）的X12C和X29线站收集的衍射图像确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="蛋白质-DNA复合物结构示意图，展示不同视角下的分子相互作用模型。" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. SeqAΔ(41-59)-A25R与带有二核苷酸突出端的DNA结合后的晶体堆积结构：从（A）顶部和（B）侧面观察。不对称单元包含两个SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA复合物，其中蛋白质以灰色显示，DNA以橙色显示。对称相关的SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA分子中，蛋白质部分以白色显示，DNA部分以黄色显示。本图使用PyMOL12绘制。该图与视频1相关。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
视频 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank"> 点击此处观看视频</a>。

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<li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

大分子X射线晶体学面临的最大挑战之一是获得可用于衍射的高质量晶体。对于蛋白质或蛋白质-DNA复合物而言，由于需要优化的变量更多，这一挑战尤为突出。人们普遍认为，DNA的长度以及是否存在黏性末端以促进相邻DNA分子形成更长的伪双链结构，是需要优化的主要参数。然而，我们已证明，这些黏性末端的性质和长度可能对蛋白质-DNA复合物的晶体堆积产生额外影响。尽管本实验方案最初是为结晶SeqA-DNA复合物而设计，但通过对DNA长度、序列及末端的优化，为任何DNA-蛋白质复合物结晶所用寡核苷酸的理性设计提供了一个通用框架。

<table><tbody><tr><td>TRIS</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>卡利登</td><td>5350-1</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.500</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Bioshop</td><td>URE001.5</td><td></td></tr><tr><td>40% 29:1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>A0007-500ml</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>EMD</td><td>BX0865-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青FF</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0423</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bioshop</td><td>BR0222</td><td></td></tr><tr><td>双可调垂直电泳系统</td><td>C.B.C. Scientific Company Inc.</td><td>DASG-250</td><td></td></tr><tr><td>索引结晶筛选</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Wizard I 结晶筛选试剂盒</td><td>Emerald BioSystems</td><td>EBS-WIZ-1</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Wizard II 结晶筛选试剂盒</td><td>Emerald BioSystems</td><td>EBS-WIZ-2</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>经典结晶筛选实验板</td><td>Qiagen</td><td>130701</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Intelliplate 培养板 </td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-00</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;溶液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;蛋白纯化缓冲液： &lt;/strong&gt;100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT 和 5% 甘油&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;蛋白储存缓冲液： &lt;/strong&gt;20 mM TRIS（pH 8）、150 mM NaCl、5 mM DTT、0.5 mM EDTA 和 5% 甘油&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;上样缓冲液： &lt;/strong&gt;加入20 g蔗糖、25 mg溴酚蓝、25 mg二甲苯蓝FF、1 ml 10% w/v SDS和10 ml 10X TBE至70 ml经高压灭菌的ddH₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 轻轻加热搅拌，直至蔗糖完全溶解，并用灭菌去离子水定容至 100 ml。&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 4℃保存 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;2X 上样缓冲液：&lt;/strong&gt; 将11 g尿素加入10 ml上样缓冲液中，在加热板上搅拌至尿素完全溶解。分装至2 ml离心管中，4 ℃保存 &amp;deg;C. &lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;10X PAGE 混合液：&lt;/strong&gt; 将420.4 g尿素、100 ml 10× TBE（已高压灭菌）、250 ml 40% 29:1 Bis/丙烯酰胺溶于ddH₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 搅拌至完全溶解，并定容至 1 升。4 ℃避光保存。 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;10X TBE： &lt;/strong&gt;溶解&lt;强&gt; &lt;/strong&gt;108 g&lt;强&gt; &lt;/strong&gt;TRIS 55 g，硼酸 55 g，EDTA 9.3 g，溶于 1 升 ddH₂O 中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 高压灭菌并在室温下保存。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;洗脱缓冲液： &lt;/strong&gt;将 8 ml 5 M NaCl、2 ml 1 M TRIS（pH 7.5）、0.4 ml 0.5 M EDTA（pH 8）加入 200 ml ddH₂O 中稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 高压灭菌并在室温下保存。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

dna双链的迭代优化以促进seqa-dna复合物的结晶

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

大肠杆菌（Escherichia coli）SeqA 是 DNA 复制的负调控因子，通过结合复制起点内半甲基化的 GATC 位点簇，阻止复制的过早重新起始1。在复制起点之外，SeqA 也存在于复制叉处，可将新复制的 DNA 组织成更高阶的结构2。SeqA 与单个 GATC 序列的结合较弱，但能与包含多个 GATC 位点的 DNA 双链形成高亲和力复合物。SeqA 的最小功能与结构单元是二聚体，这解释了其与半甲基化 DNA 形成高亲和力复合物至少需要两个 GATC 序列的原因3。此外，SeqA 的结构包含通过柔性连接区分开的寡聚化结构域和 DNA 结合结构域，使其能够结合相隔最多三个螺旋周期的 GATC 重复序列。因此，要在分子水平上理解 SeqA 的功能，必须对 SeqA 与多个 GATC 序列结合的结构进行分析。在蛋白质-DNA 共结晶过程中，DNA 对晶体堆积相互作用的影响可从无到显著，具体取决于蛋白质与 DNA 的相对大小及结构。若蛋白质大于 DNA 或几乎覆盖整个 DNA，则晶体堆积主要由蛋白质-蛋白质相互作用介导。相反，当蛋白质与 DNA 大小相近或更小，或仅覆盖 DNA 的一部分时，晶体堆积则主要由 DNA-DNA 和 DNA-蛋白质相互作用主导。因此，蛋白质-DNA 复合物的结晶需要系统地筛选 DNA 长度4以及 DNA 末端类型（平末端或突出末端）5-7。本报告中，我们描述了如何设计、优化、纯化并结晶包含串联 GATC 重复序列的半甲基化 DNA 双链，使其与一种二聚体形式的 SeqA 变体（SeqAΔ(41-59)-A25R）形成复合物，以获得适用于结构解析的晶体。

蛋白质–DNA 复合物的晶体结构可为蛋白质的功能、作用机制以及特异性相互作用的性质提供深入见解。本文中，我们报道了如何优化双链 DNA 的长度、序列和末端，以实现与大肠杆菌（Escherichia coli）复制起始负调控因子 SeqA 的共结晶。

DNA双链的迭代优化以促进SeqA-DNA复合物的结晶

大肠杆菌 SeqA 是一种 DNA 复制负调控因子，通过结合半甲基化的 GATC 位点簇来阻止复制的过早重新起始……

本实验详细介绍了如何获得含有串联半甲基化 GATC 重复序列的蛋白质-DNA 复合物的衍射级晶体，以促进蛋白质-DNA 复合物的晶体堆积。首先合理设计 DNA 长度、GATC 间距和 DNA 末端，接着使用互补的单链寡核苷酸纯化 DNA，然后退火形成半甲基化 DNA 双链，最后加入纯化的 SeqA 蛋白以形成复合物。接下来，通过使用商业化稀疏矩阵筛选试剂盒进行结晶试验，寻找生长蛋白质-DNA复合物衍射级晶体的最优条件。展示实验结果，并分享DNA长度、GATC间距及末端结构的变化对CQ A DNA晶体衍射质量的影响。本研究的目标是获得可用于衍射分析的CK与DNA复合物晶体，同时也有助于理解在设计用于其他蛋白质-DNA复合物结晶的DNA双链时需要考虑的一般变量。本实验操作流程将由我实验室的博士生Chang, A使用。本研究采用了一种DNA复制调控蛋白的变体——Seek a，该蛋白可形成稳定的二聚体，并且其二聚化结构域与DNA结合结构域之间的连接区较短。该变体将DNA结合限制在由DNA上相隔一个完整螺旋的串联GATC重复序列上。首先，用含有在T7启动子控制下编码DEMETRIC seq A的质粒转化BBL 20 1D三型细胞。将转化反应物涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并置于细菌培养箱中过夜培养。挑取混合菌落，开始小规模过夜培养。第二天早晨，用10毫升过夜培养的接种物接种一升培养液。当培养物处于对数生长期时，加入2毫升0.5摩尔的IPTG以诱导蛋白表达。随后在37摄氏度的摇床中继续培养三小时。然后在3,300 ×g条件下离心10分钟，收集细胞。将细胞沉淀重悬于纯化缓冲液中，通过超声处理裂解细胞，并在39,000 ×g条件下离心40分钟，清除裂解液。随后将上清液上样至已用纯化缓冲液平衡的肝素柱中。为了洗脱CK蛋白，使用线性梯度洗脱至1摩尔氯化钠，CK蛋白在约0.7摩尔氯化钠时被洗脱。收集含有CK的组分，并进行稀释以降低样品的离子强度。然后将样品上样至已用纯化缓冲液平衡的阳离子交换层析柱E。施加线性盐梯度以洗脱纯化的CK蛋白，洗脱峰约在0.4摩尔氯化钠处。合并含有CK的组分。浓缩至三毫克每毫升，并在储存条件下保存。设计缓冲液以配对未甲基化和甲基化的寡核苷酸。将每种冻干的单链DNA各一微摩尔溶于800微升经高压灭菌的双蒸水中，涡旋混匀，静置15分钟，现配800微升。对于长度为20至30个核苷酸的寡核苷酸样品，向每个样品中加入两倍体积的上样缓冲液并预先加热。制备一块较大的10%变性凝胶。待凝胶聚合后，取出梳子，并彻底冲洗加样孔。将凝胶组装好，用一倍TBE电泳缓冲液注满上下两个电泳槽。以750伏预电泳，使凝胶升温至55摄氏度。然后停止电泳，并用运行缓冲液彻底冲洗加样孔。现在将寡核苷酸在90摄氏度加热两分钟。涡旋并离心。立即将样品上样至凝胶中。以约700伏电压电泳，直至寡核苷酸迁移完毕。在10%聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝的迁移位置相当于约20个碱基长度的寡核苷酸，而二甲苯蓝的迁移位置相当于约60个碱基长度的寡核苷酸。将凝胶从装置上拆下，并在平坦表面上移除垫条。取下一块玻璃板，用塑料膜覆盖凝胶。然后将凝胶翻转，取下另一块玻璃板，并用塑料膜覆盖凝胶。接着，使用紫外光和凝胶背后的荧光板标记条带。用剃刀观察DNA阴影，切下目标条带并将其切成小块。将每个样品转移至无菌的15毫升离心管中。加入9毫升洗脱缓冲液，在37摄氏度下振荡过夜进行稀释。使用加样枪头小心地将溶液转移至高压灭菌的离心管中。为避免转移丙烯酰胺碎片，加入1 mL 3 mM乙酸钠（pH 7）和25 mL预冷的100%乙醇，在-20 °C孵育至少3小时。离心沉淀DNA，然后在中等加热条件下用真空浓缩仪干燥沉淀物，将每个沉淀重悬于400 µL经高压灭菌的双蒸水中，并转移至新的离心管中。加入40微升pH为7的3摩尔醋酸钠和1毫升100%乙醇，涡旋混匀，在-20摄氏度孵育30分钟，然后在18,000 ×g条件下离心15分钟。用100微升70%冷乙醇洗涤DNA沉淀，以去除残留盐分，在18,000 ×g条件下离心6分钟，弃去乙醇，并在真空浓缩仪中干燥沉淀。现在将每个沉淀重悬于100 µL经高压灭菌的双蒸水中。通过分光光度法测定寡核苷酸的浓度。为制备半甲基化DNA双链，首先将等摩尔浓度的互补单链混合。然后将混合物置于水浴中加热至95摄氏度，持续5分钟，以变性DNA双链。让样品在水浴中缓慢冷却至室温。取等体积的81微摩尔纯化的CQ蛋白与81微摩尔半甲基化DNA混合。然后在室温下孵育15分钟。将样品储存于4摄氏度直至使用，并利用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒筛选结晶条件。一旦确定初步的结晶条件，需优化条件以获得可用于衍射的晶体。对所得的CK DNA晶体进行冷冻保护处理。可将结晶溶液中 PEG 400 的含量增加至终浓度 25%，或向结晶溶液中加入 20% 甘油。用尼龙环快速捞取单个晶体。将样品在液氮中冷冻。现在在 100 K 下测试每颗晶体的衍射极限。为了获得与半甲基化 DNA 结合的 CK 截短突变体的晶体结构，我们连续优化了 DNA 上的三个参数：半甲基化 GATC 序列之间的间距、双链的长度，以及是否存在 5' 突出端。本研究使用了一种 DME 变体的 seek a，其末端结构域存在点突变，可防止进一步的连接化，同时采用缩短的连接子，以限制 DNA 结合于串联重复序列。DNA电泳迁移率变动实验显示，GATC重复序列之间仅相隔一个螺旋时，经修饰的CK蛋白优先结合间隔为9至10个碱基对的GATC重复序列。因此，初步筛选采用长度为23至24个碱基对的双链，其中包含两个半甲基化的GATC重复序列，且重复序列之间间隔9个或10个碱基对。三个双链体均获得了形态良好的晶体。尽管这些晶体均未达到高分辨率衍射，但数据表明，A-G-A-T-C 间隔九个碱基对的结构更有利于结晶，出乎意料的是，在两个 GATC 位点之间引入一个 CG 二核苷酸增强了沟槽与骨架的相互作用，但并未改变晶体的衍射极限。相比之下，优化突出端的长度显著改变了分子间接触和晶体形态。该CK蛋白与半甲基化DNA双链结合的晶体结构证实，尽管蛋白质与DNA的相对尺寸较大，DNA双链的游离面并未参与晶体接触，大多数对称相关分子间的相互作用均由蛋白质介导，包括蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA相互作用。有趣的是，在此特定情况下，5'端二核苷酸突出端的有利效应并非源于形成拟连续DNA结构。相反，甲基化链的5'端从DNA轴向外延伸，并与复合物中相邻的CK分子相互作用，这解释了为何严格需要两个核苷酸来改变晶体堆积方式。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化蛋白质以及设计用于蛋白质-DNA复合物结晶的DNA双链。需要牢记的是，尽管本实验方案旨在用于CK-DNA复合物的结晶，但对DNA长度、序列和末端进行理性优化的方法，为其他蛋白质-DNA复合物结晶所用DNA双链的设计提供了通用框架。

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迭代优化的DNA双链的SeqA-DNA复合物的结晶

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DNA双链的迭代优化以促进SeqA-DNA复合物的结晶

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