Name: 支气管肺泡灌洗（BAL）的研究，获得适当的采样率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T19:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学习使用低压吸引技术进行支气管肺泡灌洗，以安全获取肺部免疫细胞并维持细胞活力。该方法采用局部麻醉和轻度镇静，适用于日间手术流程。

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感谢Elena Mitsi（研究助理）、Sr. Carole Hancock（研究护士）以及手术室工作人员在拍摄过程中所做出的贡献，同时感谢David Shaw（研究护士）对我们研究性支气管镜检查工作的支持。此外，感谢我们的志愿者Rebecca Dunphy同意对本操作过程进行拍摄。

1. 受试者到达后由呼吸系统研究护士接待
<ol>
	<li>受试者已禁食 &#62;固体食物禁食4小时，清水禁食2小时1.</li>
	<li>该操作作为门诊手术进行，并实施适当的事前和事后检查（遵循标准医院政策）。</li>
	<li>受试者穿着医院病号服。</li>
	<li>将小号套管针插入（理想情况下插入左手）并保留 原位 直至术后恢复期结束1.</li>
	<li>术前需进行生命体征观察（血压、心率、血氧饱和度 [sats]）。</li>
	<li>受试者被转移至支气管镜检查室。</li>
</ol>
2. 由具有支气管镜操作经验的呼吸系统研究临床医生在操作室内对受试者进行术前准备
<ol>
	<li>连接监测设备，包括三导联心电图、脉搏血氧仪1,10和血压计。无需麻醉支持，但必须获得书面知情同意。</li>
	<li>可通过鼻导管给予氧气，流量最高达4 L/min，以维持血氧饱和度＞90%1。</li>
	<li>操作者检查支气管镜，包括通过抽吸无菌生理盐水确认吸引功能有效。</li>
	<li>使用利多卡因进行局部麻醉：鼻腔内使用Instillagel1，口腔黏膜使用Xylocaine。</li>
	<li>若受试者有需要并提出要求，可静脉注射咪达唑仑进行镇静1。应立即备有合适的拮抗剂（氟马西尼）。</li>
	<li>复苏设备应随时可用1,10。</li>
</ol>
3. 插入并定位支气管镜
<ol>
	<li>通常经鼻插管。若因鼻息肉、鼻甲炎症或任何不适导致无法经鼻插管，则改为经口插管（使用口垫以防止支气管镜或受试者牙齿受损）。</li>
	<li>喉部局部麻醉使用4%利多卡因，通常总量为4–6 ml。麻醉剂注入时常引起咳嗽。</li>
	<li>通过声门后，在隆突、右下叶（RLL）与右中叶（RML）分叉处以及RML入口处，分别以每次2 ml的2%利多卡因进行进一步黏膜麻醉。</li>
	<li>将支气管镜置于RML，理想位置为内侧段，应足够远端以确保固定稳妥，但又不能过于远端，以免在施加负压时导致气道塌陷（通过“眨眼试验”测试，即使用吸引按钮进行轻柔吸引）。</li>
	<li>良好的定位表现为：在“眨眼试验”中，支气管镜可由操作者完全稳定地保持在原位，且气道在轻柔吸引下不会立即完全闭合。</li>
</ol>
4. 进行支气管肺泡灌洗
<ol>
	<li>由支气管镜助手预先准备四个分别装有温热生理盐水的注射器——依次为 60 ml、50 ml、50 ml 和 40 ml。当受试者和支气管镜操作者准备就绪后，助手通过支气管镜通道注入第一支注射器中的生理盐水，同时支气管镜操作者保持支气管镜位于右中叶（RML）位置。</li>
	<li>随后，助手通过同一通道使用 50 ml 注射器进行轻柔的手动抽吸。</li>
	<li>此操作再重复三次，本研究技术中使用的最大灌洗总量为 200 ml。</li>
	<li>回收的支气管肺泡灌洗液（BAL）应轻柔地排入已预先置于融冰上的标记容器中。玻璃容器可预先经硅化处理，以抑制细胞黏附，提高细胞回收率。</li>
	<li>支气管肺泡灌洗液在光线下呈浑浊状，并因表面活性物质作用而形成表面泡沫。</li>
	<li>随后缓慢完全撤出支气管镜。</li>
	<li>支气管肺泡灌洗液须立即置于冰上运输，并尽快进行后续处理。</li>
</ol>
5. 受试者恢复
<ol>
	<li>受试者由病房呼吸研究护士照护恢复2-4小时。</li>
	<li>在此期间，受试者可休息，并仅在操作后>60分钟（当其吞咽功能评估为安全时）方可进食和饮水，以降低误吸风险1。</li>
	<li>术后观察指标需持续监测并记录。出院前需进行临床检查。</li>
	<li>出院前应向受试者说明常见不良反应（发热、轻度右乳下胸部不适、咽痛），并提供联系方式，以便出现明显不良反应时联系1。</li>
	<li>操作后1-5天内通过临床联系对受试者进行随访，方式可为电话或面对面。</li>
</ol>
6. 在实验室中分离细胞——尽可能在融化的冰上操作
<ol>
	<li>记录BAL液体积，并通过双层无菌纱布过滤，去除黏液栓，收集至预冷的无菌50 ml离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以500 × g离心5–10分钟使细胞沉淀，再用50 ml冷生理盐水通过涡旋振荡洗涤一次，随后重复离心一次。</li>
	<li>将细胞重悬于培养基（RPMI-1640 + 10%胎牛血清 + 2 mM L-谷氨酰胺 + 青霉素[40 IU/ml]、链霉素[75 IU/ml]和两性霉素B[0.5 IU/ml]）中，加入等体积台盼蓝，使用血细胞计数板进行细胞差异计数。</li>
	<li>将细胞悬液调整至所需浓度（我们使用1 × 106 细胞/ml），通过移液加入适当的组织培养板中，于37 °C孵育3小时，以使巨噬细胞贴壁。对于24孔培养板，每孔加入1 ml该细胞悬液为宜。</li>
	<li>进行淋巴细胞实验时，孵育3小时后，轻轻吹打培养基上下混合3次，然后收集。此培养基中含有淋巴细胞和非贴壁巨噬细胞，可用于评估淋巴细胞功能；也可用于后续纯化步骤，e.g. 使用CD14磁珠去除巨噬细胞。</li>
	<li>进行巨噬细胞实验时，孵育3小时后，小心移除培养基，尽量减少吹打操作，并更换为不含抗生素的新鲜温热培养基（RPMI 1640 + 10%胎牛血清 + 2 mM L-谷氨酰胺）。巨噬细胞将贴附于组织培养板表面（见图1）。</li>
</ol>

<ol><li>BTS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+British+Thoracic+Society+Bronchoscopy+Guideline+Committee+-+A+sub-Committee+of+the+Standards+of+Care+Committee+of+the+British+Thoracic+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The British Thoracic Society Bronchoscopy Guideline Committee - A sub-Committee of the Standards of Care Committee of the British Thoracic Society.</a> Thorax. 56 (Suppl I), 1-21 (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+guidelines+for+bronchoalveolar+lavage+%28BAL%29+report+of+the+European+Society+for+Pneumology+Task+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL) report of the European Society for Pneumology Task Group.</a> Eur. Respir. , 561-585 (1989).</li>
<li>Gordon, S. B., Irving, G. R., Lawson, R. A., Lee, M. E., Read, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+and+killing+of+Streptococcus+pneumoniae+by+human+alveolar+macrophages+are+influenced+by+opsonins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking and killing of Streptococcus pneumoniae by human alveolar macrophages are influenced by opsonins.</a> Infect. Immun. 68, 2286-2293 (2000).</li>
<li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+immunoglobulin+responses+to+Streptococcus+pneumoniae+are+altered+but+not+reduced+in+human+immunodeficiency+virus-infected+Malawian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Pulmonary immunoglobulin responses to Streptococcus pneumoniae are altered but not reduced in human immunodeficiency virus-infected Malawian adults.</a> J. Infect. Dis. 188, 666-670 (2003).</li>
<li>Fullerton, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domestic+smoke+exposure+is+associated+with+alveolar+macrophage+particulate+load%5BTitle%5D)+AND+%22Trop.+Med.+Int.+Health%22%5BJournal%5D)">Domestic smoke exposure is associated with alveolar macrophage particulate load.</a> Trop. Med. Int. Health. 14, 349-354 (2009).</li>
<li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+CD4%2B+T+cell+responses+to+respiratory+antigens+are+impaired+in+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar CD4+ T cell responses to respiratory antigens are impaired in HIV-infected adults.</a> Thorax. 66, 375-382 (2011).</li>
<li>Eagan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+fluid+immunoglobulin+from+HIV-infected+subjects+has+impaired+opsonic+function+against+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Lung fluid immunoglobulin from HIV-infected subjects has impaired opsonic function against pneumococci.</a> Clin. Infect. Dis. 44, 1632-1638 (2007).</li>
<li>Rose, A. S., Knox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage as a research tool.</a> Sem. Respir. Crit. Care Med. 28, 561-573 (2007).</li>
<li>Wright, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PLoS Pathog. , (2012).</li>
<li>Bolliger, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERS%2FATS+statement+on+interventional+pulmonology+European+Respiratory+Society%2FAmerican+Thoracic+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">ERS/ATS statement on interventional pulmonology European Respiratory Society/American Thoracic Society.</a> Eur. Respir. J. 19, 356-373 (2002).</li>
<li>Ettensohn, D. B., Jankowski, M. J., Duncan, P. G., Lalor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+I.+Technical+aspects+and+intersubject+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. I. Technical aspects and intersubject variability.</a> Chest. 94, 275-280 (1988).</li>
<li>Ettensohn, D. B., Jankowski, M. J., Redondo, A. A., Duncan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+2.+Safety+and+results+of+repeated+BAL%2C+and+use+in+the+assessment+of+intrasubject+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. 2. Safety and results of repeated BAL, and use in the assessment of intrasubject variability.</a> Chest. 94, 281-285 (1988).</li>
<li>De Brauwer, E. I., Jacobs, J. A., Nieman, F., Bruggeman, C. A., Drent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+fluid+differential+cell+count.+How+many+cells+should+be+counted%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Quant.+Cytol.+Histol%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage fluid differential cell count. How many cells should be counted.</a> Anal. Quant. Cytol. Histol. 24, 337-341 (2002).</li>
<li>Mtunthama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malawians+permit+research+bronchoscopy+due+to+perceived+need+for+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Ethics%22%5BJournal%5D)">Malawians permit research bronchoscopy due to perceived need for healthcare.</a> J. Med. Ethics. 34, 303-307 (2008).</li>
<li>Pereira, W., Kovnat, D. M., Snider, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+cooperative+study+of+complications+following+flexible+fiberoptic+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">A prospective cooperative study of complications following flexible fiberoptic bronchoscopy.</a> Chest. 73, 813-816 (1978).</li>
<li>Huang, Y. C., Bassett, M. A., Levin, D., Montilla, T., Ghio, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+phase+reaction+in+healthy+volunteers+after+bronchoscopy+with+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Acute phase reaction in healthy volunteers after bronchoscopy with lavage.</a> Chest. 129, 1565-1569 (2006).</li>
<li>Gritzfeld, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Human+Pneumococcal+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental Human Pneumococcal Carriage.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
</ol>

Andrea M. Collins 由比尔和梅琳达·盖茨基金会资助，无潜在利益冲突。她曾接受默克（MSD）和葛兰素史克（GSK）的资助以参加学术会议，并获得讲课费用。独立完成过 50 例研究用支气管肺泡灌洗（BAL）。
Jamie Rylance 由惠康信托基金资助，无利益冲突。他未获得其他资金。独立完成 70 例研究用支气管肺泡灌洗。
Daniel G. Wootton 由英国国家健康研究所（NIHR）博士奖学金资助，无任何利益冲突。已独立完成 40 例研究用支气管肺泡灌洗。
Angela D. Wright 不存在潜在的利益冲突。已协助完成 100 多例研究用支气管肺泡灌洗（BAL）。
Adam K. A. Wright 不存在潜在的利益冲突。他已处理过50多个BAL样本。
Duncan G. Fullerton 不存在潜在的利益冲突。已独立完成100例研究用支气管肺泡灌洗。
Stephen B. Gordon 不存在潜在的利益冲突。他曾接受默克（MSD）和诺华公司的资助以参加学术会议。已独立完成400例研究用支气管肺泡灌洗。

为了获得良好的结果，以下几点很有帮助：
<ol>
	<li>舌根及后部口咽的良好麻醉。这一点非常重要，因为可提高受试者的操作耐受性并改善整体舒适度。</li>
	<li>可使用儿童型（外径 3.4–3.6 mm）或成人型支气管镜（外径 4.8–5.9 mm）。</li>
	<li>如果经鼻插管过程中出现任何不适，则优先选择经口插管。通常情况下，经鼻插管应为一种简便易行的技术，否则应予放弃。</li>
	<li>在向口咽部初次注入利多卡因后，受试者可能更倾向于在麻醉起效前暂时撤出支气管镜，尤其是当支气管镜经口腔插入时。</li>
	<li>确保至少 10 x 10&#160;ml 注射器仅预装 2-4 ml 利多卡因。注射器内应保留空气，以便更有效地将麻醉剂直接输送至声带和支气管黏膜。</li>
	<li>由于操作过程中咳嗽会显著降低支气管肺泡灌洗液的回收量，使用加温的生理盐水并确保充分的黏膜麻醉对于减少咳嗽至关重要。</li>
	<li>50&#160;注射器必须预先装入温热的生理盐水。由于死腔损耗以及部分液体流入终末气道，首次灌注的50 ml生理盐水通常仅回收10–20 ml。后续分次灌注的液体回收比例较高。</li>
	<li>操作者应在插管前始终检查支气管镜，包括通过抽吸无菌生理盐水确认吸力是否有效。吸力丧失通常可能由于管道扭曲所致。&#160;或支气管镜与吸引装置连接处出现泄漏。</li>
	<li>进行手动吸引时，理想情况下应避免气道塌陷。若吸引反复导致气道塌陷，则会形成活瓣样效应，降低支气管肺泡灌洗液回收量，并增加局部炎症和出血的风险；继而使气道更加敏感，更易引发咳嗽。因此，选择最合适的右中叶亚段支气管分支，并采用低负压吸引，均至关重要。</li>
	<li>当持续抽吸空气时，需重新检查注射器与支气管镜的连接情况，以及支气管镜在远端气道中的位置。若此问题反复出现，应在操作后确认支气管镜本身是否存在破损或孔洞。</li>
	<li>吸烟者的BAL样本常因细胞内颗粒物的存在而颜色较深。吸烟者对支气管镜检查的耐受性可能较差，并伴有咳嗽加重。</li>
	<li>理想的支气管肺泡灌洗液回收量为 &#62;100 ml。收获量为 &#62;150 ml 为理想回收量。我们尚未遇到任何回收量不足的情况 &#62;170 ml。细胞得率与支气管肺泡灌洗液回收体积之间不存在线性关系。</li>
	<li>得率 &#60;100 ml时，更容易出现咳嗽、胸痛和发热等副作用。我们建议，对于回收量较低的受试者，应 &#60;在左侧卧位时回收100 ml，可能有助于残留肺液的引流。</li>
	<li>应在1至5天内与受试者进行临床随访，以确保无任何不良反应。</li>
	<li>使用咪达唑仑进行镇静 &#60;英国50%的受试者及 &#60;在马拉维，这一比例为5%。咪达唑仑似乎并不能直接提高耐受性；一些操作人员认为，镇静有时可能不利于与受试者保持清晰（且令人安心）的交流。</li>
	<li>根据我们的经验，该技术存在显著的学习曲线。例如，医生与护士之间的配合需要时间磨合，在学习过程的初期，回收率通常较低。</li>
	<li>对于HIV阳性受试者，我们在支气管镜检查前预防性使用抗生素。</li>
</ol>

背景
纤维支气管镜检查最初为临床实践而开发，现广泛应用于诊断和治疗1,2。支气管肺泡灌洗（BAL）可从黏膜表面清除非黏附性细胞和肺内衬液；活检则用于获取黏膜及黏膜下组织样本。在科研环境中，BAL可用于采集肺部的固有免疫（肺泡巨噬细胞3-5）、细胞免疫（B细胞和T细胞6）以及体液免疫（免疫球蛋白7）反应样本。
BAL 在国际上被广泛接受用于科研目的8 自1999年以来，该技术已在 &#62;我们团队已在英国和中国台湾的1,000名受试者中应用了该技术。我们已在针对肺炎链球菌抗原的固有免疫、细胞免疫和体液免疫应答研究中使用该技术，包括实验性人类肺炎链球菌定植研究。9,17生物质烟雾5，HIV 与疫苗接种，以及肺炎恢复的辅助治疗研究。我们的技术采用轻柔的手持式负压吸引法回收灌注液体；该方法旨在最大限度地提高支气管肺泡灌洗液的回收量，同时最小化对纤毛上皮细胞的剪切力，以保持灌洗液中细胞的结构和功能完整性。
在科研背景下，支气管肺泡灌洗（BAL）所采用的技术与呼吸科和重症监护医师所使用的不同（后者常称为支气管冲洗、冲洗液、灌洗或BAL），其目的是获得诊断或治疗效益。科研用BAL技术旨在获取细胞并保持其活性，以利于细胞在ex vivo培养中生长。因此，该科研技术使用较大体积的灌洗液（通常约为200 ml），并通过手动吸引以减少细胞损伤。受试者接受局部麻醉，并可选择清醒镇静（咪达唑仑），通常耐受性良好，不良反应极少。口头和书面的受试者告知有助于提高耐受性，且必须获得书面知情同意1。
目标
总体目标是确保该操作安全且有效。受试者不应出现任何生理紊乱，操作者应能持续从受试者中回收超过100 ml的支气管肺泡灌洗液。操作后，受试者应仅出现轻微的不良反应。
安全
受试者的安全至关重要。需根据明确的纳入和排除标准仔细筛选受试者。本方案包含对潜在风险的描述以及为减轻这些风险所采取的措施。
研究性支气管镜检查的禁忌证可分为绝对禁忌和相对禁忌，并已作为排除和纳入标准包含在我们的研究方案中。所有受试者均经过严格筛选，以确保其完全健康。
绝对禁忌症包括颈椎不稳定、无反应性低氧血症、不稳定型心绞痛、出血体质以及恶性心脏心律失常。
相对禁忌证，包括与并发症发生率增加相关的某些情况，有：
一般情况：依从性差的受试者1任何重大的全身性医学问题 例如 癫痫、既往支气管镜检查耐受不良、已知对利多卡因或咪达唑仑有不良反应、妊娠、营养不良。
呼吸系统：低氧血症［空气条件下血氧饱和度（sats）<94%］、高碳酸血症、不稳定性哮喘1、显著受损的呼吸功能1（FEV1<1 L）、肺动脉高压。
心血管：6周内发生心肌梗死，尿毒症1，上叶 下腔静脉 阻塞
其他：免疫抑制（我组常规在HIV阳性受试者中实施此操作）。
参见表1——与用于研究的支气管肺泡灌洗（BAL）相关的风险。

<table><tbody><tr><td>&lt;p&gt;纤维支气管镜、光源及吸引源&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;手术衣，无菌手套&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;血压计&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;用于患者的持续监测&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;脉搏血氧仪&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;用于患者的持续监测&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>&lt;p&gt;3导联心电图监护仪&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;用于患者的持续监测&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>&lt;p&gt;鼻导管吸氧，2-4 L/min&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;利多卡因10%喷雾（Xylocaine）&lt;/p&gt; </td><td>阿斯利康</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>&lt;p&gt;用于局部麻醉&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;盐酸利多卡因 2%&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>&lt;p&gt;用于局部麻醉&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;利多卡因凝胶（Instillagel）&lt;/p&gt; </td><td>Farco-Pharma，德国</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>&lt;p&gt;生理盐水，无菌，200 ml&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>&lt;p&gt;30℃预热 &amp;#176;C&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>&lt;p&gt;10 ml 锥形末端注射器（x10）&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;用于利多卡因给药&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>&lt;p&gt;18 G 静脉导管&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;咪达唑仑给药方法&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;咪达唑仑&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;用于镇静&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氟马西尼&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;苯二氮䓬类镇静作用的逆转（仅限紧急情况下使用）&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>&lt;p&gt;60 ml 锥形末端注射器（x4）&lt;/p&gt;</td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>&lt;p&gt;用于生理盐水注射和支气管肺泡灌洗液回收。&lt;/p&gt; &lt;p&gt;可能需要连接器以连接到支气管镜的注射端口。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;无菌纱布拭子&lt;/p&gt; </td><td>英国韦尔奈德</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;用于 BAL 液体的无菌容器&lt;/p&gt; </td><td>参见正文及评论</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>&lt;p&gt;硅化玻璃瓶可减少巨噬细胞黏附。 alternatively，可使用 50 ml 离心管（总容量 200 ml）&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Sigmacote&lt;/p&gt; </td><td>Sigma，英国</td><td>&lt;p&gt;SL2&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;仅当使用硅化玻璃瓶时。注意：有害且易燃。若使用，需遵循制造商提供的详细预防措施&amp;rsquo;s MSDS&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;离心&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td></td><td>&lt;p&gt;至少 4 个 50 ml 离心管容量。冷藏至 4 &amp;#176;C 优先。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Shandon Cytospin 离心机&lt;/p&gt; </td><td>赛默飞世尔科技，英国</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;仅用于分类计数&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基&lt;/p&gt; </td><td>Sigma，英国</td><td>&lt;p&gt;R8758&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;胎牛血清&lt;/p&gt; </td><td>Sigma，英国</td><td>&lt;p&gt;F6178&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;青霉素-链霉素&lt;/p&gt; </td><td>Sigma，英国</td><td>&lt;p&gt;P4333&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;两性霉素 B&lt;/p&gt; </td><td>Sigma，英国</td><td>&lt;p&gt;A2942&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;组织培养板&lt;/p&gt; </td><td>Greiner Bio-One, 英国</td><td>&lt;p&gt;662160&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;其他供应商提供的替代产品&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;玻璃显微镜载玻片&lt;/p&gt; </td><td>未指定</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;仅用于分类计数&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Shandon 细胞漏斗&lt;/p&gt; </td><td>赛默飞世尔科技，英国</td><td>&lt;p&gt;A78710003&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;仅用于分类计数&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Shandon 细胞夹&lt;/p&gt; </td><td>赛默飞世尔科技，英国</td><td>&lt;p&gt;59910052&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;仅用于分类计数&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Hemacolor 染色试剂盒（固定剂、红色试剂和蓝色试剂）&lt;/p&gt; </td><td>默克，德国</td><td>&lt;p&gt;111661&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;按照制造商说明使用&amp;rsquo;s 指令&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

支气管肺泡灌洗（bal）用于科研；获取足够的样本量

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

我们介绍一种用于纤维支气管镜检查并结合支气管肺泡灌洗（BAL）的研究技术，该技术采用手动手持吸引方式，以清除黏膜表面的非黏附性细胞和肺内衬液。在科研环境中，BAL可用于采集肺部的固有免疫（肺泡巨噬细胞）、细胞免疫（B细胞和T细胞）以及体液免疫（免疫球蛋白）反应样本。
BAL 被国际上广泛接受用于科研目的，自1999年以来，本课题组已在英国和马拉维对1,000多名受试者实施了该技术。 &#62; 我们团队已在英国和中国台湾的1,000名受试者中实施了该技术。
我们的技术采用轻柔的手持式负压吸引灌注液体；旨在最大限度地回收支气管肺泡灌洗液量，同时对纤毛上皮施加最小的剪切力，以保持灌洗液中细胞的结构和功能完整性，并维持细胞活性，从而促进细胞在体外培养中的生长 离体 培养。因此，该研究技术采用较大体积的灌注液（通常约为200 ml），并使用手动抽吸以减少细胞损伤。
患者接受局部麻醉，并可选择清醒镇静（咪达唑仑），该操作耐受性良好，不良反应极少。口头和书面的受试者信息说明可提高耐受性，且必须获得书面知情同意。受试者的安全至关重要。受试者需根据明确的纳入和排除标准进行严格筛选。
本方案包括对潜在风险的描述及相应的缓解措施、禁忌症列表、术前和术后检查，以及详细的支气管镜和实验室操作技术。

良好的临床结果表现为支气管肺泡灌洗液（BAL）体积超过100 ml，且受试者最多仅有轻微不适（见表1）。这要求受试者保持放松并积极配合。临床操作人员必须自信、充分准备（材料），并对志愿者保持理解态度。
已有关于细胞收获量（包括分类计数）在个体间和个体内变异性的描述。健康受试者的分类细胞计数通常以巨噬细胞为主（>90%），中性粒细胞数量较少（<2%）以及淋巴细胞占5-10%。支气管肺泡灌洗（BAL）细胞经离心沉降到显微镜载片后，可使用细胞核差异染色法染色以获取此类信息（图1）。在图1中，BAL细胞已按照制造商说明书使用Hemacolor染色法进行固定和染色。为获得可靠的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数结果，应至少计数300个细胞；对于较罕见的细胞类型，则应计数500个细胞。
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>危险</td>
			<td>风险</td>
			<td>本方案中由以下人员简化：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">支气管镜检查与支气管肺泡灌洗的影响1,14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>轻微不适</td>
			<td>&lt;25%14,#</td>
			<td>适当的镇痛与镇静。 对主题采取自信且富有关怀的态度。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鼻出血</td>
			<td>&lt;1%#</td>
			<td>仅对经鼻插管施加轻柔压力。 若受试者不适或开口受限，则改为经口插管。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支气管内出血（咯血）</td>
			<td>&lt;0.1%*15</td>
			<td>未采集活检样本。 支气管镜检查过程中的精细控制——避免接触呼吸道黏膜。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>恶心、呕吐和吸入性肺炎</td>
			<td>&lt;0.02%14,#</td>
			<td>禁食固体食物 &gt;术前4小时1. 充分的局部麻醉。 操作过程中保持半卧位。 仔细的术后观察。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>发热</td>
			<td>0.0114 - 1%#,16</td>
			<td>与炎症相关，可通过最大限度地收集支气管肺泡灌洗液（BAL）来减少。 仅单叶支气管肺泡灌洗。#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鼻咽痛及声音嘶哑</td>
			<td>&lt;25%14,#</td>
			<td>鼻腔、咽喉和喉部充分的局部麻醉（以尽量减少咳嗽）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>感染</td>
			<td>&lt;HIV阴性者中为0.1% HIV 阳性者中占 1%14,#</td>
			<td>标准支气管镜清洗程序1. 仅单叶支气管肺泡灌洗。 # 支气管镜检查后1小时内进行临床检查，以及1至5天内进行临床随访，以早期识别感染。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胸痛/咳嗽</td>
			<td>&lt;0.2%14,#</td>
			<td>仅进行单叶支气管肺泡灌洗。最大程度收集支气管肺泡灌洗液。#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">药物作用：利多卡因、咪达唑仑</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心律失常</td>
			<td>极为罕见*</td>
			<td rowspan="3">最大剂量为5 mg/kg14 利多卡因使用。 注入预热的生理盐水。 # 脉搏血氧饱和度检测（sats &gt;90%（补充氧气），整个操作过程中进行心脏监护。 苯二氮䓬类拮抗剂（氟马西尼）应立即备好。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>定向障碍 / 激越</td>
			<td>&lt;0.1%†#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心肺抑制</td>
			<td>极为罕见*</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
* 在我们团队进行的1500多项科研操作中尚未有相关经验。
† 特异质反应，而非剂量依赖性反应。
# 我们团队在1,500多项科研实验中的经验。
表1. 用于研究的支气管肺泡灌洗（BAL）相关风险。包括潜在危害或风险，以及通过使用所述技术如何降低这些风险。还包括支气管镜检查/BAL本身的影响，以及所用任何药物的影响。
<img alt="细胞形态的显微图像，显示有丝分裂和胞质分裂的不同阶段。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/4345/4345fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 图1. 显示支气管肺泡灌洗液巨噬细胞及偶见中性粒细胞的显微镜切片。支气管肺泡灌洗液细胞经甲醇固定，并使用Hemacolor红色（伊红Y）和蓝色（亚甲蓝B）染色。

我们介绍一种采用低压吸引的纤维支气管镜检查与支气管肺泡灌洗的研究技术。该技术用于采集肺部支气管肺泡表面的免疫细胞。操作中使用局部麻醉和轻度清醒镇静（咪达唑仑）。受试者对该操作耐受良好，且仅出现轻微不良反应。

支气管肺泡灌洗（BAL）用于科研；获取足够的样本量

我们介绍一种用于纤维支气管镜检查联合支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）的研究技术，该技术采用手动手持吸引方式，以清除黏膜表面的非黏附性细胞和肺衬液。在科研环境中，BAL可用于获取肺部固有免疫（肺泡巨噬细胞）、细胞免疫（B细胞和T细胞）以及体液免疫（免疫球蛋白）反应的样本。该技术已被国际认可用于科研目的；自1999年以来，本研究团队已在英国和马拉维对超过1,000名受试者实施了该操作。我们的技术通过轻柔的手动吸引回收灌注液体，旨在最大化回收BAL液体积，同时对纤毛上皮施加最小剪切力，从而保护BAL液中细胞的结构与功能，并维持细胞活性，以利于体外培养时细胞的生长。因此，该研究方法采用较大体积的灌注液（通常约为200 ml），并使用手动吸引以减少细胞损伤。受试者接受局部麻醉，可选择性给予清醒镇静（如咪达唑仑），且普遍耐受良好，不良反应极少。提供口头和书面的受试者信息有助于提高耐受性，书面知情同意为必需环节。受试者安全至关重要。需依据明确的纳入和排除标准谨慎筛选受试者。本方案包含对潜在风险的描述及相应的风险缓解措施、禁忌症列表、术前与术后检查流程，以及详细的支气管镜操作和实验室技术步骤。

本操作的总体目标是以安全有效的方式进行支气管肺泡灌洗。首先通过确保所入选受试者的安全、配合度和舒适性来实现这一目标，这需要采用明确的纳入和排除标准。还会进行操作前的检查和观察。然后，进入支气管镜室并完成所有设备检查后，为受试者给予局部麻醉，并提供清醒镇静。接下来，在声带插管后，将支气管镜推进至右中叶支气管（RML）内的合适位置。这可确保获得充足的支气管肺泡灌洗液量。最后，采用轻柔的手动负压吸引收集灌洗液，并立即置于冰上无延迟转运，以便尽快进行实验室处理。最终，该技术可收获细胞并保持其活性，从而有利于细胞在体外培养中的生长。与呼吸科和重症监护医师目前常用的方法（常称为支气管冲洗、支气管肺泡灌洗或肠道灌洗，旨在获得诊断或治疗益处）相比，本技术的主要优势在于采用轻柔的手持式负压吸引灌注液体。该方法旨在最大限度地回收肠道灌洗液，并对纤毛上皮细胞施加最小的剪切力，从而保护肠道灌洗液中细胞的结构与功能。支气管肺泡灌洗术作为门诊操作实施，须按照医院标准政策进行相应的术前与术后检查，包括确保书面知情同意书已正确签署并注明日期。受试者到达后，由呼吸研究护士接待，并进行所有必要的术前检查，包括确认受试者已禁食至少4小时（固体食物）和2小时（液体）。若受试者符合所有入选标准，则更换为医院病号服，并进行术前观察，包括测量血压、心率和血氧饱和度。理想情况下，应在左手置入一个小号留置针。此状态将持续至术后恢复期结束。随后，受试者将被转移至支气管镜检查室，由经验丰富的呼吸系统研究用支气管镜医师进行操作。然后将监测设备连接至受试者。这包括三导联心电图、A型fig o压力计和脉搏血氧仪。不需要麻醉支持。在插入支气管镜之前，应为所有志愿者佩戴鼻导管，若血氧饱和度降至96%以下，则以最高每分钟四升的速度给予氧气。此时，操作者需对支气管镜进行术前检查。包括通过抽吸无菌生理盐水以确认吸引功能有效。一旦操作者确认支气管镜处于最佳工作状态，即分别通过滴注Instillagel和利多卡因（Xylocaine）对受试者的鼻腔通道和口腔黏膜实施局部麻醉。如果镇静适当且受试者已提出要求，则通过静脉注射给予适当剂量的咪达唑仑。对于所有涉及麻醉的操作，均应立即备有适当的逆转剂。此外，还需确保急救设备也已准备就绪。受试者经鼻插管。若无法经鼻插管，则可在喉部使用适当的口部撑开器的前提下经口插管。当导管通过声带后，使用4至6毫升的4%利多卡因进行局部镇痛。此外，在右下叶和右中叶分嵴处以及右中叶（RML）入口处，使用2毫升等份的2%利多卡因进行黏膜镇痛。最后，将支气管镜送入右中叶，并理想地将其置于内侧段的远端稳定位置。使用吸引按钮执行 wink 试验，以确保支气管镜未置于过于远端的位置，以免引起气道塌陷。准备四个60毫升注射器，分别预先装入60毫升、两个50毫升以及一个40毫升的温热无菌生理盐水。当受试者和支气管镜医师就位后，由支气管镜助手注入第一管生理盐水。在支气管镜医师保持支气管镜位于右中叶（RML）的同时，助手通过同一通道和注射器进行轻柔的手动抽吸。随后，使用每个注射器依次重复该步骤三次，在此特定技术中最大使用体积为 200 毫升，收集的支气管肺泡灌洗液（BAL 液）需轻柔地排入已预先硅化并置于冰融上的塑料容器中。预先硅化可抑制细胞黏附，从而最大化回收细胞。支气管肺泡灌洗液在光线下呈浑浊状，表面可见由蛋白质和表面活性物质形成的泡沫。最后，缓慢且完全地撤出支气管镜。受试者转入监护恢复区，支气管肺泡灌洗液须立即置于冰上并尽快转运。若需立即处理样本，应在呼吸研究护士的监护下，让受试者恢复最多四小时。在此期间，让受试者休息，但在操作后至少60分钟内不得进食或饮水，以降低误吸风险，直至其吞咽功能被评估为安全。术后观察需持续监测并记录。在出院前进行一次临床检查。同时向受试者说明常见不良反应，并提供一个联系电话，以便在出现严重不良反应时联系。术后一至五天内，由医生或护士对受试者进行随访预约。可以通过电话或当面进行。进入研究实验室后，所有操作均须在湿冰上进行。在可行的情况下。首先，记录支气管肺泡灌洗液的体积。然后将液体通过两层无菌纱布擦拭物过滤，以去除黏液栓，并将滤液收集至无菌的50毫升离心管中。在4°C下以500 G离心5至10分钟，使细胞形成沉淀。去除上清液，用 50 毫升冷生理盐水洗涤。再次进行离心。随后，将细胞重悬于适量培养基中。通常，2 毫升的细胞悬液可获得适合计数的细胞密度。随后按照标准操作流程，使用血球计数板和台盼蓝进行细胞计数，并通过加入适量培养基将细胞悬液的密度调整至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。然后将 1 毫升细胞悬液转移至 24 孔板的每一孔中。将细胞在37摄氏度下于培养板中孵育三小时，以使巨噬细胞贴壁，从而进行淋巴细胞相关工作。孵育三小时后，轻轻吹打培养基三次并收集。该培养基含有淋巴ocytes和非贴壁巨噬细胞，可用于评估淋巴细胞功能。该步骤也可用于巨噬细胞研究的后续纯化过程。孵育 3 小时后，小心吸去培养基，并更换为不含抗生素的新鲜温热培养基，此时巨噬细胞已贴附于组织培养板上。支气管肺泡灌洗（BAL）细胞已通过 thermo shandon 细胞离心机沉降到显微镜载玻片上，并使用差异性核染色法染色以显示不同细胞类型。大多数细胞为巨噬细胞，例如标记为 M 的细胞，但也可见少量标记为 N 的中性粒细胞和标记为 L 的淋巴细胞。观看本视频后，您应充分了解如何安全有效地采用此技术进行支气管镜灌洗以用于研究目的，尤其包括对舌根和后咽部进行充分麻醉、在操作前检查支气管镜的吸力是否有效以及是否存在漏气现象，并选择最合适的右中叶亚段支气管分支。操作者应能持续从副作用极小的受试者中收集超过一百毫升的灌洗液。

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