在斑马鱼发育的细胞追踪使用Photoconvertible蛋白
2012年9月28日
在这里，我们提出了一种在活斑马鱼胚胎中光转化荧光蛋白 （PCFPs） 进行光激活开关的方法，并在发育过程中的特定时间点进一步跟踪光转化蛋白。该方法允许监测活体脊椎动物生物体中不同发育过程背后的细胞生物事件。
该程序的总体目标是追踪活斑马鱼胚胎中的光开关细胞。这是通过首先包埋胚胎，在低熔点温度下表达组织特异性光、可转换荧光蛋白来实现的。接下来，对感兴趣区域内的蛋白质进行完全光转化。
然后小心地将胚胎从 aros 中取出，并在 28.5 摄氏度的鸡蛋水中保持直到后期。最后，光转化的胚胎再次嵌入低熔融温度的 aros 中。最终，可以获得结果表明，由于通过共聚焦显微镜稳定存在光转化蛋白，可以在后期精确检测到光转化细胞。
因此，我们认为我们今天将介绍的方法在细胞和发育生物学的背景下将非常有用。因此，我们认为在细胞迁移、组织动力学和其他细胞行为的背景下使用这种方法将非常有用。演示该程序的是我实验室的博士后 Veronica Lombardo，她杂交转基因斑马鱼后，表达了一种光转换荧光蛋白。
选择最亮的纯合子胚胎，当它们达到所需阶段时，在 28.5 摄氏度下生长。用镊子将它们涂在装有鸡蛋水的玻璃容器中，以麻醉胚胎。使用玻璃移液器或切割的移液器吸头将它们一次转移到 trica 中。
将麻醉的胚胎转移到培养皿的盖子上，并将胚胎保持在尽可能小的培养基体积内。通过在 30 摄氏度下用 1% 低熔点 agros 和 trica 移液，将胚胎转移到 aros 中，并将其放入盖玻片底培养皿中。当 agros 聚合时，使用光滑的塑料尖端定位胚胎。
在配备 405、488 和 561 纳米激光源和 20 倍物镜的倒置共聚焦显微镜上用 Trica 溶液覆盖它。使用 488 和 561 纳米激光器生成样品整个结构的 Z 堆栈，其中包括感兴趣的区域。选择时间序列工具并设置两个无间隔的周期，一个用于照片转换前，一个用于照片转换后。
选择区域的工具，并定义一个或多个感兴趣的照片转换区域。接下来，选择漂白工具并设置为扫描后开始漂白。这里使用的两种激光器之一是 30 毫瓦 405 纳米二极管激光器。
针对完成照片转换所需的最小激光量进行精心优化，这是通过改变激光的强度、感兴趣区域的扫描迭代和扫描速度来实现的。使用 488 纳米和 561 纳米激光器扫描样品，以可视化光转换荧光蛋白的任何剩余绿色和光转换红色荧光。光转化后，丢弃溶液，并使用针头或光滑的塑料尖端小心地从细胞中取出胚胎。
将胚胎在 28.5 摄氏度的黑暗中保存在鸡蛋水中，直到所需的发育阶段。第二次嵌入胚胎，然后再次使用 488 和 561 纳米激光器生成标本的 Zack，包括感兴趣的区域。因为这个方案不会影响正常发育，所以可以在后期观察光转化的胚胎。
这是光转化测定的实例。在受精后 48 至 72 小时的斑马鱼发育过程中，使用在内皮细胞核内表达踢 G 的转基因报告基因系跟踪内皮细胞，如图所示，在光转换踢 G 在内皮组织中表达，并且只能使用 488 纳米氩激光对照扫描和 561 纳米激光进行红色荧光检测为绿色荧光。在照片转换之前没有检测到任何照片转换的踢 GR。
随后，使用 405 纳米二极管激光器以 10% 的强度对感兴趣区域进行完全光转换，迭代 20 次，并使用 488 纳米和 561 纳米激光器再次扫描头部血管。在这个面板中，绿色踢 G 在感兴趣区域内完全切换到红色，以跟踪后期光转化的内皮细胞。在光转换后 24 小时观察胚胎，即受精后约 72 小时，内皮组织内产生于感兴趣的光转换区域。
由于红色荧光光转化踢 G 的稳定性，以及发育后合成新的绿色非转化踢 G，观察到非和光转化踢 G 蛋白。这项技术为发育生物学领域的研究人员探索几种鱼类的细胞生物学和组织重塑铺平了道路。
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概览
本文介绍了一种使用光可转换荧光蛋白在活体斑马鱼胚胎中追踪光开关细胞的方法。该技术允许通过共聚焦显微镜监测发育过程中的细胞生物学事件。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 光可转换荧光蛋白（PCFPs）能够使特定细胞可视化。
- 在活体生物中追踪细胞事件对于理解发育至关重要。
- 斑马鱼胚胎是研究脊椎动物发育的模型生物。
- 共聚焦显微镜提供了生物样品的高分辨率成像。
研究目的
- 开发一种在斑马鱼胚胎中追踪光开关细胞的方法。
- 监测发育过程中光转换蛋白的稳定性。
- 增强对活体脊椎动物发育过程的理解。
使用的方法
- 将斑马鱼胚胎嵌入低熔点琼脂中。
- 表达组织特异性光可转换荧光蛋白。
- 在感兴趣区域光转换蛋白。
- 在28.5摄氏度的卵水中维持胚胎以供发育。
主要结果
- 光转换细胞可以在后期发育阶段被检测到。
- 光转换蛋白的稳定存在允许精确追踪。
- 共聚焦显微镜有效地可视化光开关细胞。
- 该方法可以应用于各种发育研究。
结论
- 所提出的方法对于在活体斑马鱼胚胎中追踪细胞事件是有效的。
- 它提供了对发育过程和细胞生物学的洞察。
- 这种方法可以在未来的脊椎动物发育研究中使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell tracking using photoconvertible proteins enables precise monitoring of cellular dynamics in vivo, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, reproducible data on cell fate and tissue remodeling, enhancing predictive confidence in preclinical models. The method’s applicability to zebrafish—a disease-relevant system—facilitates translational biomarker alignment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking specific cell populations during morphogenesis.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of protein fate changes in intact organisms.
- Predictive Value: Generates stable, quantifiable readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, fluorescent outputs compatible with confocal imaging for high-content screening.
- Reproducibility: Ensures consistent photoconversion efficiency via controlled laser parameters and embedding protocols.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated microscopy for longitudinal studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Tracks endothelial and other cell types in zebrafish models of vascular and developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring cellular events across developmental stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go criteria for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven cell tracking, supporting assay development for phenotypic screening, and informing translational research through longitudinal fate mapping.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target validation by isolating cellular contributions to morphogenetic processes.
- Screening: Generates quantitative fluorescence readouts for compound effect assessment in live embryos.
- Analytics: Delivers stable red/green signal ratios for objective comparison of photoconversion efficiency and protein turnover.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking cellular dynamics to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for tracking multiple cell types across diverse zebrafish transgenic lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in cellular mechanism and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embedding, photoconversion, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets via direct cell fate observation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, mechanism-linked cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic line maintenance, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to UV/blue laser sources (405 nm) and compatible photoconvertible protein expression systems.
- Necessitates standardization of laser intensity, scan speed, and iteration counts for reproducible photoconversion.
- Requires optimization across tissue types and developmental stages to avoid phototoxicity and ensure signal stability.
- Limited by the need for genetic accessibility and embryonic viability during prolonged imaging sessions.
