工程骨骼肌组织中的小鼠成肌细胞的内皮祖细胞与应用电刺激
March 19th, 2013
工程肌肉组织再生医学具有巨大的潜力，作为疾病模型，也可作为肉类的替代来源。在这里，我们描述的工程的肌肉构造，在这种情况下，从小鼠成肌细胞的祖细胞，通过电脉冲刺激。
该程序的总体目标是生成工程化的肌肉组织。这是通过首先培养卫星细胞或成肌细胞系以达到所需数量的细胞来实现的。第二步是制作锚点。
接下来，将细胞与凝胶混合，并将所得混合物浇铸在锚定点之间。最后一步是将细胞分化为肌肉组织。最终，电刺激可用于诱导细胞收缩，荧光染色和荧光或共聚焦显微镜可用于检测分化肌肉细胞中细胞骨架的肌节组织。
与现有方法相比，该技术的主要优点是肌肉细胞在这些组织中将沿一个方向排列。这项技术对肌肉流失的患者也有影响。例如，如果我们将来使用患者自己的细胞来制造这些组织，这些组织就可以用于移植目的。
这种方法提供了对肌肉发展和肌肉损伤的见解，但它也将为再生医学和体外培养肉等新应用提供见解。演示该程序将是分离和冷冻味醂的 arian 方法。肌母细胞祖细胞已在其他专题中描述。
请查阅书面实验方案以获取完整参考资料。从液氮中取回小鼠成肌细胞祖细胞小瓶后。将样品瓶放入 37 摄氏度的水浴中解冻。
然后将 10 毫升加热的生长培养基添加到 25 平方厘米的基质凝胶包被组织培养瓶中。细胞解冻后，立即将样品瓶的内容物添加到培养基中。在组织培养瓶中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。
在孵育的第 3 天，用胰蛋白酶收获细胞，进行活化和离心。然后以 1000 RPM 的速度将细胞传代到 75 cm 主要凝胶包被的组织培养瓶中，每三天分流一次细胞，并在第 6 天将细胞传代到 150 cm² ² 基质凝胶包被的组织培养瓶中。第 9 天，将细胞从 150 平方厘米的 matri 凝胶包被的组织培养瓶转移到三个 150 平方厘米的 matri 凝胶包被的组织培养瓶或三个 150 平方厘米的烧瓶中。
在孵育的第 12 天，细胞已准备好接种到肌肉构建体中。首先切割大约 5 平方毫米的魔术贴段，一个边缘呈三角形，如图所示，仅使用魔术贴的柔软面。然后通过将弹性体与固化剂以 10 比 1 的比例混合来制备硅胶。
然后将两块 Velcro 粘入 6 孔培养板的每个孔中，两块之间留出大约 12 毫米的距离，并晾干过夜。第二天，向孔中加入 70% 乙醇并孵育 15 分钟，对孔和 Velcro 进行消毒。接下来，用 PBS 冲洗孔 3 次。
将第三次洗涤液留在孔中，将板暴露在紫外线下 15 分钟。然后吸出 PBS 并将板转移到组织培养箱中，直到准备好使用。制备每毫升 3.2 毫克、胶原蛋白和无菌 0.02% 乙酸的溶液。
将胶原蛋白溶液与先前在冰箱中解冻的基质胶溶液一起放在冰上。接下来，通过胰蛋白酶、活化和离心收获细胞。然后将细胞沉淀重悬于生长培养基中，并根据标准程序进行细胞计数。
细胞计数后，将含有细胞的试管放入组织培养箱中。基质溶液是通过在冰上按以下百分比混合溶液制备的，51.3% 胶原蛋白溶液、0.2%0.5 摩尔氢氧化钠、8.6% 基质凝胶和 39.9% 生长。中等。确保最终溶液为粉红色，因为 pH 值升高会导致快速反应。
最终体积取决于要接种的孔数。下表显示了 10 块肌肉的体积。确保细胞完全重悬，并将每个构建体 750， 000 至 1， 250， 000 个细胞转移到新鲜的离心管离心机中，以 1000 RPM 的速度离心 5 分钟，吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于少量但足够体积的基质混合物中。
然后，一旦沉淀完全重悬，将细胞添加到剩余体积的基质混合物中。现在，从培养箱管中取出 0.35 至 0.4 毫升细胞基质混合物的预热板后，放入每块魔术贴中。然后开始从连接部位之间的中心用管道输送混合物，并延伸到 Velcro。
最后，使用凝胶的剩余部分填充两个 Velcro 锚点之间的间隙，并在 Velcro 件周围移液。盖上板子，在室温下放置 5 到 10 分钟。然后轻轻敲击培养皿并目视检查凝胶是否坚硬。
如果是这样，可以将培养皿轻轻转移到组织培养箱中。在培养箱中放置 1 到 2 小时后，将每块凝胶轻轻覆盖 4 毫升预热生长培养基。然后将板放回组织培养箱中。
24 小时后，用分化培养基更换生长培养基。每 2 到 3 天重复一次媒体更换。成熟取向的肌肉纤维在培养的第 7 天应该很明显。
此时，纤维可以受到电刺激。首先，用 70% 乙醇对离子光学板上的电极消毒 15 分钟，然后在紫外线下干燥 30 分钟。然后将灭菌的电极放在培养板上，确保电极平行于肌肉结构放置，如图所示，显示了板的底部，白色箭头表示电极用盖子盖住板并转移到组织培养箱中。
将 ion optic C 起搏器与适当的电缆连接，并在此处应用刺激方案。每厘米 4 伏特。使用频率为 2 赫兹的 6 毫秒脉冲。
电刺激通常持续 48 小时。刺激期间每 24 小时更换一次培养基。这张图显示了成熟肌肉结构的典型示例。
组织的大小约为 8 毫米长、2 毫米宽和 0.5 毫米厚。该图像显示了工程骨骼肌组织中肌肉祖细胞的典型示例。非刺激镜像生物人工肌肉或 M bms 的冷冻切片。
在分化的第 8 天，对肌节 α 肌动蛋白进行染色，肌球蛋白显示为绿色，细胞核显示为蓝色。右侧的面板是方框区域的放大倍数。该方案也可用于 C 两个 C 12 细胞。
该图显示了分化的 C 两个 C 12 细胞，其染色方式与上一张图所示相同。肌节 α 肌动蛋白以红色显示。肌节肌球蛋白显示为绿色，细胞核显示为蓝色。
同样，右侧的面板是方框区域的放大倍数。在尝试此过程时，请务必记住将所有物品放在冰上。按照此程序，可以执行其他方法来回答其他问题，例如定量 PCR 以证明基因表达水平的变化 开发后。
该技术为研究人员研究力学在组织形态发生中的作用铺平了道路。它还有助于设计工程心肌模型。观看此视频后，您应该对如何使用基于水凝胶的支架生成工程化肌肉组织有很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究专注于使用小鼠肌芽细胞祖细胞进行肌肉组织工程。该过程包括培养细胞、创建锚定点以及将细胞分化为可电刺激的肌肉组织。
研究的主要组成部分
科学领域
- 再生医学
- 组织工程
- 细胞生物学
背景
- 工程化肌肉组织在再生医学中有应用。
- 它可以作为疾病模型和替代肉源。
- 理解肌肉组织工程对于这些领域的进步至关重要。
- 电刺激可以增强肌肉组织的功能。
研究目的
- 从肌芽细胞祖细胞生成工程化肌肉组织。
- 探索电刺激对肌肉组织的影响。
- 研究分化后肌肉细胞的结构组织。
使用的方法
- 培养卫星细胞或肌芽细胞系。
- 为组织形成创建锚定点。
- 将细胞与凝胶混合用于铸模。
- 使用电刺激诱导收缩，并用显微镜进行分析。
主要结果
- 成功生成肌肉组织构建体。
- 电刺激导致可观察到的收缩。
- 荧光染色显示了肌小节组织。
- 显微镜确认了分化后肌肉细胞的结构完整性。
结论
- 工程化肌肉组织可以有效地从肌芽细胞中生产。
- 电刺激对肌肉组织功能有益。
- 这种方法在再生医学和替代肉源中具有潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Engineered skeletal muscle tissues provide a scalable in vitro model for studying muscle biology, disease mechanisms, and therapeutic responses. The integration of electrical stimulation enhances functional maturation, improving predictive value for preclinical evaluation. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in discovery programs focused on muscle-related pathologies or regenerative applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of muscle-specific pathways and target engagement in a physiologically relevant 3D context.
- Operational Value: Supports consistent tissue formation for reproducible assay readouts across experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates contractile tissues suitable for assessing compound effects on muscle function and integrity.
- Operational Value: Facilitates standardized preparation of muscle constructs for high-content imaging and functional analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system to model muscle atrophy, injury, or degeneration prior to in vivo testing.
- Operational Value: Allows longitudinal monitoring of tissue maturation and response to stimulation or pharmacological intervention.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early-stage functional assessment of muscle-targeted candidates before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on muscle differentiation, contraction, and structural organization under controlled conditions.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for evaluating compound-induced changes in tissue morphology and alignment.
- Analytics: Enables sarcomeric organization assessment via fluorescent staining and confocal microscopy as a functional maturity marker.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by providing a human-relevant tissue platform for mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized tissue engineering platform applicable across multiple muscle biology projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by modeling native muscle architecture and electromechanical responsiveness.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized gel casting, cell seeding, and stimulation protocols.
- Strategic Value: Reduces biological ambiguity in target validation, supporting more informed go/no-go decisions in muscle-focused programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on functional tissue responses rather than solely biochemical markers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, tissue engineering, and electrical stimulation setup.
- Depends on access to confocal microscopy and fluorescent staining resources for structural analysis.
- Necessitates standardization of gel composition, cell density, and stimulation parameters across teams.
- Involves adaptation considerations when translating from murine to human or other species-derived cells.
- Limited by construct size, which may restrict certain types of mechanical or metabolic analysis.
