在毛发再生的上皮 - 间充质信号的快速遗传分析
February 28th, 2013
组织特异性分析的毛囊再生模型，利用慢病毒介导增益或损失的功能。
该程序的总体目标是研究对毛囊形成至关重要的信号通路的组织特异性功能。这是通过首先从新生小鼠中分离原代真皮和表皮细胞来实现的。接下来，通过用慢病毒感染原代细胞来改变基因表达。
第三步是将表皮细胞群和真皮细胞群结合到固定在裸鼠伤口床上的腔室中。然后监测移植物的毛发生长。最终，可以通过目视和移植部位的组织学染色来评估基因作对毛囊形成的影响。
与现有方法（如小鼠 nacal 模型）相比，该技术的主要优点是移植可以在三周内完成。这种方法可以回答发育生物学领域的关键问题，例如一个组织中的因素如何影响另一个组织中的信号传导和功能。我们第一次想到这种方法是在我们想解剖天花板分子在清洗因窒息而被安乐死的小鼠后在毛囊形成中的组织特异性功能。
用无菌剪刀剪掉躯干底部的每个肢体和尾巴。然后用一对弯曲的镊子牢牢抓住身体，用手术刀沿着背侧皮肤从头部到尾部切开。不要穿透下面的筋膜。
现在，小心地从鼠标的中线剥开皮肤。用弯曲镊子的长边牢牢抓住暴露的鼠标，然后在鼠标后端的皮肤下插入另一对弯曲的镊子。现在小心地以一个平稳的动作将鼠标的皮肤完全剥落，然后丢弃尸体。
将皮肤放入第一皿洗涤液中，真皮面朝下。将皮肤在溶液中摊开，并用镊子搅拌。然后将皮肤留在洗涤液中，同时解剖下一个皮肤。
将下一个解剖的皮肤放入第一皿洗涤液中后，将先前的皮肤转移到第二皿洗涤液中。将皮肤保存在第二次洗涤溶液中，直到收集所有皮肤。最后洗涤后，将最多 5 张皮转移到装有冷 disbe 溶液的培养皿中。
将皮肤的真皮面朝下压平，让它们在 4 摄氏度下漂浮 8 到 16 小时。将一张皮从冷盘转移到新盘子上。将其真皮面朝下压平。
用镊子抓住表皮，慢慢将其从真皮上剥离。表皮应该一块剥落，它会是白色的和薄的，而真皮应该是棕色的、更厚的和凝胶状的。将两个组织分选到单独的培养皿中以开始细胞分离。
要分离真皮细胞，请将真皮切成非常小的块。用两把手术刀。将切碎的真皮组织与新鲜制备的胶原酶溶液在 37 摄氏度下孵育每 10 分钟一小时，消化完成后轻轻搅拌细胞混合物。
悬浮液应以单细胞为主，溶液应由透明变为浑浊。现在，向细胞悬液中加入 10% 体积的 FBS。将它们穿过 70 微米的样品池，过滤到 50 毫升的试管中。
每管最多可收集 30 mL 流过量。按照书面方案继续进行真皮细胞分离。为了分离角质形成细胞，将每个表皮切成 6 到 8 个小块。
将切片的组织与新鲜解冻的 0.05% tripsin EDTA 在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。按照书面方案继续进行角质形成细胞分离，使用氯胺酮和甲苯噻嗪或首选方法麻醉 7 至 12 周龄的雌性裸鼠。确保涂抹眼睛润滑剂并将鼠标放在加热垫上。
现在用碘消毒背部皮肤，然后用酒精棉签消毒。使用镊子捏住脖子底部的皮肤，并在捏住的皮肤上切一个直径为 1 厘米的孔。将腔室放在伤口床上，并用周围的皮肤覆盖腔室的边缘。
用大约六根缝合线固定腔室 沿其边缘，每只鼠标只连接一个腔室。固定腔室后，检查细胞浆液。如果底部冷凝，请用 1 毫升移液器吸头轻轻重悬。
现在轻轻旋转细胞浆液，并将其吸入连接到 1 毫升注射器的 23 号针头中。用针头刺穿每个腔室，然后将 PBS 悬浮细胞缓慢滴入伤口。当小鼠从麻醉中恢复时，将它们放在干净的高压灭菌笼中，每个笼子有两只小鼠。
确保通过饮用水输送抗生素和泰诺。7 到 9 天后，像以前一样麻醉治疗过的裸鼠。用碘对腔室周围的皮肤进行消毒，并用酒精棉签清洁。
小心地剪掉缝线并将其从腔室中取出。如果新皮肤粘在上面，请轻轻取下腔室。轻轻地将移植物与腔室分开。
使用镊子按住移植物。在移除腔室的过程中，移植物应该看起来暗淡不透明。在开放性伤口上涂上一层薄薄的抗生素膜的非粘附垫，然后用两针将其缝合到位。
在鼠标上缠上绷带以固定垫子并保护伤口。将绷带缝合到位三天后，取下绷带和垫子。在此步骤中不需要麻醉鼠标。
嫁接物应该是干燥的，颜色不透明至棕色。定期检查移植物的毛发生长情况，这应该在移植后 16 天开始显示。在分离的真皮细胞中对平滑基因（一种关键的声音刺猬信号传导成分）进行皮肤特异性敲低。
使用概述的方案将这些细胞应用于头发重建移植物。生长 3 周后，单独使用慢病毒载体的阳性对照移植物显示出强劲的头发生长。然而，平滑的基因敲低导致头发生长严重减少。
阴性对照移植物，省略原代真皮细胞或角质形成细胞，导致伤口部位恢复，没有任何毛发。同样，移植物中一种细胞类型的细胞死亡或细胞丢失也会导致头发不生长。在移植实验之前确定慢病毒载体具有良好的感染效率，并且还设计为与这种平滑的 S-H-R-N-A 一起产生 GFP。
因此，在荧光光学下观察毛囊的真皮对于确认慢病毒表达的持久性是一种有用的控制。三周后，使用 H 和 d 染色来描述对照移植物中毛囊的生长阶段以及当平滑表达被敲低时它们的延迟发育阶段。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 3 天内在 14 小时内完成。该技术可以扩展到探索癌症生物学领域癌症进展过程中肿瘤和基质之间的关系。
看完这个视频，你应该对如何研究毛囊形成中的基因功能有了很好的了解。使用我们的快速重构头发检测试剂盒，这是传统基因敲除的替代方案。
概览
本研究使用一种新型嫁接技术，探讨了关键的信号通路在毛囊形成中的组织特异性功能。通过操纵新生小鼠的初级真皮和表皮细胞中的基因表达，研究旨在评估这些操纵对毛发生长的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 再生医学
背景
- 毛囊再生对于理解皮肤生物学至关重要。
- 信号通路在毛囊发育中起着重要作用。
- 现有的研究这些过程的方法存在局限性。
- 本研究引入了一种新的嫁接技术，以获得更快的结果。
研究目的
- 探索特定信号通路在毛囊形成中的作用。
- 评估基因操纵对毛发生长的影响。
- 提供关于毛囊发育过程中组织相互作用的见解。
使用的方法
- 从新生小鼠中分离初级真皮和表皮细胞。
- 通过慢病毒感染改变基因表达。
- 将细胞群体嫁接到裸鼠上。
- 监测毛发生长并进行嫁接部位的组织学分析。
主要结果
- 成功分离了真皮和表皮细胞。
- Smoothened基因敲低导致毛发生长减少。
- 对照嫁接在三周后显示出强劲的毛发生长。
- 该技术允许快速评估基因在毛囊发育中的功能。
结论
- 研究证明了信号通路在毛囊再生中的重要性。
- 基因操纵可以显著影响毛发生长结果。
- 该方法为未来的发育生物学研究提供了宝贵的工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
This technique enables rapid, tissue-specific functional analysis of signaling pathways in hair follicle morphogenesis, offering a fast alternative to traditional genetic models for target validation in regenerative medicine. By allowing gain- or loss-of-function studies in primary keratinocytes and dermal cells within three weeks, it supports early discovery of epithelial-mesenchymal interactions critical for tissue engineering and de-risking of therapeutic targets. The approach provides predictive confidence in pathway modulation outcomes before committing to longer preclinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-specific gene function in epithelial-mesenchymal signaling during organogenesis.
- Operational Value: Supports rapid assessment of knockdown or overexpression effects on morphogenic outcomes.
- Strategic Value: Facilitates target de-risking by validating functional relevance of signaling components like smoothened in hair follicle formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histological and visual readouts of hair follicle formation for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible grafts with measurable hair growth kinetics enabling comparative condition testing.
- Strategic Value: Establishes a scalable platform for screening modulators of stromal-epithelial crosstalk in tissue regeneration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human hair follicle neogenesis using primary murine cells, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by testing gene effects in a physiologically relevant grafting context.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking molecular perturbation to phenotypic outcomes in tissue reconstitution.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for pathways governing stromal-epithelial interactions in tissue regeneration.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of tissue-specific gene function in morphogenic signaling pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (hair growth, histology) for comparing genetic perturbations across conditions.
- Analytics: Provides measurable endpoints (follicle stage, growth density) to support comparative analysis and hit validation.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical by modeling human-like follicle regeneration in immunocompromised hosts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying epithelial-mesenchymal signaling across regenerative biology and cancer stroma applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating tissue-specific contributions to complex phenotypes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible grafts with defined timelines, reducing variability in functional assays.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of targets before investing in germline models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by confirming mechanistic links between gene modulation and tissue-level outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, lentiviral transduction, and murine grafting techniques.
- Dependent on sterile surgical facilities, cell culture infrastructure, and fluorescence/histology imaging capabilities.
- Necessitates cross-team standardization between cell biology, animal surgery, and histology teams for consistent graft preparation.
- Adaptation to other tissue systems may require optimization of enzymatic dissociation and viral transduction efficiency.
- Practical limitations include variability in primary cell yield and graft take rate, which must be controlled for reproducible outcomes.
