Name: 原位主动脉瓣移植在小鼠血管疾病的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习原位主动脉移植技术用于研究小鼠血管疾病。该方法通过端端血管吻合术植入供体腹主动脉，为研究移植后血管病变和免疫反应提供可靠的实验模型。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）P30 O'Brien 中心的核心资源（DK 079337）资助。

1. 术前准备
<ol>
	<li>无论手术操作多么精细，都会造成显著的应激反应。为了最大限度地减轻此类应激的影响并增强动物的生理储备，动物在使用前应在动物实验设施中至少适应 72 小时10,11。</li>
	<li>手术器械、纱布和棉签必须无菌。只要确保仅器械尖端接触缝线或手术区域，操作者无需佩戴无菌手套。</li>
	<li>为了实现止血，夹闭压力必须控制在最低必要水平。因压力过大或操作粗暴导致的血管损伤可引发血栓形成，进而造成后肢瘫痪、肠缺血，并在 24 小时内导致死亡。我们发现，使用夹闭压力不超过 2 gm/cm2的血管夹可有效避免该问题。此类血管夹详见表 1。高质量外科器械制造商提供的产品说明书中通常会标明血管夹的压力参数。我们发现，廉价或一次性血管夹普遍存在压力过大的问题。</li>
	<li>侧支血管的位置以及腹主动脉与下腔静脉（IVC）的相对位置因小鼠品系而异。此外，个体小鼠之间也存在细微差异，尤其是侧支血管的位置。</li>
</ol>
2. 供体手术
<ol>
	<li>可使用异氟烷（1.5–2.5%诱导，1.0%维持，以空气为载体）或戊巴比妥钠（55–65 mg/kg）对小鼠进行麻醉。戊巴比妥钠的麻醉时间有限（最长1.5小时），但可根据需要将动物旋转，以便于手术操作。若手术中需要，可在肠或肝脏表面滴加2–3滴麻醉剂，将麻醉时间延长至2小时。经验丰富的外科医生也可使用氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮100 mg/kg体重，赛拉嗪7 mg/kg，腹腔注射），但该组合安全剂量范围较窄，且手术需在1至1.5小时内完成。近年来，由于供应短缺，美国对戊巴比妥钠的使用已变得更加困难。必须密切监测麻醉深度，确保其充分有效。脚趾夹捏反射是判断麻醉深度的最佳指标，但也应同时观察呼吸频率及其他运动反应。</li>
	<li>麻醉诱导后，使用脱毛膏或剃毛器去除腹部腹侧的毛发。</li>
	<li>使用实验室胶带将动物固定在手术板上，呈仰卧伸展体位。金属手术板可在其下方放置加热垫，以在手术期间维持体温。我们手动控制加热垫的温度，该设备为家用消费级产品，温度维持在35–38°C之间。金属手术板也便于在不同手术之间进行消毒。</li>
	<li>使用氯己定等消毒剂对术区进行消毒，随后用乙醇冲洗。重复此步骤三次，以确保充分消毒。此过程还可清除可能残留的断发。</li>
	<li>使用剪刀切开腹壁，暴露腹腔脏器。</li>
	<li>用棉签将脏器轻轻推至一侧，以暴露腹部大血管。脏器应置于浸有温盐水的纱布上，以保持湿润。</li>
	<li>采用钝性分离技术，仔细将腹主动脉从周围组织中游离。分离血管时需特别注意避免损伤下腔静脉。可能存在一条或多条分支（如腰动脉），需小心提起并电凝处理。游离的主动脉段应位于肾动脉下方、主动脉分叉为股动脉上方。根据分支血管数量及供体动物大小，该段主动脉可作为最多两个受体的供体材料。</li>
	<li>在肾动脉下方和主动脉分叉上方各结扎一道缝线。用剪刀切断主动脉，用含200 U/ml肝素的生理盐水彻底冲洗移植物。小心持握血管一端，滴加生理盐水，使其在重力作用下流经血管腔。切勿让气泡通过血管。尽可能减少对血管断端的操作，以免损伤内膜，导致后续血栓形成。将血管移出术区，立即放入盛有冰盐水的容器中。允许供体动物放血处死。</li>
</ol>
3. 受体操作
<ol>
	<li>按上述方法麻醉动物，并使用脱毛膏或剃须刀去除腹部毛发。在切口前，皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡以建立镇痛效果。</li>
	<li>使用实验室胶带将动物固定在手术区域。动物必须固定在温控手术台上，以帮助维持术中体温。</li>
	<li>在眼睛上涂抹庆大霉素眼膏，防止角膜干燥。</li>
	<li>对腹部进行消毒，随后用乙醇清洗。重复此步骤三次，以确保充分消毒。</li>
	<li>在进入下一步操作前，再次确认麻醉深度是否足够。</li>
	<li>分两步沿中线切开皮肤和腹壁，注意避免损伤下方组织。</li>
	<li>插入牵开器以保持腹部切口开放。将螺钉组件朝向尾端放置，使夹子主体部分远离操作区域。</li>
	<li>用生理盐水浸湿一块无菌纱布，覆盖在肠管上。手指轻压纱布，将棉签插入肠管下方，轻柔地将肠管推至一侧，使其置于纱布上方。再取另一块纱布覆盖在肠管上，并用生理盐水润湿。</li>
	<li>清除覆盖在腹主动脉和下腔静脉（IVC）上的脂肪组织。操作需轻柔，因下腔静脉极为脆弱。</li>
	<li>使用镊子轻柔地将肾下腹主动脉与下腔静脉分离。分离出足够大的区域，以便放置两个血管夹，且两夹之间保留足够的血管长度，使得切断后仍有足够长度用于吻合移植物。分离过程中注意观察血管分支，必要时使用低温电凝器进行凝固处理。</li>
	<li>在肾动脉下方和分叉上方各放置一个血管夹。</li>
	<li>切断腹主动脉。主动脉断端通常会回缩，形成约5 mm的间隙。检查止血情况。若血管夹功能正常，切割后仅有少量血液渗出。若持续出血，应检查血管夹是否被异物干扰。注意：不切除任何主动脉组织，仅将其切断。</li>
	<li>用含肝素的生理盐水（200 U/ml）冲洗切断的血管断端，然后用棉签吸除多余液体。</li>
	<li>使用三个间断缝线将移植物固定到位，每端各三个。先在每一端完成吻合口一侧的缝合，然后用连续缝合或更多间断缝线完成其余部分。每端七至八个间断缝线已足够。若采用连续缝合，需确保血管壁保持松弛，避免吻合口狭窄。</li>
	<li>小心移除头端的血管夹，观察缝合线处是否有渗漏。少量渗漏可接受，只要在一分钟左右停止即可。若渗漏较多，可用单针缝合止血。</li>
	<li>用湿润的棉签轻轻按压吻合口上方的主动脉，然后移除第二个血管夹。轻压并松开数次，检查主动脉是否通畅。移植物将立即被灌注，且可见搏动。</li>
	<li>移除覆盖肠管的纱布，将肠管复位。避免肠管扭转，保持正常解剖位置。</li>
	<li>使用5-0 Vicryl线缝合肌肉层。</li>
	<li>使用5-0或6-0 Prolene线缝合皮肤。</li>
	<li>在终止麻醉前，皮下注射5 mg/kg卡洛芬以增强镇痛效果。</li>
	<li>皮下注射0.5–0.8 ml生理盐水给小鼠。</li>
	<li>将小鼠置于加热笼中恢复。恢复期间密切监测其状态，确保恢复正常。术后2–3小时，小鼠行为应基本正常。术后12小时，皮下注射2 mg/kg丁丙诺啡以提供镇痛。若动物出现弓背、发出声音或活动范围受限等情况，应立即排查原因。若无法明确病因或无法纠正，应根据机构规程实施安乐死。术后24小时，再次皮下注射5 mg/kg卡洛芬。后肢瘫痪提示吻合失败或血栓形成，此种情况下应实施安乐死。</li>
</ol>

<ol><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+the+establishment+of+a+murine+model+of+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation.</a> Microsurgery. 18, 368-371 (1998).</li>
<li>Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+aortic+transplantation+in+mice%3A+a+new+model+of+allograft+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis.</a> J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).</li>
<li>Calise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+aortic+transplantation+in+rodents+by+the+sleeve+technique%3A+a+model+system+for+the+study+of+graft+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Proc%22%5BJournal%5D)">Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease.</a> Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).</li>
<li>Thomsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+aortic+graft+mouse+model+to+study+the+immunopathology+of+chronic+vascular+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Proc%22%5BJournal%5D)">An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection.</a> Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).</li>
<li>Benza, R. L., George, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+graft+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Aortic graft transplantation in mice.</a> J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).</li>
<li>Chereshnev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+heterotopic+aortic+arch+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation.</a> The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).</li>
<li>Cho, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+heterotopic+aortic+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Korean+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice.</a> J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).</li>
<li>Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+transplantation+in+mice%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Organ transplantation in mice: current status and future prospects.</a> Microsurgery. 19, 52-55 (1999).</li>
<li>George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+mouse+models+and+the+molecular+mechanisms+of+post-transplant+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease.</a> J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).</li>
<li>Gorska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+in+laboratory+animal+research+for+experimental+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">Principles in laboratory animal research for experimental purposes.</a> Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).</li>
<li>Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shipping+on+the+immune+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of shipping on the immune function in mice.</a> Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+the+establishment+of+a+murine+model+of+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation.</a> Microsurgery. 18, 368-371 (1998).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+rescues+heme+oxygenase-1-deficient+mice+from+arterial+thrombosis+in+allogeneic+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation.</a> Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice.+Transpl%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl.</a> Proc. 5, 733-735 (1973).</li>
<li>Chang, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anastomosis+using+controlled+phase+transitions+in+poloxamer+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels.</a> Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

主动脉移植的小鼠模型具有多项优势，因为小鼠的免疫遗传学特征已被充分阐明9,12,13，并且可根据需要方便地对其进行基因操作，以改变特定基因的表达。如引言中所述，由于血管尺寸较小，小鼠的血管手术比大多数动物模型更具挑战性。即使是大动脉（如主动脉），其内径通常也不超过100–200 μm；因此，操作这些血管需要相当高的技巧和灵巧性8,14。初学者在开展此类手术时最常见的并发症是后肢瘫痪，通常由内膜损伤导致的血栓形成引起，而内膜损伤多因操作粗暴或夹闭不当所致。市售的显微外科器械公司提供的大多数血管夹施加的压力过大，不适用于小鼠，其压力通常超过25 gm/cm2。我们所使用的血管夹表面光滑，压力为2 gm/cm2，该压力足以实现止血而又不会损伤血管。一些外科医生倾向于使用缝线而非血管夹。我们不推荐这种做法，因为该方法高度依赖术者对结扎力度的判断能力，且在我们看来，可能导致手术成功率降低。经过练习，预期手术存活率应达到90%或更高。
端对端吻合的缝合技术是一项需要通过经验积累才能掌握的关键技能。根据先前...

<table><tbody><tr><td>血管夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01 (Size B-1)</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>10-0 带针显微缝合线</td><td>AROSurgical</td><td>TK-107038</td><td></td></tr><tr><td>直剪刀</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>低温烧灼器</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>8441000</td><td></td></tr><tr><td>自持式牵开器</td><td>World Precision Instruments</td><td>14240</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠原位主动脉移植在血管疾病研究中的应用

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

小鼠血管吻合手术通常被认为难度较高，且高度依赖于术者的个人技术水平。这在很大程度上是事实，但有一些重要原则可以降低此类手术的难度并提高可重复性。原位主动脉移植是一种学习这些原则的理想术式，因为它仅涉及两个端对端吻合步骤，但要获得稳定的成功率，仍需要良好的缝合技巧和对血管的精细操作。该手术首先从供体动物获取一段腹主动脉，随后切断受体动物的自体主动脉。将获取的主动脉置于受体主动脉的断端之间，并通过端对端吻合的方式缝合固定。成功完成这一操作需要高度专注、良好的手术器械、稳定的手法，以及充分认识到小鼠血管极易受损并导致血栓形成。掌握这些关键原则是初学者在学习小型啮齿类动物显微外科时最主要的学习内容。在整个实验方案中，我们将反复强调这些要点。该模型可用于多种不同实验系统中的血管疾病研究1-8。在本文所示的应用背景下，它最常用于研究移植后血管病变，这是一种实体器官移植常见的长期并发症，其特征是移植物内膜出现增生。该模型的主要优势在于便于进行定量形态计量分析，且移植血管与宿主自体血管连续相连，后者可作为额外的对照9。本方案所述技术最常用于体重为18–25克的小鼠。我们积累的大部分经验来自C57BL/6J、BALB/cJ和C3H/HeJ品系小鼠。

图1显示了一条主动脉移植物。白色箭头指示缝合线位置。通畅的移植物会显示出可见的搏动。图2展示了一项典型实验，其中受体小鼠的存活情况被追踪观察了56天。一组为野生型（C57BL/6 × FVB）受体小鼠，移植了BALB/c小鼠的主动脉；另一组标记为“KO”，其受体（C57BL/6 × FVB）缺乏血红素加氧酶-1的表达，导致移植物在24小时内发生血栓形成。值得注意的是，如图所示，这导致该组所有受体小鼠死亡。图3显示了正常动物和移植受体小鼠下腔静脉（IVC）及腹主动脉的超声测量结果。请注意，移植物通畅，外观与未移植的主动脉相似。
<img alt="手术示意图，用箭头标示神经，用于解剖学教学研究。" src="/files/ftp_upload/4338/4338fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1....

我们介绍一种技术，即将小鼠腹主动脉的一段原位移植到同种异体或同系受体肾动脉下方。该技术在需要移植大小均一的大动脉的研究中具有优势。

通常认为，涉及小鼠吻合术的血管手术难度较高，且高度依赖于手术操作者的个人技术水平。

该实验的目的是将供体小鼠的腹主动脉移植到同种异体受体小鼠体内。首先获取供体主动脉，然后在受体动物体内构建移植部位。随后解剖并切断受体动物的天然主动脉。最后一步是采用两处端对端血管吻合将供体主动脉植入。最终，该手术可用于研究同种异体品系组合中移植后血管疾病的发病过程。与异位心脏移植等方法相比，该方法的优势在于更容易进行形态计量分析，因为血管尺寸均一。此外，血管周围不存在实质组织，而实质组织可能被细胞浸润物及其他可能干扰分析结果的因素所包绕。采用该技术在阐明移植后血管病变的机制方面尤为有用，而移植后血管病变正是人类临床移植中的一个棘手难题。为尽量减少应激影响并最大化能量储备，术前至少将动物在动物房中饲养 72 小时。手术当天，将金属手术板放置在设定为 35 至 38 摄氏度的加热垫上。麻醉后，去除动物腹部腹侧的毛发。使用实验室胶带将动物以仰卧展开姿势固定在手术台上，然后用消毒剂对动物剃毛区域进行三次消毒，再用无菌剪刀以乙醇擦拭。接着，切开体壁以暴露腹腔内脏。然后用无菌棉签将内脏轻轻推开，置于一块用温盐水浸湿的无菌纱布上，从而暴露腹部的大血管。现在，非常小心地使用钝性分离法将腹主动脉从周围组织中分离出来，包括下腔静脉，然后小心提起并电凝腰动脉。分离主动脉的节段应位于肾血管下方、主动脉分叉为股动脉以上的位置。确定分离区域后，在肾动脉稍下方和分叉处稍上方各放置一根缝线。接下来，使用剪刀剪开主动脉，然后非常小心地夹住血管的一端，滴加肝素化生理盐水，使其在重力作用下流经血管。操作过程中应尽量减少对血管两端的触碰。取出移植物后，立即将其放入盛有冰冻生理盐水的容器中。对受体动物给予麻醉和镇痛处理后，按刚刚所示方法剃除腹部腹侧的毛发。将庆大霉素眼膏涂抹于眼睛表面，防止角膜干燥，随后按前述方法对腹部进行消毒，以确保充分的灭菌效果。接下来，沿正中线逐层切开皮肤和腹壁。然后插入牵开器以保持腹部切口敞开，将螺钉组件朝向动物的尾部，以避免夹具主体妨碍操作。接着将浸有生理盐水的无菌纱布覆盖在肠管上。然后用手指轻轻按住纱布，固定其位置。将无菌棉签插入肠管下方，轻柔地将其牵开，使肠管置于纱布上方。将另一块无菌纱布覆盖在肠管上，并用生理盐水润湿。轻轻去除覆盖在腹主动脉（ATA）和下腔静脉上的脂肪组织后，用镊子仔细分离肾下腹主动脉与下腔静脉。现在清理出足够大的区域，以容纳两个夹钳，并确保有足够数量的血管，以便分割后仍有足够的血管可用于吻合移植段。注意，可利用黑色缝线感知沿血管分布的组织重量。解剖时应注意寻找血管分支，并根据需要使用低温电凝器对分支进行烧灼处理。接下来，在肾动脉下方插入一个血管夹，并在分叉上方插入另一个血管夹。然后切断主动脉。在此情况下，切口更靠近分叉处，因为一支分支血管在两个血管夹中间附近已被电凝，从而形成吻合口的穿孔位置。主动脉断端通常会回缩，留下约五毫米的间隙。检查止血情况。若

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原位主动脉瓣移植在小鼠血管疾病的研究

本视频展示了大鼠原位主动脉移植模型，作为一种研究移植血管病变（TVP）发生的简单模型。...

原位主动脉移植：一种研究慢性血管病变发生的大鼠模型

本视频演示了一种建立小鼠主动脉移植模型的方法，用于研究同种免疫介导的血管排斥反应。将麻醉后的供体小鼠置于仰卧位后，仔细分离肾下腹主动脉（IAA）及其周围结构。结扎分支血管，并在切除前夹闭IAA两端以阻断血流。随后，将供体IAA植入同种异体受体小鼠体内，并通过吻合术恢复血流，以研究同种免疫介导的血管排斥反应。...

一种用于研究同种免疫诱导的血管排斥反应的小鼠主动脉移植模型

我们描述了小鼠移植性动脉硬化（GA）模型的实验方案，该模型涉及将一段小鼠血管移植到同一近交品系的受体体内。通过将额外的遗传改变回交至血管供体，该模型可评估特定基因对GA的影响。...

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