用于声致液滴汽化及气泡增强超声介导消融的窄分布相变型纳米乳液的合成

以下实验的总体目标是观察通过超声介导汽化脂质包覆纳米乳剂所产生的气泡对超声消融的影响。该目标首先通过将脂质包覆的纳米乳剂均匀分散于白蛋白负载的聚丙烯酰胺水凝胶中来实现。第二步，使用聚焦换能器向水凝胶发射短时高幅超声脉冲，使纳米乳剂在焦点处局部汽化；随后，利用连续超声驱动所产生的气泡，气泡辐射的声能被水凝胶迅速吸收，从而加快超声介导加热的速率。

结果表明，气泡的存在显著缩短了将水凝胶加热至蛋白质变性阈值温度以上所需的时间和能量，从而实现了更快、更高效的超声介导消融。相变纳米乳剂的尺寸是决定压力阈值的关键因素。针对声致汽化，我们已开发出一种制备稳定相变纳米乳剂的方案，该方案可获得粒径分布窄、汽化阈值明确的纳米乳剂，同时建立了一套体外系统，用于评估其对超声介导消融效果的影响。

尽管描述的是体外系统，但纳米乳剂的设计旨在靶向血管外组织和实体瘤，其颗粒可通过声学作用发生汽化。所形成的气泡随后可用于癌症诊疗中的诊断或治疗应用。开始制备相变纳米乳剂（PSNE）时，首先将脂质混合，溶解11毫克DPPC和1.7毫克DSPE。

将氯仿中的Peg 2000加入玻璃圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于化学通风橱内50摄氏度的水浴中，通入氩气流以蒸发有机溶剂。为形成干燥的脂质膜，将烧瓶放入干燥器中，于真空条件下过夜干燥，次日上午即可得到干燥的脂质膜。

用 5.5 毫升 PBS 重新水合脂质膜。将溶液置于 45 °C 水浴中加热，直至脂质膜完全溶解，用于后续实验。定期将脂质溶液转移至 7 毫升小瓶中，然后使用探头超声仪在 20% 振幅下超声处理 2 分钟。

将溶液分装至两个小瓶中，每瓶2.5毫升。剩余的0.5毫升弃去。向每瓶中加入2.5毫升PBS，然后将两瓶样品置于0°C的冰水浴中。

向每份样品中加入 50 µL 的十二氟戊烷（DDFP）。将 DDFP 脂质混合物在冰水浴中进行超声处理，这是该实验步骤中最关键的部分。

冰水浴用于防止每种氟碳液体蒸发。在此过程中，将每个小瓶置于冰水浴中进行超声处理，设置参数如下：25% 振幅，脉冲模式，总时间为60秒。超声处理后，将PSNE溶液转移至20毫升闪烁小瓶中，每瓶加入5毫升PBS，使每瓶最终体积为10毫升。

按照制造商的说明组装挤出机以启动挤出机。将10毫升去离子水移液至顶部样品口。盖上开口并拧紧排气阀。

缓慢打开氮气管路以增加压力，迫使样品通过膜。从出口管路收集样品，将PSNE通过100纳米或200纳米滤膜挤出16次，以获得较窄的粒径分布。首先制备含有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶，开始此实验步骤。

首先，通过将2.4克牛血清白蛋白（BSA）粉末溶解于10毫升去离子水中，制备24%的牛血清白蛋白（BSA）溶液。接着，通过将1克过硫酸铵（APS）粉末溶解于10毫升去离子水中，制备10%的过硫酸铵（APS）溶液。按以下顺序将这些试剂加入塑料模具中：2.1毫升丙烯酰胺溶液、1.2毫升Tris缓冲液、0.1毫升10% APS溶液、4.5毫升24% BSA溶液以及3.6毫升去离子水。将混合液置于水浴中加热至40摄氏度，随后放入真空环境中脱气一小时。

此步骤旨在防止一小时后水凝胶内产生不必要的气泡。从真空环境中取出后，加入480微升PSNE悬浮液，并通过轻轻旋转塑料腔室使其充分混合。在化学通风橱中，加入12微升四乙基乙二胺（T-E-M-E-D）以聚合丙烯酰胺，然后将腔室置于12摄氏度水浴中反应两小时。

聚合反应是放热过程，因此需要使用冷却浴以避免在聚合过程中PSE挥发。待丙烯酰胺聚合完成后，将聚焦功率换能器和成像探头置于装有去离子水的丙烯酸树脂水箱中，使成像平面与换能器的焦体积重叠。接下来，将载有PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶置于功率换能器的焦点位置，利用短脉冲声波使水凝胶内的PSNE发生汽化，随后进行15秒的连续波照射，以实现气泡增强的消融作用。

由于BSA发生变性，水凝胶因吸收超声波并在监测过程中产生热量，导致汽化和气泡形成，从而变得不透明。在本示例图像中，箭头指示的是由PSNE汽化形成的气泡云的焦点区域。在水凝胶的另一位置重复进行声学照射，无需取出PSNE，以比较消融时间和消融体积。

该方案可制备具有窄粒径分布的脂质包覆全氟碳化物液滴。此处展示了使用100和200纳米滤膜挤出的PSNE通过动态光散射测得的粒径分布。纵坐标轴的单位基于特定粒径颗粒散射光强度相对于样品总散射光强度的比例。

使用动态光散射法测量经100和200纳米滤膜挤出后1天和7天时PSNE的平均直径及标准偏差，结果显示PSNE至少在一周内保持稳定。该图显示了PSNE在汽化前后的B模式图像。在聚丙烯酰胺水凝胶中，箭头指示了由PSNE汽化形成的气泡云的焦点区域。

这些是含有白蛋白和PSNE的聚丙烯酰胺水凝胶在高强度聚焦超声（Hy Fu）介导的汽化和空化处理前后的图像。通过Hy Fu介导加热15秒后形成凝固性损伤灶。损伤灶的非对称形状是由于超声传播路径中存在气泡云，导致焦前区域产生加热所致。在气泡云形成后，通过降低发射的声功率，可减少因气泡散射引起的焦前加热和损伤灶的形成。

这种制备稳定相变纳米乳剂的方法将为超声介导治疗领域的研究人员探索气泡增强型高强度聚焦超声（HIFU）消融实体瘤提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备粒径分布均一的稳定相变纳米乳剂，并开展气泡成核及增强型超声介导消融的研究。