Name: 相移窄粒度分布的纳米乳液的合成声波液滴蒸发和泡增强的超声介导消融 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解相移纳米乳液的合成方法及其在超声介导消融中的应用。本研究展示如何通过脂质包覆纳米乳液的汽化产生气泡，从而显著缩短加热时间并提高肿瘤消融效率。

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本工作得到了波士顿大学/医疗成像与治疗技术中心应用医疗健康工程博士前奖学金、美国国家科学基金会工程领域拓宽参与研究启动资助（BRIGE）以及美国国立卫生研究院（R21EB0094930）的支持。

1. 相变纳米乳液（PSNE）的制备
<ol>
 <li>将11 mg DPPC和1.68 mg DSPE-PEG2000溶解于氯仿中</li>
 <li>蒸发有机溶剂，在玻璃圆底烧瓶中形成干燥的脂质膜</li>
 <li>将脂质膜在真空条件下干燥过夜</li>
 <li>用5.5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）重新水合脂质膜</li>
 <li>将溶液置于45 °C水浴中加热，直至脂质膜完全溶解，并定期涡旋混匀</li>
 <li>将脂质溶液转移至7 ml小瓶中</li>
 <li>在20%振幅下对脂质溶液进行2分钟超声处理</li>
 <li>将溶液均分为两个2.5 ml的小瓶（弃去剩余的0.5 ml）</li>
 <li>向每个小瓶中加入2.5 ml PBS</li>
 <li>将每个小瓶置于0 °C冰水浴中</li>
 <li>向每个小瓶中加入50 μl DDFP</li>
 <li>在冰水浴中对每个小瓶进行超声处理，设置如下：25%振幅，脉冲模式（开启10秒，关闭50秒），总开启时间为60秒</li>
 <li>将PSNE溶液转移至20 ml闪烁瓶中</li>
 <li>向每个小瓶中加入5 ml PBS，最终体积为10 ml</li>
 <li>按照制造商提供的说明组装挤出器
 <ol>
 <li>用去离子水冲洗各部件</li>
 <li>将不锈钢支撑盘置于滤器支撑底座中央</li>
 <li>将不锈钢筛网放置在不锈钢支撑盘上方</li>
 <li>使用镊子将挤出器排水盘膜（光泽面朝上）放置在不锈钢筛网上</li>
 <li>使用镊子将挤出器滤膜（光泽面朝上）放置在排水盘膜上</li>
 <li>小心地将小O型圈放置在滤膜上，然后将热筒和挤出器上部组件置于支撑底座上方</li>
 <li>先部分拧紧每个翼形螺母，然后以交替方式用手完全拧紧翼形螺母</li>
 <li>将挤出器连接至氮气管线</li>
 <li>为预润挤出器，用移液器将10 ml去离子水加入顶部样品口，盖紧开口，并关闭排气阀</li>
 <li>缓慢打开氮气管线以增加压力，迫使样品通过膜，从出口管路收集样品</li>
 <li>使用后按相反顺序拆卸，用去离子水冲洗挤出器各部件，并丢弃滤膜和排水盘膜</li>
 </ol>
 </li>
 <li>仅针对100 nm液滴，先通过200 nm滤膜挤出10次以预处理PSNE</li>
 <li>通过100 nm或200 nm滤膜将PSNE挤出16次，以获得较窄的粒径分布</li>
</ol>
2. 含有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶的制备
<ol>
 <li>通过将 1.2 g BSA 粉末溶于 5 ml 去离子水中，配制 24% BSA 溶液</li>
 <li>通过将 0.1 g APS 粉末溶于 1 ml 去离子水中，配制 10% APS 溶液</li>
 <li>按以下顺序，在塑料容器中混合 2.1 ml 丙烯酰胺溶液、1.2 ml Tris 缓冲液、0.1 ml 10% APS、4.5 ml 24% BSA 溶液和 3.6 ml 去离子水</li>
 <li>加热至 40 °C，并在真空条件下放置 1 小时</li>
 <li>加入 480 μl PSNE，通过轻轻旋转塑料容器充分混匀</li>
 <li>加入 12 μl TEMED，将容器置于 12 °C 水浴中反应 2 小时</li>
</ol>
3. 代表性结果
用于组织模拟水凝胶仿体超声实验的装置示意图如图所示 图1该方案可制备出具有窄粒径分布的脂质包覆全氟碳液滴，其在溶液中至少可稳定保存一周。通过动态光散射法（90Plus 粒径分析仪，Brookhaven Instruments，Holtsville，NY）测得的粒径分布如图所示。 图2 使用100和200 nm滤膜挤出的PSNE。通过动态光散射测得的PSNE随时间变化的有效直径列于表1中，表明PSNE至少在一周内保持稳定。PSNE在聚丙烯酰胺水凝胶中汽化前后B模式成像结果如图所示 图3此外，还展示了在含有白蛋白和PSNE的聚丙烯酰胺凝胶中，经15秒HIFU介导加热后形成的病灶。 图4病灶的不对称形状是由于超声路径中存在气泡云导致焦点前加热所致。需要注意的是，通过降低发射的声功率，可以尽量减少气泡散射引起的焦点前加热和病灶形成。
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig1.jpg" alt="在37°C水箱中使用水凝胶进行HIFU换能器实验；组织模拟装置示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 采用仿组织水凝胶进行超声实验的实验装置示意图。
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig2.jpg" alt="粒径分布图，直径与相对强度关系，经100/200 nm滤膜挤出。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 聚苯乙烯纳米颗粒乳液（PSNE）经100 nm或200 nm滤膜挤出后的粒径分布，通过动态光散射法测定。纵坐标单位基于特定尺寸颗粒散射光强度相对于样品总散射光强度的比例。
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig3.jpg" alt="超声成像对比；图B中箭头标示出检测到的结构区域。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 聚丙烯酰胺水凝胶中PSNE汽化前（a）和汽化后（b）的B型超声图像。箭头指示由PSNE汽化形成气泡云的焦点区域。
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig4.jpg" alt="云种实验的显微镜图像；A) 对照组；B) 观察到的云形成。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
 图4. 含有白蛋白和PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶在（a）超声诱导汽化与HIFU声处理前和（b）处理后的图像，显示了因超声加热导致的病灶形成。超声中心频率为3.3 MHz。超声信号包括一个初始的30个周期、6.4 W脉冲用于汽化PSNE，紧接着是15秒、0.77 W的连续超声。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td rowspan="2">挤出后天数</td>
 <td colspan="2">使用 200 nm 滤膜挤出</td>
 <td colspan="2">使用 100 nm 滤膜挤出</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>平均直径 (nm)</td>
 <td>标准偏差 (nm)</td>
 <td>平均直径 (nm)</td>
 <td>标准偏差 (nm)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>182.9</td>
 <td>4.9</td>
 <td>118.0</td>
 <td>0.9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>177.7</td>
 <td>2.5</td>
 <td>124.8</td>
 <td>3.1</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 使用100 nm和200 nm滤膜挤出后第1天和第7天PSNE的平均直径及标准差。

<ol><li>Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-guided+noninvasive+ultrasound+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MRI-guided noninvasive ultrasound surgery.</a> Med. Phys. 20, 107-115 (1993).</li>
<li>Baban, D. F., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumour+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of tumour vascular permeability.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Schadlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+accumulation+of+NIR+fluorescent+PEG-PLA+nanoparticles%3A+impact+of+particle+size+and+human+xenograft+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model.</a> ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).</li>
<li>Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+R+%222010+IEEE+Ultrasonics+Symposium%22">2010 IEEE Ultrasonics Symposium</a>. , (2010).</li>
<li>Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+manufacture+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).</li>
<li>Giesecke, T., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-mediated+cavitation+thresholds+of+liquid+perfluorocarbon+droplets+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro.</a> Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+Acoustic+Studies+of+a+New+Phase-Shift+Agent+for+Diagnostic+and+Therapeutic+Ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound.</a> Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).</li>
<li>Sheeran, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Application+of+Phase-Shift+Nanoemulsion+in+High+Intensity+Focused+Ultrasound%3A+An+In+Vitro+Study+%5BDoctoral+%5D%22">The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]</a>. , (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+containing+synthetic+lipid+derivatives+of+poly%28ethylene+glycol%29+show+prolonged+circulation+half-lives+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29+5000+to+prolong+the+circulation+time+of+liposomes+depends+on+the+liposome+size+and+is+unfavorable+for+immunoliposome+binding+to+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipathic+polyethyleneglycols+effectively+prolong+the+circulation+time+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes.</a> FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).</li>
<li>Gabizon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+Doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li>
<li>Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+biodistribution+profiles+of+long-circulating+PEG-liposomes+of+various+sizes+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits.</a> Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).</li>
<li>Zhang, P., Porter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+a+phase-shift+nanoemulsion%3A+a+potential+nucleation+agent+for+bubble-enhanced+HIFU+tumor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation.</a> Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).</li>
<li>Lafon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+phantom+for+use+in+high-intensity+focused+ultrasound+dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry.</a> Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

高强度聚焦超声（HIFU）在临床上用于对肿瘤进行热消融。1 为了增强局部加热效果并提高肿瘤内的热消融效率，已开发出脂质包被的全氟碳化物液滴，这类液滴可被HIFU汽化。许多肿瘤的血管结构由于其快速生长而异常通透。2 因此，纳米颗粒能够穿透这些孔隙并在肿瘤内被动富集，这一过程称为增强渗透与滞留（EPR）效应。3 研究表明，粒径在70至200 nm之间的纳米颗粒在肿瘤中的富集效率最高。4 本报告所述方法可制备出具有窄粒径分布的稳定相变型纳米乳剂（PSNE），即脂质包被的全氟碳化物液滴。以往大多数研究使用的是粒径分布较宽的PSNE，但近期研究则集中于制备粒径分布较窄的PSNE。5,6 本实验方案中描述的挤出法可精确控制颗粒尺寸，从而提高经系统给药后能在肿瘤内富集的液滴比例。
纳米液滴的核心成分为十二氟戊烷，其沸点为 29 °C7。因此，在PSNE制备的每一步中均需保持较低温度。超声处理会使溶液温度升高，但采用脉冲式超声程序并在超声过程中将样品置于冰水浴中，可减...

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avanti Lipids，阿拉巴斯特，AL，美国</td><td>850355P</td><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱</td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avanti Lipids，阿拉巴斯特，AL，美国</td><td>880120P</td><td>1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷&amp;#8211;乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）</td></tr><tr><td>DDFP</td><td>Fluoromed，朗德罗克，TX，美国</td><td>CAS: 138495-42-8</td><td>十二氟戊烷（C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;F&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;）</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>P2194</td><td>磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>372978</td><td>氯仿</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>A9926</td><td>40% 19:1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺</td></tr><tr><td>Tris 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>T2694</td><td>1 M，pH 8，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和三羟甲基氨基甲烷碱</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>A3059</td><td>牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>A3678</td><td>过硫酸铵溶液</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国</td><td>87689</td><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>超声波破碎仪（3 mm 探头）</td><td>Sonics Materials, Inc.，纽顿，CT，美国</td><td>Vibra-Cell</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国</td><td>Neslab EX-7</td><td></td></tr><tr><td>挤出器</td><td>Northern Lipids，伯纳比，BC，加拿大</td><td>LIPEX</td><td></td></tr><tr><td>挤出器滤膜</td><td>Whatman，皮斯卡特维，NJ，美国</td><td>Nuclepore #110605 和 #110606</td><td></td></tr><tr><td>挤出器排水盘</td><td>Sterlitech Corporation，肯特，WA，美国</td><td>#PETEDD25100</td><td></td></tr><tr><td>塑料腔室</td><td>U.S. Plastic Corporation，利马，OH，美国</td><td>#55288，1 3/16&quot; × 1 3/16&quot; × 2 7/16&quot;</td><td></td></tr></tbody></table>

用于声致液滴汽化及气泡增强超声介导消融的窄分布相变型纳米乳液的合成

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

高强度聚焦超声（HIFU）在临床上用于通过热效应消融肿瘤。为了增强局部加热效果并提高肿瘤内的热消融效率，已开发出可被HIFU汽化的脂质包覆全氟碳液滴。许多肿瘤的血管结构因快速生长而异常通透，纳米颗粒能够通过这些缝隙被动渗入并在肿瘤内积聚。因此，调控液滴的尺寸可实现其在肿瘤内更有效的富集。本文报道了一种制备粒径分布均一的相变型纳米乳液（PSNE）中稳定液滴的方法。PSNE通过在液态全氟碳存在下对脂质溶液进行超声处理而合成。通过使用孔径为100 nm或200 nm的滤膜多次挤出，获得粒径分布均一的PSNE。在7天内采用动态光散射法测定其粒径分布。制备了含有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶，用于 体外 实验中，水凝胶内的PSNE液滴通过超声波汽化，所产生的气泡增强了局部加热效果。PSNE的汽化可实现更快的升温，同时降低热消融所需的超声强度。因此，PSNE有望增强肿瘤中的热消融效果，从而可能改善HIFU介导的热消融治疗的疗效。

相变型纳米乳剂（PSNE）可通过高强度聚焦超声触发汽化，从而增强局部加热效果，提高肿瘤热消融效率。本报告描述了具有窄粒径分布的稳定PSNE的制备方法，并在模拟组织的体模中展示了汽化后PSNE对超声介导消融效果的影响。

高强度聚焦超声（HIFU）在临床上用于通过热能消融肿瘤。为增强局部加热效果并改善热消融效率……

以下实验的总体目标是观察通过超声介导汽化脂质包覆纳米乳剂所产生的气泡对超声消融的影响。该目标首先通过将脂质包覆的纳米乳剂均匀分散于白蛋白负载的聚丙烯酰胺水凝胶中来实现。第二步，使用聚焦换能器向水凝胶发射短时高幅超声脉冲，使纳米乳剂在焦点处局部汽化；随后，利用连续超声驱动所产生的气泡，气泡辐射的声能被水凝胶迅速吸收，从而加快超声介导加热的速率。结果表明，气泡的存在显著缩短了将水凝胶加热至蛋白质变性阈值温度以上所需的时间和能量，从而实现了更快、更高效的超声介导消融。相变纳米乳剂的尺寸是决定压力阈值的关键因素。针对声致汽化，我们已开发出一种制备稳定相变纳米乳剂的方案，该方案可获得粒径分布窄、汽化阈值明确的纳米乳剂，同时建立了一套体外系统，用于评估其对超声介导消融效果的影响。尽管描述的是体外系统，但纳米乳剂的设计旨在靶向血管外组织和实体瘤，其颗粒可通过声学作用发生汽化。所形成的气泡随后可用于癌症诊疗中的诊断或治疗应用。开始制备相变纳米乳剂（PSNE）时，首先将脂质混合，溶解11毫克DPPC和1.7毫克DSPE。将氯仿中的Peg 2000加入玻璃圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于化学通风橱内50摄氏度的水浴中，通入氩气流以蒸发有机溶剂。为形成干燥的脂质膜，将烧瓶放入干燥器中，于真空条件下过夜干燥，次日上午即可得到干燥的脂质膜。用 5.5 毫升 PBS 重新水合脂质膜。将溶液置于 45 °C 水浴中加热，直至脂质膜完全溶解，用于后续实验。定期将脂质溶液转移至 7 毫升小瓶中，然后使用探头超声仪在 20% 振幅下超声处理 2 分钟。将溶液分装至两个小瓶中，每瓶2.5毫升。剩余的0.5毫升弃去。向每瓶中加入2.5毫升PBS，然后将两瓶样品置于0°C的冰水浴中。向每份样品中加入 50 µL 的十二氟戊烷（DDFP）。将 DDFP 脂质混合物在冰水浴中进行超声处理，这是该实验步骤中最关键的部分。冰水浴用于防止每种氟碳液体蒸发。在此过程中，将每个小瓶置于冰水浴中进行超声处理，设置参数如下：25% 振幅，脉冲模式，总时间为60秒。超声处理后，将PSNE溶液转移至20毫升闪烁小瓶中，每瓶加入5毫升PBS，使每瓶最终体积为10毫升。按照制造商的说明组装挤出机以启动挤出机。将10毫升去离子水移液至顶部样品口。盖上开口并拧紧排气阀。缓慢打开氮气管路以增加压力，迫使样品通过膜。从出口管路收集样品，将PSNE通过100纳米或200纳米滤膜挤出16次，以获得较窄的粒径分布。首先制备含有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶，开始此实验步骤。首先，通过将2.4克牛血清白蛋白（BSA）粉末溶解于10毫升去离子水中，制备24%的牛血清白蛋白（BSA）溶液。接着，通过将1克过硫酸铵（APS）粉末溶解于10毫升去离子水中，制备10%的过硫酸铵（APS）溶液。按以下顺序将这些试剂加入塑料模具中：2.1毫升丙烯酰胺溶液、1.2毫升Tris缓冲液、0.1毫升10% APS溶液、4.5毫升24% BSA溶液以及3.6毫升去离子水。将混合液置于水浴中加热至40摄氏度，随后放入真空环境中脱气一小时。此步骤旨在防止一小时后水凝胶内产生不必要的气泡。从真空环境中取出后，加入480微升PSNE悬浮液，并通过轻轻旋转塑料腔室使其充分混合。在化学通风橱中，加入12微升四乙基乙二胺（T-E-M-E-D）以聚合丙烯酰胺，然后将腔室置于12摄氏度水浴中反应两小时。聚合反应是放热过程，因此需要使用冷却浴以避免在聚合过程中PSE挥发。待丙烯酰胺聚合完成后，将聚焦功率换能器和成像探头置于装有去离子水的丙烯酸树脂水箱中，使成像平面与换能器的焦体积重叠。接下来，将载有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶置于功率换能器的焦点位置，利用短脉冲声波使水凝胶内的PSNE发生汽化，随后进行15秒的连续波照射，以实现气泡增强的消融作用。由于BSA发生变性，水凝胶因吸收超声波并在监测过程中产生热量，导致汽化和气泡形成，从而变得不透明。在本示例图像中，箭头指示的是由PSNE汽化形成的气泡云的焦点区域。在水凝胶的另一位置重复进行声学照射，无需取出PSNE，以比较消融时间和消融体积。该方案可制备具有窄粒径分布的脂质包覆全氟碳化物液滴。此处展示了使用100和200纳米滤膜挤出的PSNE通过动态光散射测得的粒径分布。纵坐标轴的单位基于特定粒径颗粒散射光强度相对于样品总散射光强度的比例。使用动态光散射法测量经100和200纳米滤膜挤出后1天和7天时PSNE的平均直径及标准偏差，结果显示PSNE至少在一周内保持稳定。该图显示了PSNE在汽化前后的B模式图像。在聚丙烯酰胺水凝胶中，箭头指示了由PSNE汽化形成的气泡云的焦点区域。这些是含有白蛋白和PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶在高强度聚焦超声（Hy Fu）介导的汽化和空化处理前后的图像。通过Hy Fu介导加热15秒后形成凝固性损伤灶。损伤灶的非对称形状是由于超声传播路径中存在气泡云，导致焦前区域产生加热所致。在气泡云形成后，通过降低发射的声功率，可减少因气泡散射引起的焦前加热和损伤灶的形成。这种制备稳定相变纳米乳剂的方法将为超声介导治疗领域的研究人员探索气泡增强型高强度聚焦超声（HIFU）消融实体瘤提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备粒径分布均一的稳定相变纳米乳剂，并开展气泡成核及增强型超声介导消融的研究。

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