Name: 工程骨骼肌组织中的小鼠成肌细胞的内皮祖细胞与应用电刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习利用小鼠成肌祖细胞构建工程化骨骼肌组织的方法，通过电刺激诱导收缩并分析肌节结构。该技术可应用于再生医学、疾病模型及培养肉研究。

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作者感谢Yabin Wu培养了图2中所示的组织，图片由Bart van Overbeeke拍摄。本工作由SenterNovem提供资金支持，项目编号ISO 42022。

1. 小鼠成肌祖细胞或C2C12细胞的培养
<ol>
	<li>根据 Shefer 及同事最初发表的方案分离细胞 10 随后由 Collins 改良 等 11 和 Boonen 等 12 并将其储存在液氮中。这需要小鼠， 例如 C57Bl/6。其他实验室采用不同的方法， 例如 李 Y 在《视觉化实验杂志》上发表的一种方法 等 13有关试剂和设备，请参见第7页和第8页的表格。从一只小鼠的肌肉组织中通常可获得足够细胞，用于在液氮中冻存约20管。接下来，我们开始从液氮储存中复苏细胞的实验步骤。</li>
	<li>将1个小瓶中的细胞放入25 cm²培养瓶中2 Matrigel（1 mg/ml）包被的组织培养瓶中加入生长培养基（GM），生长培养基由以下成分组成：335 ml DMEM 高级培养基、100 ml 胎牛血清（FBS）、50 ml HS、5 ml 青霉素/链霉素、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 鸡胚提取物（CEE）。</li>
</ol>
注意：在室温下包被 2 小时，然后通过抽吸去除 Matrigel。
<ol start="3">
	<li>每3天将细胞以约1:3的比例进行传代培养。 
具体操作如下：第3天，将一个25 cm2 培养瓶中的细胞传代至一个75 cm2 培养瓶中；第6天，将一个75 cm2 培养瓶中的细胞传代至两个150 cm2 培养瓶中（需在未包被的培养瓶中预贴壁30分钟）；第9天，将一个150 cm2 培养瓶中的细胞转移至一个三联150 cm2 培养瓶中，或若无此容器，则转移至三个150 cm2 培养瓶中（根据细胞表型需要，可再次进行预贴壁）；第12天，细胞即可用于接种至肌肉构建体中。</li>
</ol>
注意事项： - 每个150 cm2培养瓶的细胞数量约为4.5 × 106个细胞。 
- 使用不同分离批次的冻存管混合细胞，以在接种时获得混合细胞群体。
注意：如果选择不使用原代细胞，C2C12 成肌细胞是一个良好的替代方案。
2. 工程化骨骼肌组织
<ol>
	<li>通过将“弹性体”与“固化剂”按10:1的比例混合来制备硅胶。将魔术贴剪成带有一个三角形边的约±5 mm的方形片段（类似房屋形状；图1）。将魔术贴粘贴到6孔培养板的孔中，各方形之间间距约为12 mm。</li>
</ol>
注意事项： - 仅使用魔术贴的柔软面，并将此面朝上放置。 
- 确保屋顶状结构彼此相对。 
- 仅在魔术贴上涂抹硅胶，不要将胶水扩散至整个孔内。 
- 后续进行电刺激时，需将构建物沿培养板孔的垂直方向（长轴方向）对齐排列。
<ol start="2">
	<li>置于未加热的真空烘箱中过夜干燥，主要目的是去除气泡。通过向孔中加入70%乙醇孵育15分钟进行灭菌。用PBS冲洗3次，然后置于紫外线下照射15分钟。移除孔内及魔术贴上的所有PBS，并将材料放入培养箱中备用。</li>
	<li>在冰箱中解冻Matrigel溶液，并在制备3D结构前立即配制所需浓度的胶原蛋白溶液。用无菌的0.02%乙酸稀释胶原蛋白原液（终浓度为3.2 mg/ml）。</li>
</ol>
注意：所有物品均需置于冰上。
<ol start="4">
	<li>用胰酶消化细胞，重悬于生长培养基（GM）中并计数。将细胞置于离心管中，放入培养箱内孵育。</li>
	<li>根据所需构建体的数量，向离心管中加入适量的胶原蛋白（Collagen）储备液（参见表1），然后逐滴加入0.5 M NaOH，直至溶液呈现淡粉色，表明pH值达到7.5。通过移液轻轻吹打混匀，避免产生气泡。随后加入Matrigel，并非常轻柔但充分地混匀。最后，将生长培养基（GM）加入胶原蛋白/Matrigel混合液中（具体体积参见表1）。</li>
</ol>
注意事项： - 每一步操作均需在冰上进行！Matrigel 和胶原蛋白在温度升高时会迅速凝胶化。 
- 注意颜色确实为粉红色！pH 升高也会引起快速凝胶化。 
- 胶原蛋白的终浓度：1.6 mg/ml。
<ol start="6">
	<li>以1,000 rpm离心所需数量的细胞5分钟，并移除上清液。</li>
</ol>
注意： - 根据细胞的活性，每个构建体所需的细胞数量需要进行调整。通常，每个构建体的细胞数量在 750,000 至 1,250,000 个之间。
<ol start="7">
	<li>取部分凝胶混合物重悬细胞沉淀，将细胞转移至剩余的混合物中，充分混匀，但避免引入气泡。</li>
	<li>从培养箱中取出预热的多孔板，用移液器将 0.35–0.4 ml 细胞-凝胶混合物先加入 Velcro 区域。然后从附着位点之间的中心开始移液，逐步延伸至 Velcro 区域。最后，用剩余的凝胶填充两个 Velcro 锚定点之间的间隙，并在 Velcro 片段周围进行移液。</li>
	<li>5–10 分钟后仔细检查凝胶是否已充分凝固以进行转移，i.e. 轻轻敲击培养皿，目视观察凝胶是否已变坚硬。若已凝固，小心将培养皿放入培养箱中。通常十分钟后即可移动。随后，1–2 小时后，轻轻在每块凝胶上覆盖 4 ml 温热的生长培养基（GM）。</li>
</ol>
注意： 处理培养皿时，切勿进行剧烈操作。
<ol start="10">
	<li>24小时后，用分化培养基（不含鸡胚提取物的生长培养基）替换GM，每2-3天更换一次新鲜培养基。到第7天时，应已形成成熟的定向肌纤维，可通过染色观察融合肌纤维中横纹结构的发育情况来评估。</li>
</ol>
3. 电刺激
<ol>
	<li>使用前，用70%乙醇对Ionoptix板上的电极（参见试剂与设备表）进行灭菌，随后在生物安全柜中用紫外线照射干燥。将带电极的板放置在含有构建物的培养板上，并用培养板的盖子盖好，转移至培养箱中。使用适当的电缆连接Ionoptix C-pacer。</li>
</ol>
注意：电极应平行放置于肌肉构建物的两侧（图2）。
<ol start="2">
	<li>按照预期应用刺激方案。</li>
</ol>
注意：我们通常使用 4 V/CM、6ms 的脉冲，频率为 2Hz。在刺激期间每 24 小时更换一次培养基。

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
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<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
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<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
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<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
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<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肌肉组织的工程化在疾病模型构建、药物筛选、再生医学以及肉类生产方面具有巨大潜力。然而，这些应用的具体需求各不相同。我们选择使用胶原蛋白与Matrigel的组合，因为胶原蛋白有助于细胞排列，且前期二维研究已证实，成肌祖细胞需要基底膜来源蛋白的存在。 12此外，我们在实验室中测试了纤维蛋白凝胶，发现其对C2C12细胞和成肌祖细胞的支持作用不如胶原蛋白与Matrigel™混合物，尤其无法诱导组织收缩。 14该模型如本文所述，已用于基于细胞系的压力性溃疡损伤研究。 15在再生医学应用中，向人类卫星细胞的转化最近已实现 6,16此外，作为一种替代性的肉类消费来源，该技术具有巨大潜力 1然而，我们认为当前的技术需要进一步发展到下一阶段，以扩大其在临床应用和消费领域的使用。例如，目前的分化仅停留在新生儿阶段左右，且产生的力量远低于正常肌肉的收缩力 体内此外，尽管小鼠、大鼠和人类干细胞已可应用于三维结构中，但家畜来源的肌肉干细胞的分离，尤其是其分化与成熟，尚未发展到同等水平1此外，必须避免使用Matrig...

<table><tbody><tr><td>基质胶-生长因子减少型</td><td>Beckton and Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM（高糖）*</td><td>Gibco</td><td>42430</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>65050-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>0.45 和 0.22 &amp;mu;m 注射器滤器*</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheull)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养塑料器皿</td><td>Greiner</td><td></td><td>包括培养瓶和移液管</td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>United States Biological</td><td>C3999</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管*</td><td>Hilgenberg</td><td></td><td>带缩颈、带棉塞、敞口尖端的巴斯德吸管，长度：230 mm，尖端直径：0.9 - 1.1 mm</td></tr><tr><td>巴斯德吸管*</td><td>Hilgenberg</td><td></td><td>带缩颈、带棉塞、敞口尖端的巴斯德吸管，长度：230 mm，尖端直径：1.4 - 1.6 mm</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶*</td><td>Sigma</td><td>C0130-16</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>19G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹性体</td><td>Dow Corning corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>固化剂</td><td>Dow Corning corporation</td><td></td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>魔术贴</td><td>普通商店</td><td></td><td>可在普通商店购买，仅使用柔软面</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>BD Biosciences</td><td>3544236</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EP 培养起搏器</td><td>Ionoptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于电刺激的6孔培养皿</td><td>Beckton Dickinson-Falcon</td><td>BD Falcon #353846</td><td></td></tr><tr><td>C-Dish 培养皿电极</td><td>Ionoptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 用于细胞分离（步骤1.1）&lt;br/&gt; # 包含在同一试剂盒中</td></tr></tbody></table>

利用小鼠成肌祖细胞构建骨骼肌组织及电刺激的应用

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

工程化肌肉组织可用于多种不同目的，包括作为疾病模型的组织制备 体外, 例如 用于研究压力性溃疡、再生医学以及作为肉类替代品 1最早的3D肌肉构建体早在多年前已有报道，该领域的先驱是Vandenburgh及其同事 2,3肌肉组织工程领域的进展不仅源于对生化因子、干细胞和前体细胞知识的极大丰富，更尤其基于研究人员所获得的深刻认识：物理因素在调控细胞行为和组织发育过程中发挥着至关重要的作用。目前最先进的工程化肌肉构建物通常由细胞接种的水凝胶结构组成。在我们的实验室中，这类构建物通常包含从小鼠后肢肌肉中分离的成肌前体细胞，或小鼠成肌细胞系C2C12，与胶原蛋白/Matrigel混合后，接种于两个固定锚点之间，以模拟肌肉韧带的结构。此外，也可考虑使用其他类型的细胞。 例如 替代性细胞系，例如 L6 大鼠成肌细胞 4，新生儿肌肉来源的祖细胞 5，来自其他物种（如人类）成年肌肉组织的细胞 6 或诱导性多能干细胞（iPS细胞） 7细胞收缩力导致细胞沿构建体的长轴方向排列 8,9 培养约一周后，肌肉前体细胞的分化情况。此外，施加电刺激可在一定程度上促进分化过程 8由于其尺寸较小（8 x 2 x 0.5 mm），可利用共聚焦显微镜对整个组织进行分析，以监测 例如 活力、分化和细胞排列。根据具体应用，工程化肌肉组织的要求会有所不同； 例如 用于再生医学时，需要扩大组织规模并实现血管化，而作为肉类替代品则需将其技术转化应用于其他物种。

最终产物将是如图3所示的肌肉构建物。组织的尺寸约为8 mm长、2 mm宽、0.5 mm厚。在分化过程中施加电刺激会改变肌球蛋白重链同工型的表达，但并不会显著增强由分化培养基所诱导的分化过程8；然而，可在培养过程结束时施加电刺激以检测肌肉的功能性，因为具有完全发育肌节的肌肉在受到电脉冲刺激时能够发生收缩。
还可通过定量 PCR 分析基因表达，以及通过染色检测肌肉成熟标志物或横纹发育情况，来评估分化与成熟过程（例如 对组织切片或整体染色的组织样本进行α-肌动蛋白（alpha actinin）染色。与肌肉成熟和分化相关的基因以及肌球蛋白重链的表达包括 例如 MyoD、myogenin、MFR4 和 MLP，以及 MYH 1、2、4 和 8 8已有研究通过基因表达分析、免疫组织化学染色以及电刺激诱导收缩等方法，证实所形成的组织确为肌肉组织，并已发表于先前文献中。 8 以及本文中由成肌细胞前体细胞和C2C12细胞制备的肌肉组织染色横切面图显示于 图4</stron...

工程化肌肉组织在再生医学、疾病模型以及作为肉类的替代来源方面具有巨大潜力。本文介绍了由小鼠成肌祖细胞构建肌肉组织的方法，并采用电脉冲对其进行刺激。

工程化肌肉组织可用于多种不同目的，包括在体外构建组织作为疾病模型，例如用于……

本实验的总体目标是生成工程化肌肉组织。首先通过培养卫星细胞或成肌细胞系，以获得所需数量的细胞。第二步是制备锚定点。接下来，将细胞与凝胶混合，并将所得混合物浇注于锚定点之间。最后一步是将细胞分化为肌肉组织。最终，可通过电刺激诱导细胞收缩，并利用荧光染色以及荧光显微镜或共聚焦显微镜检测已分化肌细胞中细胞骨架的肌节结构排列。与现有方法相比，该技术的主要优势在于肌肉细胞在这些组织中会沿单一方向排列。该技术对因疾病或损伤导致肌肉缺失的患者也具有重要意义。例如，未来若使用患者自身的细胞来构建此类组织，则可用于移植治疗。该方法有助于深入了解肌肉发育及肌肉损伤，同时也将为再生医学和体外培养肉等新兴应用提供参考。演示该实验流程的是 Arian Methods 用于分离和冻存肌原细胞。成肌细胞前体细胞已在其他文献中有所描述。请查阅书面实验方案以获取完整参考文献。从液氮中取出小鼠成肌细胞前体细胞冻存管后，将其放入37摄氏度水浴中解冻。然后向一个25平方厘米的基质胶包被的组织培养瓶中加入10毫升预热的生长培养基。细胞一旦解冻，立即将冻存管中的内容物加入培养基中。将细胞置于组织培养瓶中，在37°C和5%二氧化碳条件下孵育。在培养的第三天，使用胰蛋白酶消化并离心收集细胞，离心条件为1000 RPM。随后将细胞传代至一个75 cm²基质胶包被的组织培养瓶中，每三天传代一次。在第六天，将细胞传代至一个150 cm²基质胶包被的组织培养瓶中。在第九天，将细胞从150 cm²基质胶包被的组织培养瓶转移至三个150 cm²基质胶包被的组织培养瓶（即三联150 cm²培养瓶）或三个独立的150 cm²培养瓶中。在培养的第12天，细胞已准备好接种至肌肉构建物中。首先，按照示意图所示，裁剪约5平方毫米的维可牢尼龙搭扣片段，其中一端呈三角形，仅使用维可牢的柔软面。然后，按10:1的比例将弹性体与固化剂混合，配制硅胶。然后将两片魔术贴粘贴至六孔培养板的每个孔中，两片之间留出约12毫米的距离，并过夜晾干。次日，通过向孔中加入70%乙醇并孵育15分钟，对孔和魔术贴进行消毒。随后，用PBS清洗各孔三次。在孔中保留第三次洗涤液，将酶标板暴露于紫外光下15分钟。然后吸去PBS，将酶标板转移至组织培养孵育箱中，待用时取出。用无菌的0.02%乙酸配制浓度为3.2毫克/毫升的胶原溶液。将胶原蛋白溶液置于冰上，同时将之前在冰箱中解冻的Matrigel溶液也置于冰上。接着，用胰蛋白酶消化法收集细胞，并进行离心。然后，将细胞沉淀重悬于生长培养基中，并按照标准操作程序进行细胞计数。细胞计数完成后，将含有细胞的离心管放入组织培养孵育箱中。基质溶液需在冰上按以下比例混合配制：51.3% 胶原溶液（0.2% 0.5摩尔氢氧化钠）、8.6% 基质凝胶和39.9% 生长培养基。确保最终溶液呈粉红色，因为pH值升高可能导致溶液迅速凝固。最终体积取决于需要铺板的孔数。本表格显示了10块肌肉的体积。确保细胞完全重悬，将每构建体750,000至1,250,000个细胞转移至新的离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于少量但足量的基质混合物中。待沉淀完全重悬后，将细胞加入基质混合物的剩余体积中。随后从培养箱中取出预热的培养板，将0.35至0.4毫升的细胞-基质混合物移入每块魔术贴区域。然后从固定位点之间的中心位置开始移液，逐渐向外延伸至魔术贴边缘。最后，用剩余的凝胶填充两个魔术贴锚点之间的间隙，并在魔术贴周围用移液器加入凝胶。盖上培养板，在室温下静置5到10分钟。然后轻轻敲击培养皿，肉眼观察凝胶是否已变得坚固。如果已完成，则可将培养皿轻轻转移至组织培养孵育箱中。在孵育箱中放置一至两小时后，轻轻向每层凝胶中加入4 mL预热的生长培养基。然后将培养板放回组织培养孵育箱中。24小时后，将生长培养基更换为分化培养基。每两到三天重复更换一次培养基。培养第7天时，应可见成熟的定向肌纤维。此时，可对纤维进行电刺激。首先，用70%乙醇对离子光学板上的电极进行15分钟的消毒，并在紫外光下干燥30分钟。然后将已消毒的电极放置到培养板上，确保电极与肌肉结构平行，如本图所示（图中显示的是培养板底部），白色箭头指示电极的位置；盖上培养板盖后，将其转移至组织培养孵育箱中。使用适当的电缆连接离子光学C型起搏器，并在此应用刺激方案。采用每厘米4伏特的电压，脉冲持续时间为6毫秒，频率为2赫兹。电刺激通常持续48小时。在刺激期间，每24小时更换一次培养基。此图像显示了一个典型的成熟肌肉结构示例。组织的大小约为长八毫米、宽两毫米、厚0.5毫米。该图像显示了在工程化骨骼肌组织中肌前体细胞的典型示例。非刺激性镜像生物人工肌肉或M bms的冷冻切片。在分化第8天，对肌节α-肌动蛋白（红色）、肌节肌球蛋白（绿色）以及细胞核（蓝色）进行染色。右侧图示为方框区域的放大图像。该方案也可用于C2C12细胞。此图像显示了以与上一幅图像相同方式染色的已分化C2C12细胞。肌节α-辅肌动蛋白呈红色，肌节肌球蛋白呈绿色，细胞核呈蓝色。同样，右侧的图版是框选区域的放大图。在进行此操作时，务必记住将所有样品保持在冰上。在此步骤完成后，可采用其他方法来回答更多问题，例如定量 PCR，以证明其开发后基因表达水平的变化。该技术为研究人员探索力学在组织形态发生中的作用铺平了道路，同时也促进了工程化心肌模型的设计。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于水凝胶的支架来构建工程化肌肉组织。

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