迭代优化的DNA双链的SeqA-DNA复合物的结晶
November 1st, 2012
蛋白质-DNA复合物的晶体结构，可以提供蛋白质的功能，机制，以及特定的相互作用的性质的洞察。这里，我们报告如何优化共结晶与双链DNA的长度，序列和两端大肠杆菌
本实验详细介绍了如何获得与含有甲基化串联下摆的 DNA 结合的蛋白质的衍射质量晶体。GATC.重复有利于蛋白质 DNA 复合物的晶体填充。从 DNA 长度的合理设计开始，GATC 间距和 DNA 末端进行互补的单链寡核苷酸以纯化 DNA，然后 anele 形成半甲基化 DNA 双链体，然后混合纯化的序列 A 形成复合物。
接下来，使用商业稀疏基质筛选进行结晶试验，找到生长蛋白质 DNA 复合物衍射质量晶体的最佳条件。实证结果。共享不同 DNA 长度、GATC 间距和末端对 CQ、A DNA 晶体衍射质量的影响。
这项工作的目标是获得与 DNA 结合的 CK 的衍射质量晶体，但它也有助于理解在设计用于结晶其他蛋白质 DNA 复合物的 DNA 双链体时需要考虑的一般变量，证明该程序将用于 Chang， A 为我实验室的博士生。本研究使用了 DNA 复制调节蛋白的变体。寻找形成稳定二聚体并在其化和 DNA 结合结构域之间具有缩短接头区域的 a。
该变体限制 DNA 与串联 GATC 重复序列的结合，仅由 DNA 上的一个转位分隔，在 T 7 启动子板的控制下，用编码 DEMETRIC seq A 的质粒首次转化 BBL 20 1D 三个细胞。在含有 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上进行转化反应，并置于细菌培养箱中过夜。挑选混合菌落并开始小规模过夜培养。
第二天早上接种 1 升培养物和 10 毫升过夜接种物。当培养物处于对数期时，加入 2 毫升 0.5 摩尔 IPTG 以诱导蛋白质产生。在 37 摄氏度的轨道摇床中继续孵育 3 小时。
然后以 3， 300 G 离心 10 分钟收获细胞。Reese，悬浮细胞调色板进行纯化，通过超声处理缓冲 A Lies，并通过 39， 000 倍 G 离心 40 分钟来澄清裂解物。现在将 S 上清液上样到用纯化缓冲液平衡的肝素柱上。
洗脱 CK 蛋白。使用线性梯度，使 1 摩尔氯化钠的 CK 蛋白以约 0.7 摩尔的氯化钠洗脱。拉动含有 CK 的馏分并稀释以降低样品的离子强度。
然后将样品加载到与纯化缓冲液相等的阳离子交换色谱柱 E 中。应用线性盐梯度，以大约 0.4 摩尔氯化钠的速度定量环纯 CK 蛋白。合并含有 CK 的馏分。
浓缩至每毫升 3 毫克，并储存。缓冲液设计互补的未甲基化和甲基化寡核苷酸。在 800 μL 高压灭菌器中制备每种冻干单链 DNA 的 1 μmole 样品，双蒸水涡旋，现在放置 15 分钟，然后放置 800 μL。
将缓冲液预热两次，向每个样品中加载 20 至 30 个核苷酸的长寡核苷酸，制备一粒 10% 变性大凝胶。聚合后，取下梳子并彻底冲洗孔。组装凝胶，用 1 倍 TBE 电泳缓冲液填充顶部和底部储液槽。
在750 伏电压下预电泳凝胶，将凝胶加热至 55 摄氏度。然后停止运行并用运行缓冲液彻底冲洗孔。现在将寡核苷酸加热至 90 摄氏度两分钟。
涡旋和旋转。样品立即开始上样凝胶。在大约 700 伏特下运行凝胶，直到寡核苷酸迁移。
在 10% 聚丙烯酰胺凝胶的中间，alph 酚蓝与寡核苷酸一起迁移，长约 20 个碱基，二甲苯酰基 ff 长约 60 个碱基。从仪器中取出凝胶，并取下平坦表面上的垫片。取下一块玻璃板，用保鲜膜盖住凝胶。
然后翻转凝胶，取下另一块玻璃板，用保鲜膜盖住凝胶。接下来，使用 UV 光和凝胶后面的荧光板标记条带。要用剃须刀片看到 DNA 阴影，请切除条带并将其切成小块。
将每个样品转移到无菌的 15 mL 试管中。加入 9 毫升 Elucian 缓冲液，并在 37 摄氏度下搅拌稀释过夜。使用凝胶加载移液器吸头小心地将溶液转移到高压灭菌离心管中。
为避免转移丙烯酰胺碎片，加入 1 毫升 3 毫乙酸钠（pH 值为 7）加上 25 毫升冷藏的 100% 乙醇，在零下 20 摄氏度下孵育至少三个小时。离心沉淀的 DNA。然后在 speed vac 上用中火干燥沉淀，将每个沉淀重悬于 400 微升高压灭菌器、双蒸水中，并转移到新管中。
加入 40 微升 pH 值为 7 的三摩尔乙酸钠和 1 毫升 100% 乙醇涡旋，在零下 20 摄氏度下孵育 30 分钟，然后离心 15 分钟，18， 000 次。G，用 100 μL 70% 冷乙醇冲洗 DNA 沉淀，以去除任何残留的盐离心，持续 6 分钟，时间为 18， 000 次。G 然后丢弃乙醇并在 speed vac 上干燥沉淀。
现在将每个沉淀重新发送到 100 μL 高压灭菌器双蒸水中。通过光谱法确定寡核苷酸的浓度。为了制备半甲基化 DNA 双链，首先混合等量浓度的互补单链。
然后将混合物在水浴中加热至 95 摄氏度 5 分钟以去除股线。让样品缓慢冷却至室温 在水浴中。混合等体积的 81 微摩尔纯化的 CQ a 蛋白和 81 微摩尔 hem 甲基化 DNA。
然后在室温下孵育 15 分钟。在 4 摄氏度下储存，直到使用市售稀疏基质筛分的结晶条件的筛网。一旦确定了初始结晶引线，就优化条件以生长衍射质量晶体 为了哭涣并保护所得的 CK DNA 晶体。
将结晶溶液中存在的 PEG 400 的量增加到最终浓度为 25%，或向结晶溶液中加入 20% 甘油。用尼龙环闪光灯舀出单个晶体。将样品冷冻在液氮中。
现在测试每个晶体在 100 k 时的衍射极限。为了获得与 Hemi 甲基化 DNA 结合的 CK 缩短突变体的晶体结构，我们连续优化了 DNA 上的三个参数，即 Hemi 甲基化 GATC 序列之间的间距、双链体的长度以及五个主要突出端的缺失或存在。本研究使用 seek a 的 DME 变体，在末端结构域中具有阻止进一步韧带化的点突变，以及限制 DNA 结合串联的缩短接头。
在 DNA 电迁移率变化测定中仅由一次旋转分离的 GATC 重复序列表明，修饰的 CK 蛋白优先结合由 9 至 10 个碱基对分隔的 GATC 重复序列。因此，初始筛选使用 23 至 24 个碱基对长的双链体，其中包含两个甲基化的下摆。GATC 重复序列由 9 个或 10 个碱基对分隔。
三个双相体出产形状优美的晶体。虽然没有晶体达到高分辨率。数据确实表明，九个碱基对的 A-G-A-T-C 分离是结晶的首选，通过在两个 GATC 位点之间包含 CG 二核苷酸来意外增强凹槽主链相互作用，而不会改变晶体的衍射极限。
相比之下，优化突出端的长度会显著改变分子接触和晶体形态。这种与血边甲基化 DNA 双链体结合的 CK 蛋白的晶体结构证实，尽管蛋白质和 DNA 的相对大小不同，但 DNA 双链体的自由面不会参与晶体接触，对称伴侣之间的大多数相互作用是由蛋白质、蛋白质和蛋白质 DNA 相互作用介导的。有趣的是，在这种特殊情况下，五个引物二核苷酸突出端的有益效果并不是由于假连续 DNA 的形成。
相反，甲基化链的五个主要末端从 DNA 轴伸出并与复合物的近端 CK 分子相互作用，这解释了为什么严格需要两个核苷酸来改变晶体堆积。看完这个视频，您应该对如何纯化蛋白质和设计用于蛋白质 DNA 复合物结晶的 DNA 双链体有很好的了解。重要的是要记住，尽管该方案是结晶 CK DNA 复合物的装置，但 DNA 长度序列和末端的合理优化为设计用于其他蛋白质 DNA 复合物结晶的 DNA 双链体提供了一个通用框架。
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概述
本文详细介绍了获得与DNA结合的蛋白质衍射质量晶体的过程。它强调了优化DNA长度、GATC间距和末端以增强蛋白质-DNA复合物的晶体堆积。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 晶体学
- 蛋白质-DNA相互作用
背景
- 理解蛋白质-DNA复合物对于洞察蛋白质功能至关重要。
- 晶体结构可以揭示蛋白质相互作用的机制。
- 大肠杆菌SeqA是复制起始的负调控因子。
- 优化DNA设计对于成功共晶化至关重要。
研究目的
- 优化与SeqA共晶化的DNA参数。
- 研究DNA修饰对晶体质量的影响。
- 提供获得高质量衍射晶体的协议。
使用的方法
- DNA长度和序列的理性设计。
- 半甲基化DNA双链的制备。
- 使用互补寡核苷酸纯化DNA。
- 使用商业稀疏矩阵筛选进行结晶试验。
主要结果
- 变化DNA长度和GATC间距显著影响晶体质量。
- 确定了生长衍射质量晶体的最佳条件。
- 该研究证明了蛋白质-DNA复合物的成功形成。
- 结果为类似复合物的结晶过程提供了见解。
结论
- 优化DNA设计对于成功结晶至关重要。
- 研究结果可帮助未来的蛋白质-DNA相互作用研究。
- 该协议可以适用于其他蛋白质-DNA复合物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optimizing DNA duplex design for protein-DNA crystallization addresses a key bottleneck in structural biology workflows, where poor crystal quality impedes target validation and mechanistic de-risking. Systematic variation of DNA length, GATC spacing, and terminal overhangs enables identification of conditions that promote diffraction-quality crystals, directly supporting lead identification efforts for replication-associated targets. This approach provides a reusable framework for enhancing predictive confidence in early discovery by improving the success rate of structural studies on protein-DNA complexes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of SeqA-DNA binding preferences through systematic screening of hemimethylated GATC repeat spacing and duplex length.
- Operational Value: Provides a standardized protocol for preparing hemimethylated DNA duplexes compatible with crystallization screening.
- Predictive Value: Identifies optimal DNA parameters (9-10 bp GATC separation, 5' overhang presence) that correlate with improved crystal morphology and diffraction quality.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Demonstrates how DNA end modifications (blunt vs. 5' overhang) alter molecular contacts and crystal packing in protein-DNA complexes.
- Operational Value: Uses commercial sparse matrix screens to identify initial crystallization conditions, enabling scalable assay setup.
- Predictive Value: Shows that 5' dinucleotide overhangs, not pseudo-continuous DNA formation, drive beneficial crystal contacts via strand-specific protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms that protein-protein and protein-DNA interactions dominate crystal packing when the protein footprint covers most of the DNA, informing target selection for structural studies.
- Operational Value: Establishes a workflow for purifying SeqA variants and forming hemimethylated DNA complexes suitable for high-throughput screening.
- Predictive Value: Links DNA design optimization to reduced mechanistic ambiguity in replication initiation regulation, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, where optimized DNA duplex design enables structural interrogation of replication regulatory proteins, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of SeqA binding specificity to tandem GATC repeats through defined DNA duplex design.
- Screening: Enables assay readiness via standardized preparation of hemimethylated DNA duplexes for crystallization trials.
- Analytics: Provides quantitative readouts on crystal diffraction quality as a function of DNA length, spacing, and end modifications.
- Translational Research: Connects structural insights to functional understanding of SeqA's role in organizing newly replicated DNA.
- Enterprise Reuse: Offers a adaptable framework for designing DNA duplexes for crystallization of other protein-DNA complexes beyond SeqA.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions by enabling high-resolution structural data.
- Operational Value: Standardizes DNA duplex preparation and purification, improving reproducibility across crystallization campaigns.
- Strategic Value: Increases success rate of structural studies, leading to better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of replication-associated targets through improved structural confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, protein purification, and crystallization techniques.
- Dependent on access to commercial sparse matrix screens and crystallization imaging systems.
- Necessitates standardization of hemimethylated DNA duplex preparation across teams.
- Involves adaptation considerations for different protein-DNA systems based on relative size and footprint.
- Limited by the need for iterative optimization of DNA length, spacing, and ends to achieve diffraction quality.
