人类多能干细胞的神经元在一个Multititre的板格式的快速和高效地生成
2013年3月5日
人类多能性干细胞（神经元分化hPSCs）的协议往往是费时的，并需要大量的细胞培养的技能。在这里，我们已经适应了小分子的分化过程，一个multititre板格式，可以简单，快速，高效的人类神经元的产生可控制的方式。
以下实验的总体目标是使用多滴度板格式将人多能干细胞或 H PSC 分化为神经元。这是通过收获 H PSC 的单细胞悬液并将其接种到 V 底 96 中来实现的。孔板在一夜之间形成胚胎体或 EBS。
接下来，将 EBS 转移到含有分化培养基的 U 形超低附着板中，以诱导神经外胚层形成。随后，将 EBS 接种在基质胶涂层的培养皿上，以促进神经元的生长。通过免疫荧光，可以获得显示第 8 天左右存在典型神经元标志物的结果。
将人前效干细胞分化为神经元的染色方案通常复杂而乏味。有点偶然。我们遇到了一个非常简单的程序，可以从人类前效干细胞中制造神经元。
从技术角度来看，现有方法的这种技术的主要优点是易于实施、快速且成本效益高。同时，介绍该程序的将是实验室的 MI Z 博士。按照书面方案中的概述制备 EB 形成培养基和分化培养基。
在无饲养层条件下生长 h PSC，例如在基质胶包被板上使用甲基条件培养基，或在亚汇合活跃生长条件下使用化学定义的培养系统。使用带有无菌塑料移液器吸头的立体显微镜机械去除自发分化的菌落。用 PBS 洗涤剩余的未分化菌落，并使用含有 1 x rock 抑制剂的 Accutane 消化成单细胞。
以 200 G 离心 2 分钟，使单细胞沉淀，然后 Resus 悬浮于少量 EB 形成培养基中。使用血细胞仪测定细胞滴度。向剩余的 EB 形成培养基中加入额外的细胞，以达到每毫升 40， 000 至 80， 000 个细胞的滴度。
使用多通道移液器将每孔 100 微升转移到 96 V 底板中，每孔产生 4， 000 至 8， 000 个细胞。井。将板放入 400 G 水平水平水平离心的水平板中离心 1 分钟，以收集孔底的所有细胞。将细胞转移到培养箱中，让 EBS 第二天在立体显微镜下过夜形成。
收集 EBS 并以小体积转移到含有 2 毫升分化物的 3.5 厘米细菌培养皿中。中等。轻轻旋转培养皿清洗细胞。向超低附着 U 的每个孔中加入 100 微升分化培养基。
体视显微镜下的底部 96 孔板。将小体积 EBS 从洗涤皿转移到 96 U 孔中。将 EBS 孵育 4 天，以便在第 4 天形成神经外胚层。
在分化培养基中洗涤细胞，并将它们逐个接种到基质胶包被的多滴定板（如 12 孔板）的孔中。细胞应在孔内均匀分布，以允许神经元不受干扰地生长。让 EBS 在室温下松散地附着在基质胶上约 10 分钟。
然后小心地将板转移到培养箱中。神经元将在接下来的四天内以放射状方式从电镀的 EBS 中长出。之前我们表明，与许多其他方法一样，来自 H PSC 的 EBS 可以简单地通过重新铺板生成，在将 H HPC 常规分裂成低附着培养皿时
聚集。这通常会导致像元大小分布较宽。另一个问题是，维持在悬浮液中的 EBS 往往会彼此聚集，导致更大的异质性，以规避这种单一的 H PSC 在低附着孔中，这导致没有 EB 形成和细胞死亡。然而，将细胞存活分子 Y 2 7 6 3 2 与聚乙烯醇结合，聚乙烯醇已被证明可以增强 HSC 形成 EB，从而可以在夜间从单细胞 HESC 悬浮液中形成 EBS。
方便的是，这种多滴定板规格的 EB 大小可以通过每孔放置不同数量的细胞来严格控制。与使用传统技术相比，将 EBS 转移到超低附着 96 U 板后，使用由 F-G-F-E-R-K-T-G、TGF β SMA 二和 BP SMA 一抑制剂组成的小分子混合物诱导神经外胚层形成，然后允许细胞接种在基质胶上以产生神经元。从大约 8， 000 个细胞开始 EB 形成产生了最佳的神经元分化能力，其特征是电镀的 ebs 出现明显的神经元生长。
接种后坏死的 EB 中心减少，感觉和泛神经元标志物如 B rrn 3 A 和 β 3 微管蛋白的高表达。总体神经元分化效率似乎与原始程序相当，到目前为止，原始程序适用于 HSC 和 HI PSC。三种独立的 HPSC 细胞系、HES 和 HIPS 细胞已在多孔程序中成功进行了测试，而通常不能排除细胞系依赖性变异性和分化效率。
该图显示了分离的单天 4 个神经外胚层细胞，这些细胞被铺板为单细胞，并以大约 60% 的效率成功分化。在多滴度平台中处理 EBS 开始时需要一些培训，但一段时间后，您会发现这很容易。
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概述
本文介绍了一种使用多孔板格式将人类多能干细胞（hPSCs）分化为神经元的协议。该方法简化了过程，使其快速高效，同时保持对分化的控制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 细胞分化
背景
- 人类多能干细胞（hPSCs）可以分化为各种细胞类型。
- 传统的分化协议通常复杂且耗时。
- 高效产生神经元对神经科学研究至关重要。
- 使用多孔板格式可以简化过程。
研究目的
- 开发一种简化的hPSCs神经元分化协议。
- 以受控方式快速产生神经元。
- 便于研究目的获得神经元培养。
所用方法
- 将hPSCs收集并接种到V底96孔板中。
- 在一夜之间形成胚体（EBs）。
- 将EBs转移到U型超低附着力板中，并加入分化培养基。
- 将EBs接种到涂有matrigel的培养皿上，以促进神经元生长。
主要结果
- 在第八天左右观察到典型的神经元标记物。
- 免疫荧光确认了神经元分化。
- 使用该协议高效产生了神经元。
- 该方法允许在研究中进行高通量应用。
结论
- 改进的协议提供了一种快速高效的方法来从hPSCs产生神经元。
- 使用多孔板格式简化了分化过程。
- 这种方法可以增强神经科学的研究能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, scalable generation of functional neurons from human pluripotent stem cells in a multi-titre plate format, addressing the need for efficient, reproducible neuronal models in early-stage drug discovery. By eliminating multi-step precursor expansion and using a chemically defined, small-molecule-based approach, it reduces technical complexity and supports mid-throughput screening applications. The method provides a de-risked source of human sensory-like neurons for target validation and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuroectoderm induction and neuronal differentiation pathways using defined small-molecule inhibition of TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK signaling.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing in a 96-well format, reducing time from pluripotent stem cells to functional neurons to eight days.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces neurons expressing pan-neuronal (beta-III tubulin) and sensory (Brn3a) markers, suitable for screening compounds affecting neuronal maturation or function.
- Operational Value: Compatible with multi-titre plate formats, allowing standardized seeding, differentiation, and readout in V-bottom and ultra-low attachment plates for assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated across three independent hPSC lines (HES and hiPSCs), supporting cross-line consistency for disease-relevant modeling.
- Operational Value: Enables scalable production of neurons for downstream functional assays, including electrophysiology or high-content imaging, without requiring specialized differentiation expertise.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through rapid neuronal differentiation and enabling lead identification via compound screening in a format compatible with automated liquid handling and imaging platforms.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by providing a defined system to study neuroectoderm formation and neuronal outgrowth from pluripotent stem cells.
- Screening: Yields adherent neurons from embryoid bodies plated on matrigel, allowing standardized compound exposure and phenotypic readout in multi-well formats.
- Analytics: Enables quantitative assessment via immunofluorescence for neuronal markers (e.g., beta-III tubulin, Brn3a) at day eight, supporting dose-response and hit confirmation.
- Translational Research: Uses human pluripotent stem cells to generate neurons with sensory neuron characteristics, offering translational relevance for peripheral nervous system targets.
- Enterprise Reuse: The multi-titre plate format supports assay standardization across teams and sites, reducing variability in neuronal differentiation for repeated screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal differentiation efficiency (~60% in optimized conditions) and marker expression reduces ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Simple, chemically defined medium with small-molecule inhibitors eliminates need for complex growth factor changes or feeder layers.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in target validation by providing rapid access to functional human neurons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroscience targets through reproducible, scalable neuronal model generation.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture training for embryoid body handling and multi-titre plate transfers.
- Depends on access to V-bottom 96-well, U-shaped ultra-low attachment, and matrigel-coated plates for embryoid body formation and neuronal outgrowth.
- Necessitates standardization of small-molecule inhibitor concentrations (TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF/ERK) across batches for consistent neuroectoderm induction.
- Adaptation to other neuronal subtypes may require protocol optimization beyond the sensory neuron-biased output observed.
- Limited to adherent differentiation outcomes; not suited for suspension-based or 3D organoid applications without modification.
