小鼠诺如病毒蚀斑试验

本实验的总体目标是定量感染性神经元诺如病毒颗粒。首先制备病毒接种物的十倍系列稀释液，然后将稀释后的病毒接种物转移至 RAW264.7 单层细胞中，于室温下在摇床上孵育一小时。

接下来，吸除接种液，并以1:1的比例加入C噬斑琼脂与2×MEM的混合液，然后将培养板置于组织培养箱中孵育48小时。最后一步是加入中性红染色液覆盖，再将培养板在组织培养箱中孵育1至3小时。最终，小心吸除中性红染色液，注意不要移除表面的琼脂覆盖层，随后使用透射光灯对噬斑进行计数。

这种定量感染性病毒颗粒的方法有助于解答诺如病毒研究领域中的关键问题，例如粪便中排出的感染性颗粒数量，或哪些组织支持感染。通常，初次接触该方法的研究人员在维持细胞健康和活性方面会遇到困难。由于缺乏经验的人可能难以理解用于检测镜像神经病毒的蚀斑实验，因此对该方法进行可视化演示至关重要。

成功完成该实验是一个累积性的多步骤过程，需要适量的细胞、准确的温度以及精确的操作，以便能够清晰地观察到蚀斑。首先，在光学显微镜下检查细胞单层，观察细胞形态，大多数细胞应呈圆形。

不要让细胞过度生长，因为它们通常无法形成斑块。为了制备用于鼠神经病毒斑块试验的近汇合状态的175平方厘米培养瓶中的RAW 264.7细胞，先吸出培养瓶中的培养基，然后向细胞中加入10毫升新鲜DMEM-10培养基。接着，用细胞刮棒将细胞从培养瓶底部刮下，并使用10毫升移液器将细胞悬液反复吹打至少三次，每次均将液体冲击培养瓶底部，以充分分散细胞团块。

为适应扩增培养，取一到两毫升细胞悬液，接种至含有33到34毫升DMEM 10的全新175平方厘米培养瓶中。将培养瓶置于37°C、5% CO₂的组织培养孵箱中孵育两到三天，再次进行拍打混匀。

接种细胞以进行实验时，将细胞悬液的密度调整为每毫升含1×10⁶个活细胞的DMEM 10培养基，然后向每个直径3.5厘米的六孔板孔中加入2毫升该悬液，盖好板盖。随后立即用手轻轻晃动板子10次，使细胞在孔内均匀分布。

切勿使培养板产生气泡，否则会导致细胞聚集在孔的中央。随后将培养板放入组织培养箱中，至少孵育四小时，理想情况下过夜，以使细胞充分贴壁。病毒接种物可来源于感染了MNV的匀浆组织或感染MNV小鼠的粪便样本。若使用组织样本，取豌豆大小的组织块置于含有无菌二氧化硅珠和1毫升DMEM 10的2毫升螺旋盖管中，并在此进行匀浆处理。

使用磁化器在 6,000 RPM 下处理一分钟。若使用粪便样本，以相同方式均质化不超过三个粪便颗粒，将均质后的样本在负 80 摄氏度下冷冻，并在 plaque 实验当天解冻接种物。使用移液器重复操作，向 24 孔板的每孔中加入 1.35 毫升 DMEM 五，然后向第一孔中加入 0.15 毫升第三代病毒接种物。

通过移取0.15毫升的10⁻¹稀释液，将其加入到板的第二孔中，进行10倍系列稀释，得到10⁻²稀释度。然后，用第二孔中的稀释液重复此操作，得到10⁻³稀释度。注意，根据样品的不同，可能需要进一步稀释至10⁻⁹。

制备好梯度稀释液后，用样品名称及所用稀释倍数标记长至60%至80%汇合度的RAW 264.7细胞培养板。然后通过抽吸或倾倒方式从其中一块板中完全移除培养基，并向一个孔中加入0.5毫升稀释后的样品。对另一个重复孔进行同样操作，随后继续进行下一更低浓度的稀释液处理。

将三种稀释液均以复孔形式加入一块培养板后，轻轻倾斜培养板并前后晃动，确保所有细胞均被覆盖。随后对下一块细胞培养板重复上述操作。待所有培养板处理完毕后，将培养板置于摇床中，室温下以约每分钟18次振荡的频率孵育1小时，同时将预先配制好或已灭菌的琼脂糖溶液瓶放入微波炉加热至完全融化。

然后将融化的琼脂置于42摄氏度水浴中，使其温度平衡。接着，在无菌瓶中按1:1比例将融化的琼脂与无菌2倍XMEM培养基混合。将含有此覆盖溶液的瓶子置于37摄氏度水浴中，待用时取出。

在37℃孵育1小时后，从每个孔中吸出接种液，并缓慢向每个孔中加入2毫升覆盖液，加样时确保移液器枪头紧贴每个孔的孔壁。为防止细胞脱落，盖好培养板，室温下静置约10分钟，使覆盖层凝固。随后将培养板转移至组织培养孵箱中继续培养48小时。

孵育结束后，检查平板上是否存在噬斑。若未观察到噬斑，将平板重新放回培养箱，4小时后再次检查。必要时可重复该步骤，但总孵育时间不应超过72小时。

首先，配制中性红染色液。然后，向本方案的每个孔中加入 2 毫升中性红溶液，无需取出 aros 插件。将培养板在 37 °C 下孵育 1 小时。

孵育时间结束后，在保持中性红溶液存在于孔中的情况下检查平板上是否出现蚀斑。若未见明显染色，可将平板继续孵育1小时，总孵育时间最长不超过3小时。一旦观察到蚀斑，吸除中性红溶液，注意勿扰动已形成的凝胶栓，随后进行蚀斑计数。

观察平板，找到噬菌斑明显分离的稀释度。将平板置于透射光灯箱上，在计数噬菌斑的同时，用点标记已计数的噬菌斑，以避免重复计数。

然后对含有不同病毒稀释度的孔重复计数，并计算以每毫升空斑形成单位（plaque forming units per milliliter）表示的病毒滴度。根据书面实验方案中的说明，此代表性图像显示了感染前的单层细胞。Raw 264.7 细胞经培养过夜后，在光学显微镜下以 20 倍放大倍数进行成像。

此图像显示了形成噬斑后的同一单层细胞。感染48小时后，细胞用0.01%中性红溶液染色，并在4倍放大倍数的光学显微镜下观察。罗马数字一、二和三指示三个可见的噬斑。

此图像显示了噬斑实验方案结束时的培养板，其中三组十倍系列稀释孔设有重复孔，并以罗马数字标记。数字一和四对应于10⁻¹稀释度，数字二和五对应于10⁻²稀释度，数字三和六对应于10⁻³稀释度。

样品的病毒滴度如下所示。在进行此操作时，务必注意在不同稀释度之间更换移液器吸头，以避免样品间的交叉污染；将溶液平衡至正确的温度；并防止细胞单层干燥。观看本视频后，您应充分了解如何进行空斑实验以及定量测定微小神经病毒的感染性颗粒。

请注意，在生物安全柜中操作Mira诺如病毒时，执行本实验步骤应始终采取佩戴手套和防护服等防护措施，并根据当地生物安全委员会制定的指南妥善处理废弃物。