Name: 枚举主要外周血白细胞人口多中心临床试验，使用全血表型分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 了解使用流式细胞术和荧光抗体染色技术对新鲜全血进行白细胞表型分析的标准化方法。该方法通过TruCount管实现多中心临床试验中主要外周血白细胞群体的精确计数，确保数据可靠性。

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感谢 Jessica Jones、Erica Clark、Constance Ducar、Donna Smith、Roy Lewis、Lily Apedaile、Joanne Wiesner、Devin Adams、Corey McBain 和 Stephen Voght 在本方法、论文及视频的开发过程中提供的帮助。
本工作由比尔和梅琳达·盖茨基金会CAVD资助项目38645（M.J.M.）以及美国国立卫生研究院资助项目UM1 AI068618和U01 AI069481（M.J.M.）支持。E.A-N. 获美国国立卫生研究院T32 AI007140资助项目支持。我们感谢詹姆斯·B·彭德尔顿慈善信托基金慷慨捐赠的设备。

注意：为保护荧光染料偶联抗体免受光照，所有步骤均需在关闭光源的生物安全柜中进行。
1. 抗体染色面板制备
<ol>
 <li> 抗体染色方案见表1。抗体浓度应通过全血滴定确定，并使用与获取染色表型样本时相同的流式细胞仪设备和操作流程进行。 </li>
 <li> 确定合适的染色滴度后，将所有抗体混合至一个带盖离心管中。加入流式洗涤缓冲液（含2%热灭活胎牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液），使总体积达到100 μl。根据待染色样本数量对混合液进行比例放大。该混合液可在4 °C保存最多八周。 </li>
</ol>
2. 染色
<ol>
 <li> 如果采集的血液除本检测外还需用于其他用途，请先留出一份等分试样，以便对剩余血液进行时间敏感性更高的操作。该等分试样可在静脉采血后室温保存长达4小时，而不会造成显著的细胞损失。</li>
 <li> 确认Trucount管底部有完整的微球沉淀，并标记该管以标识待染色的样本。在HVTN临床试验中，使用实验室数据管理系统（Frontier Science and Technology Research Foundation；Amherst, NY）对染色样本进行标记和追踪。</li>
 <li> 记录所有试剂的批号和有效期。记录制造商提供的Trucount管袋上标注的微球计数编号；确保袋子上的批号与管上的批号一致。</li>
 <li> 使用反向移液法，准确将100 μl全血加入Trucount管中，液滴置于金属固定环上方。避免将血液涂抹在管壁上。</li>
 <li> 使用常规（正向）移液技术，将100 μl混合的抗体染色组合（见表1）加入Trucount管中。盖紧管盖，低速涡旋震荡约15秒以充分混匀。目视检查，确保微球沉淀已完全溶解。</li>
 <li> 将Trucount管在室温（15–30 °C）避光条件下孵育15分钟。</li>
 <li> 如有必要，使用去离子水（diH2O）将10× FACS溶血液稀释至1×工作浓度。向管中加入900 μl 1× FACS溶血液。</li>
 <li> 盖紧管盖，低速彻底涡旋震荡约15秒以混匀。用力将管盖压紧至锁定位置，并用实验室封口膜密封。</li>
 <li> 将样本管储存于-65 °C至-95 °C，直至准备运送到中心分析实验室或进行内部分析。此阶段样本至少可稳定保存四周。若需立即运输或检测，可省略此步骤。</li>
</ol>
3. 运输
注意： 以下说明使用 Saf-T-Pak, Inc. 的隔热运输系统，该系统专为根据国际航空运输协会（IATA）规定运输B类豁免生物物质而设计。如果在染色操作的同一地点进行样本分析，请转至第4节。
<ol>
 <li> 样本可在染色后立即运输，或在 -65 °C 至 -95 °C 冻存后运输。用铝箔将每支试管完全包裹，并放入染色样本盒中。将染色样本盒放入带有吸水材料的防漏塑料袋中。</li>
 <li> 将防漏塑料袋及其内容物放入特卫强（Tyvek）袋中，并尽可能排出袋内空气后密封。</li>
 <li> 将样本包装（样本置于次级包装内）放入内层棕色盒中。</li>
 <li> 将内层棕色盒放入泡沫箱的凹槽内，并固定到位以防止移动。</li>
 <li> 在泡沫箱内加入干冰（约 8 kg），并紧密盖上箱盖。</li>
 <li> 用胶带牢固封好运输箱，并按照B类生物物质（UN3373）进行运输，同时正确标注干冰（UN1845）信息；请遵循IATA PI-650操作指南。</li>
 <li> 样本接收后，应储存在 -65 °C 至 -95 °C 环境中，直至进行分析。</li>
</ol>
4. 解冻与流式细胞术分析
<ol>
 <li> 从冷冻箱中取出染色样本，在避光条件下于室温解冻，然后上流式细胞仪检测。若需检测多个样本，应通过错开解冻时间的方式对所有样本管进行标准化处理，确保每管样本在室温下放置不超过1小时。</li>
 <li> 应使用配备适当滤光片的四激光流式细胞仪（如BD LSR II）获取样本数据。数据采集时采用标准的流式细胞仪校准和荧光补偿方法4。</li>
</ol>
 注意：在采集过程中不要设置前向散射或侧向散射的阈值5。Trucount微球的信号可能低于这些参数的最低可设阈值，导致分析时部分微球未被计入。如果仪器要求设置阈值，请设置最低可能的Am Cyan通道阈值。由于使用该试剂 panel 染色的CD45+白细胞在Am Cyan通道呈阳性，且Trucount微球在Am Cyan通道也有荧光信号，因此该设置可确保所有相关数据被正确采集。 
 <ol start="3">
 <li> 上样至流式细胞仪前，将样本管涡旋振荡5秒。Trucount微球在多个通道中具有强烈的荧光信号。采集数据时通过寻找在PE Cy5和APC双通道均呈强阳性的细胞群来圈选微球（微球与细胞最易区分的两个荧光通道可能因仪器不同而有所差异）。将微球圈门设为终止门，持续采集数据直至至少获得20,000个微球事件。</li>
 <li> 使用适当的软件（如FlowJo，Treestar；Ashland, OR）分析数据。图1展示了从一次代表性对照血样中分析不同白细胞亚群所采用的设门策略。</li>
</ol>
5. Trucount 计算
<ol>
 <li> 每个 Trucount 管中含有荧光微球的冻干颗粒。向管中加入液体并涡旋震荡后，微球应在样本中均匀分布。颗粒中微球的数量因批号略有差异，可在试管的储存袋上找到具体数值。</li>
 <li> 如图1所示，对 Trucount 微球和细胞群体设门，以确定各群体的事件数。将微球门中的事件数与管中原始微球总数进行比较，可计算出所采集样本的比例，进而用于确定各群体的绝对浓度（即，细胞/μl）。可使用以下公式进行计算：细胞浓度（# 细胞/μl 全血）= [# 目标群体事件数 /（# 微球事件数 / 颗粒中微球总数）] / 100 μl。</li>
</ol>
6. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="流式细胞术图显示免疫细胞亚群设门策略。图A-D，CD标志物可视化。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 用于分析主要白细胞群体的设门策略，展示来自一名健康志愿者的代表性数据。A) Trucount 微球（i）被设门并从细胞中排除。粒细胞（ii）被圈定，淋巴细胞和单核细胞被分为三个群体：CD14阴性淋巴细胞（iii）、所有CD14阴性细胞（iv）以及非淋巴细胞（v）。B) 对CD14阴性淋巴细胞设门，以区分CD4+ T细胞（vi）、CD8+ T细胞（vii）、B细胞（viii）、CD56亮表达NK细胞（ix）、CD56弱表达NK细胞（x）和CD56阴性NK细胞（xi）。C) 对所有CD14阴性细胞设门，以区分髓系（xii）和浆细胞样（xiii）树突状细胞。D) 对非淋巴细胞设门，以区分非经典型（xiv）、中间型（xv）和经典型（xvi）单核细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 未在图1中显示的更特异的细胞亚群（例如，NKT细胞或中性粒细胞）也可通过本方案提供的抗体组合进行区分，且设门策略可根据具体研究需求进行扩展或调整。某些设门步骤为此方法所特有。特别需要注意的是，在Trucount微球周围分别绘制一个包含门和一个排除门，并将二者叠加，其中一个用于微球计数，另一个用于在细胞分析中排除微球（图1A）。此外，由于在全血样本中，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞在前向散射光和侧向散射光上的区分不如在外周血单个核细胞中清晰，因此通常需要结合CD45表达与侧向散射光进行设门（图1A）。在某些图中，通过CD45和侧向散射光无法与淋巴细胞和单核细胞完全分离的污染性粒细胞（以圆圈标出）可通过其高表达CD16加以识别（图1C和图1D）。这类污染性粒细胞数量通常较少，不会干扰单核细胞和NK细胞的设门分析。

<ol><li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells%3A+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
<li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+granulocytes%3A+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li>
<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
<li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li>
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<li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li>
<li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).</li>
<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
<li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis%3A+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li>
<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本报告中，我们介绍一种基于微球的方法，通过流式细胞术对新鲜全血中的白细胞亚群进行计数，并阐述该方法在多中心临床试验中用于集中样本分析时所需的关键参数。该方法在BD Trucount方案的基础上进行了优化，使其能够在多中心临床试验环境中实现可靠应用。染色实验操作简便，耗时约45分钟，便于血液处理实验室技术人员完成样本处理、冻存及寄送至中心检测实验室进行分析。本实验仅需100 μl全血，无需耗时且成本较高的外周血单个核细胞（PBMC）分离步骤，且所需血量远少于常规表型分析实验。此外，由于使用新鲜全血，该方法能更真实地反映细胞的体内状态，并避免了某些细胞类型在冻存过程中所受到的不利影响1-3。该染色方法可准确测定细胞浓度，同时相较于全血细胞计数（CBC）及其他计数方法，还能更清晰地区分更多类型的细胞。获得准确且一致结果的关键在于严格标准化实验流程中的关键步骤，并采用一套记录系统，对所有操作步骤进行追踪，以便在发现异常时能够追溯至误差来源。
在整个实验过程中，有多个关键步骤会影响由此检测所获得数据的质量。首先，从血液采集到染色的处理和操作过程的标准化...

<table><tbody><tr><td>Trucount 绝对计数管</td><td>BD 生物科学</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>10X FACS 溶解液</td><td>BD 生物科学</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>B类 &amp;和免运费系统，绝缘</td><td>Saf-T-Pak</td><td>STP-320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan 单克隆抗体 </td><td>BD 生物科学</td><td>339192</td><td></td></tr><tr><td>CD3 FITC 单克隆抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>349201</td><td></td></tr><tr><td>CD8 PerCp-Cy 5.5 单克隆抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>341051</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 700 单克隆抗体 </td><td>BD Biosciences</td><td>557922</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR ECD 单克隆抗体 </td><td>贝克曼库尔特</td><td>IM3636</td><td></td></tr><tr><td>CD14 v450 单克隆抗体 </td><td>BD 生物科学</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE 单克隆抗体 </td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD16 APC-H7 单克隆抗体 </td><td>BD Biosciences</td><td>560195</td><td></td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 单克隆抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>335791</td><td></td></tr><tr><td>CD11c APC 单克隆抗体 </td><td>BD 生物科学</td><td>559877</td><td></td></tr><tr><td>CD123 PE-Cy5 单克隆抗体 </td><td>BD 生物科学</td><td>551065</td><td></td></tr></tbody></table>

使用全血表型分析法对多中心临床试验中主要外周血白细胞群体进行计数

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

外周血白细胞的冷冻保存在临床试验中被广泛用于保存细胞，以便进行免疫反应评估，该方法为免疫学检测的便捷性和标准化提供了诸多优势，但该过程已被发现对某些细胞亚群（如粒细胞、B细胞和树突状细胞）具有不利影响 1-3检测新鲜白细胞能够更准确地反映实际情况 体内 细胞状态，但在大规模临床试验中往往难以实施。新鲜细胞检测依赖于志愿者的配合及其时间安排，如果检测耗时较长，则可能因需要实验室人员投入大量工作时间而变得不切实际。此外，当试验在多个中心开展时，具备执行检测所需资源和培训条件的实验室可能与临床场所相距较远。为解决这些问题，我们开发了一种11色抗体染色 panel，可与Trucount管（Becton Dickinson；San Jose, CA）联合使用，用于对外周血中主要的白细胞亚群进行表型鉴定与计数，所提供的细胞类型特异性信息比全血细胞计数（CBC）或市面上针对Trucount管设计的仅标记少数细胞类型的商用panel更为全面。该染色流程简便，仅需100 μl新鲜全血，耗时约45分钟，适合常规血液处理实验室操作。本方法改编自BD Trucount管技术数据表（<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">版本 8/2010</a>). 染色抗体混合液可在中心检测实验室预先大量配制，并运送至各样本处理实验室。染色后的样本管可经固定并冷冻保存，随后运送至中心检测实验室进行多色流式细胞术分析。本染色方案所产生的数据可用于追踪干预措施下随时间变化的白细胞浓度变化，并可进一步拓展用于评估特定目标细胞类型的活化状态。本报告中，我们展示了血液处理实验室技术人员对新鲜全血进行染色的操作流程，以及在支持多中心临床试验的中心检测实验室中分析这些染色样本的具体步骤。视频内容详细描述了该操作流程在HIV疫苗临床试验网络（HVTN）临床试验采血背景下的实际执行过程。

在本报告中，我们展示了在新鲜全血上进行表型分析实验的染色与分析步骤，以计数主要的天然免疫和适应性白细胞群体。我们重点强调了在多中心临床试验背景下开展这些操作时的注意事项。

外周血白细胞的冷冻保存在临床试验中被广泛用于保存细胞，以进行免疫反应评估，并具有诸多优势……

本视频介绍了弗雷德·哈钦森癌症研究中心的艾滋病疫苗试验网络（HIV Vaccine Trials Network）为多中心临床试验开发的、用于对新鲜全血进行染色的流程，染色后的样本将由中心实验室进行分析。该流程使用了BD生物科学公司（Becton Dickinson Biosciences）生产的TruCount管，每根管中均含有冻干小球，样本制备过程中小球溶解，释放出已知数量的荧光微球。采用荧光标记抗体对不同细胞群体特异的表面标志物进行染色。在流式细胞术分析过程中，可将这些不同细胞群的数量与荧光微球的数量进行比较，从而追踪全血中不同白细胞群体的绝对浓度随时间的变化情况，以及其与干预措施之间的关系。您好，我叫Erica Anderson Nissan，是HIV疫苗试验网络的一名科研人员。您即将观看的这一实验流程，是我们为多中心临床试验开发并应用的方法。在这些试验中，血液处理实验室的技术人员接收新鲜全血样本，用荧光标记的抗体进行染色，然后将样本运送至具备流式细胞仪分析能力的中心实验室进行检测。由于成本和可行性问题，新鲜全血通常不在临床试验环境中进行分析；但我们已开发出一种单抗体染色方案，可鉴定外周血中的主要白细胞亚群，且染色过程耗时不足45分钟，因此适用于HVTN中的临床试验。我们正在使用该方案研究接种候选HIV疫苗后发生的早期免疫事件，但此PI染色方案亦可根据不同研究者的兴趣进一步调整，以针对特定的细胞类型。非常感谢您的观看，希望本方法未来对您有所帮助。表一展示了一个11色抗体染色方案，用于对外周血中的主要白细胞群体进行表型鉴定和计数。该抗体混合物由中心检测实验室制备，然后分发至各处理实验室，以确保不同实验地点之间的一致性，并允许在使用抗体混合物对试验样本染色前，先在对照血样上进行测试。每种荧光标记的抗体均单独进行滴定，然后根据适当的滴定浓度，将各抗体加入含去离子PBS并添加2%热灭活胎牛血清的流式洗涤缓冲液中，混合成单一的抗体混合液。抗体混合物标注有批号和有效期，并通过可维持运输过程中4°C温度的包装系统，从中心检测实验室运送至各处理实验室。接收后，抗体染色面板可在避光条件下于4°C保存长达八周。染色后使用BD fax裂解液，以裂解红细胞并固定抗体染色，同时保持白细胞的完整性。该溶液由生产商提供，浓度为10倍浓缩液，由中心检测实验室用去离子水按1:10比例稀释。稀释后的溶液标注批号和有效期，并在收到后于常温下运送至各处理实验室。在进行绝对计数染色前，Fax裂解液应储存于15至30摄氏度的室温环境中。处理实验室必须确保已从中心检测实验室获取所有适当的试剂，包括BD TRU计数管、联合抗体染色 panel 以及一份x fax授权溶液。HVTN采用实验室数据管理系统来记录每份样本的所有相关信息。在真实计数管的标签上会打印一个唯一的识别码。为了在整个过程中追踪样本，请标记一个冻存管以标识正在染色的样品。标签信息通常包括患者或志愿者编号、一次访视的编号以及采血日期，并使用无菌技术将所需量的血液分装至已标记的冻存管中。用于染色的血液量取决于所使用的染色面板，通常每个面板使用 50 或 100 微升。染色前，冻存管可在室温下放置最多四小时。剩余血液则需进行其他对时间敏感的操作。确认管底有完整的磁珠沉淀，并标记tru count管。使用相关样本信息记录所有试剂的批号和有效期。在临床试验过程中，使用工作表有助于追踪这些信息。tru count 管的微球计数编号和批号位于 tru count 管袋的正面。当您准备开始 tru Count 染色流程时，请确保已在生物安全柜内备齐所有材料和试剂以供使用。这些材料包括标记好的血液等分试样 tru count 管、联合抗体染色面板管、一份 x fax 裂解液、200 微升和 1000 微升微量移液器及移液器吸头、铝箔、次氯酸钠漂白液、实验室封口膜以及染色后使用的计时器。您还需要一个染色标本盒，但该盒子无需放在生物安全柜内。所需血液和抗体的用量取决于该检测组合所区分的细胞类型以及进行准确分析所需的细胞数量。每种检测组合均需通过对照样本进行测试，以确定染色所需的最适血量，而抗体的使用量则与本视频所示检测组合所用的血量相等。移液前将使用100微升血液和100微升抗体。通过轻轻翻转离心管数次来混匀血液，并轻轻吹打数次。为确保血液充分混匀。然后使用反向加样法，将分装的全血准确地从分装液中吸取至TruCount管内金属固定环上方。避免将血液涂抹到管壁上。每次向不同的TruCount管加样后均需更换新的吸头。现在需要在移液前使用抗体染色 panel 对血液进行染色。通过轻轻吹打数次使染色 panel 混合均匀。向计数管中的血液加入 100 µL 抗体混合液。此步骤中不要进行反向移液，以免浪费宝贵的试剂。盖上管盖，低速涡旋震荡约15秒以混匀，确保磁珠沉淀完全溶解。用锡箔纸盖住试管，并设置计时器，使血液染色 15 分钟。裂解液（1× Fax Slicing Solution）的使用量为血样体积的 9 倍，因此在本示例中，使用 900 µL 的 1× Fax Slicing Solution。染色孵育 15 分钟后，向染色血液中加入 900 µL 的 1× Fax Slicing Solution，以固定染料并裂解红细胞。此步骤无需使用反向移液法。盖紧管盖，低速涡旋振荡约15秒以混匀。将管盖用力下压至锁定位置并密封。用实验室膜密封。将试管存放在暗盒中或用铝箔完全包裹，置于零下65至零下95摄氏度的环境中，直至运送至中心检测实验室。截至目前的检测结果显示，样本在此温度下可保持稳定长达四周。染色样本必须按照国际航空运输协会（IATA）的规定，作为B类生物物质进行运输。根据HVTN的规定，样本每周通过Safety Pack Ink公司生产的隔热运输系统，从处理实验室运送到中心检测实验室，该系统专门设计用于满足这些要求。使用此系统时，应将内层棕色盒放入泡沫塑料箱内，并将其固定在凹槽中以防止移动。用干冰将箱子完全填满，并等待5至10分钟，使盒子充分冷却。为准备样本寄送，需将每个试管和铝箔完全包裹，并放入装有染色样本的样本盒中。将吸水材料与染色样本盒一同放入防漏塑料袋中。排出袋内多余空气后紧密封口。将防漏的聚乙烯袋放入特卫强袋中。再次确保在封口前将袋内所有空气排出。将标本包装放入内层棕色盒中，并将盖子紧密地盖在泡沫箱上。将运输箱牢固封箱，并按照B类生物物质标准运输，使用适当的干冰标识。在多中心临床试验中，需遵循国际航空运输协会（IATA）PI 650号指令。在整个短期储存、运输及长期储存过程中，对样本进行追踪至关重要。HVTN 所使用的数据管理系统支持创建运输清单，该清单可导入样本将被储存和分析的中心检测实验室的样本数据库中。这能够记录样本的寄送和接收时间、最终储存位置以及取出时间。进行分析时，将染色样本从冷冻箱中取出，置于暗盒内在室温下解冻。在使用流式细胞仪采集样本前不超过一小时进行操作。若需对多个样本进行数据采集，应依次解冻样本，确保每个样本在室温下放置的时间不超过一小时。应使用配备适当滤光片的四激光流式细胞仪（如BD LSR II）进行样本采集，并根据仪器要求采用标准的细胞仪校准和荧光补偿方法进行数据采集。设置阈值时，将青色荧光通道的阈值设为尽可能低的水平，并在上机前将样本管涡旋振荡五秒钟。细胞计数仪的TruCount微球在多个通道中均表现出强烈的荧光。在采集过程中，通过寻找强双阳性的微球群体来设门。对于PE、SCI5和PC，需注意区分微球与细胞的两种最易分辨的荧光颜色可能因仪器不同而有所差异。选择 tru count 微球门作为停止门，并持续记录数据，直至至少获取 20,000 个微球。使用合适的软件（如 FlowJo）分析数据。接下来，我们将通过一个代表性对照血液样本的数据，介绍用于分析主要白细胞群体的设门策略。使用该检测面板还可以区分更特异的细胞亚群，例如 NKT 细胞或中性粒细胞，但本示例中不会展示这些亚群。首先，在真计数微球周围绘制一个包含门和一个排除门，并将二者叠加放置，其中一个用于计数微球，另一个用于在细胞分析中排除微球。接下来，对排除微球后的细胞数据进行设门，仅包含单细胞，依据前向散射光高度与前向散射光面积进行区分。该门控还可排除微小碎片。随后对 CD45 阳性细胞进行门控，利用侧向散射将粒细胞与淋巴细胞和单核细胞分离。然后利用 CD14 和侧向散射将淋巴细胞和单核细胞进一步分为三个不同的群体。这些细胞包括 CD14 阴性淋巴细胞，所有 CD14 阴性细胞中来自 CD14 阴性淋巴细胞门控的非淋巴细胞首先被分为三群：CD3 阳性 CD19 阴性、CD3 阴性 CD19 阳性，以及 CD3 阴性 CD19 阴性。T 细胞从 CD3 阳性 CD19 阴性门控中获取，并在排除 CD56 阳性和 CD16 阳性细胞后，进一步区分出 CD4 阳性和 CD8 阳性 T 细胞。B 细胞从 CD3 阴性 CD19 阳性门控中获取，需排除 CD56 阳性和 CD16 阳性细胞；NK 细胞则从 CD3 阴性 CD19 阴性门控中获取。在通过 CD11c 和 CD4 排除可能污染的单核细胞后，NK 细胞被分为 CD56bright、CD56dim 和 CD56阴性群体。为了区分树突状细胞群体，首先对所有 CD14 阴性细胞设门，以排除 CD3 阳性、CD19 阳性、CD56 阳性以及 CD16 阳性细胞。随后对 HLA-DR 阳性细胞设门，并根据其 CD11c 和 CD123 的表达情况区分髓系树突状细胞和浆细胞样树突状细胞。最后，从非淋巴细胞门中排除可能污染的 CD56 阳性、CD3 阳性和 CD19 阳性细胞后，圈定单核细胞亚群。根据其 CD16 和 CD14 的表达水平，区分非经典型、中间型和经典型单核细胞。一旦目标细胞群被圈定，即可计算其浓度。通过比较珠门内的事件数量与试管中原始珠子的总数，可以确定所收集样本的比例，进而用于计算绝对浓度。由此可得出每微升中各细胞群体的细胞数。此处所示公式可用于该目的。在本视频中，我们展示了血液处理实验室技术人员对新鲜全血进行染色的操作流程，以及在中心检测实验室分析这些染色样本的步骤。在多中心临床试验的背景下，我们已证实该检测方法操作简便且耗时相对较短，使得血液处理实验室技术人员能够顺利完成操作，并将样本冷冻后转运至核心检测实验室进行分析。获得准确且一致结果的关键在于，对实验方案中的关键步骤进行严格标准化，并采用一套记录系统，以追踪所有操作步骤，从而能够将发现的任何异常追溯至其源头。通过该染色面板生成的数据可用于追踪白细胞浓度随时间的变化，也可进一步开发以评估特定目标细胞类型的活化状态。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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开发了一种自动化的微流控装置，通过红细胞裂解法从外周血中富集循环有核细胞，确保在无细胞损失的情况下分离出高质量的样本。...

用于富集循环有核细胞的自动化微流控血液裂解方案

来源：Xu, C., et al. 建立慢性活动性EB病毒感患者NK细胞和T细胞系的高效简便方法。J. Vis. Exp.

利用流式细胞术对EBV感染的细胞系进行表型分析

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B...

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全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

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本方案详细介绍了在临床试验现场可实际应用的高质量外周血单个核细胞（PBMC）和血浆生物样本的制备方法，可用于转化生物标志物分析。...

临床试验现场单次采血制备外周血单个核细胞团块及血浆用于生物标志物分析

本文介绍了一种使用基于POCT卡片的白细胞分析仪检测外周血白细胞的实验方案。采用两台自动化血液分析仪对相同的血液样本进行检测，以评估该方法结果的一致性和准确性。结果显示，所评估的分析仪与参考系统具有良好的相关性。...

一种用于检测外周血白细胞的即时检验分析仪的评估

为了有效研究免疫细胞群体的功能，通常需要对其进行纯化。补体耗竭法是一种快速且经济的技术，可用于分离高纯度的免疫细胞群体。...

通过补体耗竭去除特定细胞群体

了解使用流式细胞术和荧光抗体染色技术对新鲜全血进行白细胞表型分析的标准化方法。该方法通过TruCount管实现多中心临床试验中主要外周血白细胞群体的精确计数，确保数据可靠性。

使用全血表型分析法对多中心临床试验中主要外周血白细胞群体进行计数

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