Name: 在斑马鱼发育的细胞追踪使用Photoconvertible蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习使用光转换荧光蛋白在活体斑马鱼胚胎中进行细胞追踪的方法。该技术结合共聚焦显微镜，可在发育过程中精确监测细胞生物学事件，为发育生物学和细胞生物学研究提供重要工具。

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我们感谢加拿大安大略省多伦多市病童医院的 Ian C. Scott 博士慷慨提供转基因斑马鱼品系 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7。我们感谢马克斯·德尔布吕克分子医学中心共聚焦与双光子显微镜核心设施及 Zoltan Cseresnyes 博士在技术操作和整体成像方面提供的出色支持。S.A.-S. 获得德国研究基金会（DFG）海森堡学者奖学金资助。本研究获得德国研究基金会（DFG）项目基金 SE2016/7-1 支持。

1. 获取用于光转化实验的胚胎
将表达PCFP的转基因斑马鱼进行同系交配后，选择荧光最强的纯合子胚胎，并在28.5 °C下培养至所需的胚胎发育阶段15。
注意 1：此预选将允许使用低激光功率扫描胚胎，从而避免光毒性和光漂白。
注意 2：由于光转换荧光蛋白（PCFPs）（如 Kaede 和 KikGR）对包括日光在内的光照高度敏感，建议在观察胚胎时使用低强度光源，并将胚胎保持在避光条件下。
2. 包埋
<ol>
	<li>在装有卵水的玻璃容器中，使用镊子在体视显微镜下对胚胎进行去壳处理。</li>
	<li>将已去壳的胚胎转移至 0.16 mg/ml 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯，Sigma-Aldrich）溶液（将 40μl 的 4 mg/ml 储备液加入 1 ml 的 1X E3 培养基中）中，以麻醉胚胎。</li>
</ol>
注意 1：使用玻璃移液管或剪去尖端的移液器吸头（P1000）转移胚胎，以尽量降低损伤胚胎的风险。
注意 2：去壳的幼期胚胎不应暴露于空气中，或被提升至水/空气界面，因为卵在受到机械应力时极易破裂。
<ol start="3">
	<li>将麻醉后的胚胎转移至培养皿盖上，并保持胚胎处于尽可能小体积的培养基中。</li>
	<li>用含有0.16 mg/ml Tricaine、温度为30 °C的1%低熔点琼脂糖（LMA, Lonza）溶液吸取胚胎，将其转移至琼脂糖中，并置于底部为盖玻片的培养皿盖玻片上（MatTek Corp. Ashland MA USA）。随后借助光滑的塑料吸头（例如剪去尖端的Microloader Pipette Tip, Eppendorf）调整胚胎方向，待低熔点琼脂糖凝固后，用0.16 mg/ml Tricaine溶液覆盖琼脂糖。</li>
</ol>
注意 1：在 60 °C 下熔化 1% LMA，并将熔化的琼脂糖保持在 30 °C。
3. 光转化
<ol>
	<li>在配备405 nm、488 nm和561 nm激光源的倒置共聚焦显微镜（如Zeiss LSM 710）上，使用488 nm激光对样品进行z轴层扫成像，覆盖待光转化并后续追踪的样本完整结构即，30 mW 氩离子激光器，强度5-7%，检测器设置为493-540 nm）和561 nm激光器（即，使用10 mW DPSS 561激光器（强度设为7-9%），检测器设置为587-651，分别扫描组织/器官中光转换蛋白的绿色和红色荧光。</li>
</ol>
注意 1：在光转化前的扫描中，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
注意 2：实验前务必扫描红色荧光，以排除是否存在意外生成的红色转化PCFP。
<ol start="2">
	<li>选择时间序列工具，并设置为2个周期，无间隔（一个用于光转化前，一个用于光转化后）。</li>
	<li>选择区域工具，并定义一个或多个用于光转化的兴趣区域（ROI）。</li>
</ol>
注意 1：我们建议首先通过测量固定样本中 ROI 内实际被扫描激光光转化的组织/细胞区域（在预期无细胞或蛋白质移动的情况下，测量 xy 和 z 三个方向）来确定光转化区域与软件中选定 ROI 的匹配精度。在本应用所述的设置下，ROI 与光转化区域具有很高的匹配精度，但该精度取决于所用物镜及光转化过程中施加的激光量。根据物镜的数值孔径、缩放倍数以及用于光转化的激光量，ROI 的大小可缩小至单个细胞的尺寸。
<ol start="4">
	<li>选择漂白工具，并设置在第2次扫描中的第1次扫描后开始漂白。我们使用30 mW的405 nm半导体激光器进行光转化，并仔细优化实现完全光转化所需的最低激光强度，主要通过调整激光强度、ROI的扫描次数和像素驻留时间（即，扫描速度）来实现。</li>
</ol>
注意 1：光转换实验中我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
注意2：激光功率和迭代次数需针对每个实验条件通过实验确定，应确保在ROI内实现绿色至红色PCFP的完全光转化，同时使用尽可能少的激光照射以降低光毒性。我们建议从低激光功率开始进行测试例如 3%，对应物镜平面中的0.03 mW）结合较低的迭代次数（例如 20），随后逐渐增加激光功率，直至完成完全的光转化，据我们实验结果，此过程在10%激光功率下（相当于物镜平面0.1 mW）即可实现。在这些条件下，所有受试胚胎均能存活于处理方案。然而，我们观察到卵黄膜对激光脉冲较为敏感，容易受损，从而导致胚胎死亡。因此，若目标组织位置靠近卵黄体，则光转化后可能导致胚胎致死。
<ol start="5">
	<li>使用488 nm和561 nm激光，通过z轴扫描对样品进行成像，以观察残留的绿色荧光以及PCFP光转化后的红色荧光。</li>
</ol>
注意 1：光转化后的扫描使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
4. 从琼脂糖中取出胚胎
<ol>
	<li>弃去溶液，借助针头或光滑的塑料吸头小心地将胚胎从1% LMA中取出。</li>
	<li>将胚胎置于避光的养鱼水中，在28.5 °C条件下培养至所需发育阶段。</li>
</ol>
注意1：胚胎在卵水中持续发育非常重要，尤其是在胚胎体伸长发育的最初几天。实际上，某些胚胎组织/器官在发育过程中会发生位置变化，因此包埋时需要特定的方向，这取决于所关注的特定组织/器官以及目标分析的发育阶段。
5. 重新包埋
<ol>
	<li>按照本方案中第 2.) 步的操作进行。</li>
</ol>
6. 后续胚胎阶段中光转化组织的追踪
<ol>
	<li>使用488 nm和561 nm激光分别对绿色和红色荧光信号进行感兴趣区域的扫描（z-Stack）。</li>
</ol>
注意 1：对于光转化后 x 小时的扫描，我们使用了 Plan Apochromat 20x/NA 0.8 物镜。
注意 2：由于本方案不影响胚胎的正常发育，因此可以在发育的后期阶段观察光转化后的胚胎（为此，请按照第 4 - 6 步所述步骤进行操作）。
7. 代表性结果
光转换实验的一个示例如下所示 图1我们追踪了斑马鱼发育过程中的内皮细胞（有关发育中斑马鱼血管解剖结构的综述，请参见16). 因此，我们使用了斑马鱼 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 表达KikGR的内皮细胞核报告基因小鼠品系17. 将纯合且高表达的胚胎在 28.5 °C 直至受精后48小时（hpf）。去壳后，将胚胎麻醉并包埋于低熔点琼脂糖（LMA）中，使胚胎的头侧背侧朝向盖玻片，以便更清晰地观察头部血管。我们使用配备405 nm、488 nm和561 nm激光器的倒置共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710 Meta）以及Plan Apochromat 20x/NA 0.8物镜进行光转化实验及后续对光转化蛋白的追踪观察。如图所示 图1A，光转化前，KikGR 在内皮组织中表达，仅能通过 488 nm 氩激光检测到绿色荧光。使用 561 nm DPSS 561-10 激光进行红色荧光的对照扫描，在光转化前未检测到任何光转化的 KikGR图1A随后，使用405 nm激光二极管（强度10%，20次迭代）对ROI进行完全光转化，并再次利用488 nm和561 nm激光扫描头部血管。图1B）。如图所示 图1B，ROI 内的绿色 KikGR 已完全转化为红色。光转化实验后，将胚胎从琼脂糖中取出并继续培养于 28.5 °C 在卵水中。最后，在光转化后24小时（约72 hpf）再次观察胚胎，以追踪光转化后的内皮细胞在后续阶段的动态变化（图1C）。因此，将胚胎包埋于LMA中，并使用488 nm和561 nm激光对样品重新扫描。如图所示 图1C在由光转化ROI产生的内皮组织中，由于光转化后的红色荧光KikGR蛋白具有稳定性，同时又有新的绿色非光转化KikGR蛋白重新合成，因此可同时观察到非光转化与光转化的KikGR蛋白。
<img alt="斑马鱼中的光转化过程；显微镜图像中荧光蛋白随时间的变化。" src="/files/ftp_upload/4350/4350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 斑马鱼发育过程中 KikGR 的光转化。 (A, B) 在 Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 转基因胚胎中，于 48 小时（hpf）对头部内皮血管的特定区域进行光转化，并在光转化后 24 小时（约 72 hpf）再次观察 (C)。图中显示了 KikGR 的荧光（绿色）、光转化后的 KikGR（红色）以及通道合并图像。虚线圆圈分别标示了光转化前、光转化后以及光转化 24 小时后的感兴趣区域（ROI）。图像为斑马鱼胚胎的背侧视图，下方为头部。比例尺：50 μm。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>蛋白（缩写）</td>
			<td>激发波长 (nm)</td>
			<td>发射波长 (nm)</td>
			<td>消光系数 (EC)</td>
			<td>量子产率 (QY)</td>
			<td>四级结构</td>
			<td>亮度</td>
			<td>应用</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaede_G</td>
			<td>508</td>
			<td>518</td>
			<td>99</td>
			<td>0.9</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>259</td>
			<td rowspan="2">细胞示踪</td>
			<td rowspan="2">2,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaede_R</td>
			<td>572</td>
			<td>580</td>
			<td>60</td>
			<td>0.3</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KikGR_G</td>
			<td>507</td>
			<td>517</td>
			<td>54</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>112</td>
			<td rowspan="2">细胞示踪</td>
			<td rowspan="2">3,6,8-10 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KikGR_R</td>
			<td>583</td>
			<td>593</td>
			<td>35</td>
			<td>0.6</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKikGR_G</td>
			<td>505</td>
			<td>515</td>
			<td>49</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomer</td>
			<td>101</td>
			<td rowspan="2">动态示踪 超分辨成像</td>
			<td rowspan="2">13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKikGR_R</td>
			<td>580</td>
			<td>591</td>
			<td>28</td>
			<td>0.6</td>
			<td>monomer</td>
			<td>53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosFP_G</td>
			<td>506</td>
			<td>516</td>
			<td>72</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>150</td>
			<td rowspan="2">细胞示踪</td>
			<td rowspan="2">5,20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosFP_R</td>
			<td>571</td>
			<td>581</td>
			<td>41</td>
			<td>0.5</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdEos_G</td>
			<td>506</td>
			<td>516</td>
			<td>34</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tandem dimer</td>
			<td>165</td>
			<td rowspan="2">超分辨成像</td>
			<td rowspan="2">12,14,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdEos_R</td>
			<td>569</td>
			<td>581</td>
			<td>33</td>
			<td>0.6</td>
			<td>tandem dimer</td>
			<td>59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEos2_G</td>
			<td>506</td>
			<td>519</td>
			<td>56</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomer</td>
			<td>140</td>
			<td rowspan="2">动态示踪 超分辨成像</td>
			<td rowspan="2">11,18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEos2_R</td>
			<td>573</td>
			<td>584</td>
			<td>46</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomer</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendra2_G</td>
			<td>490</td>
			<td>507</td>
			<td>45</td>
			<td>0.5</td>
			<td>monomer</td>
			<td>67</td>
			<td rowspan="2">动态示踪 超分辨成像</td>
			<td rowspan="2">4,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendra2_R</td>
			<td>553</td>
			<td>573</td>
			<td>35</td>
			<td>0.55</td>
			<td>monomer</td>
			<td>57</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 I. 光转换荧光蛋白的性质。 表中列出了每种光转换荧光蛋白（PCFP）的常用名称和/或缩写、最大激发波长（Ex）、最大发射波长（Em）、摩尔消光系数（EC，10⁻³ M⁻¹ cm⁻¹）、量子产率（QY）、生理相关四级结构、相对亮度（以EGFP亮度的百分比表示）、应用领域及参考文献。本表改编自 Day 和 Davidson，20101。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCFP</td>
			<td>斑马鱼转基因品系</td>
			<td>来源</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="10">Kaede</td>
			<td>Tg(elavl3:Kaede)rw0130a</td>
			<td>Okamoto 实验室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(ins:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lhx5:Kaede)b1204/+</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(olig2:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:Kaede)rk8</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(vsx2:Kaede)nns2</td>
			<td>Higashijima 实验室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">KikGR</td>
			<td>Tg(kdrl:nlsKikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(krt4:NTR-KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:nlsKikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(sox10:KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EosFP</td>
			<td>Tg(sox10:EosFP)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(sox10:nlsEosFP)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dendra</td>
			<td>Tg(-8mpx:Dendra2)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:Dendra-kras)</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 II. 表达 PCFP 的转基因斑马鱼品系。数据来源于斑马鱼模式生物数据库（ZFIN，<a href="http://zfin.org/" target="_blank">http://zfin.org/</a>）。斑马鱼国际资源中心（ZIRC，<a href="http://zebrafish.org/zirc/" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/</a>）中品系的可获取情况已作标注。

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-rational+engineering+of+a+coral+fluorescent+protein+into+an+efficient+highlighter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter.</a> EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).</li>
<li>Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+invasion+is+a+spatially-ordered+progression+into+the+head+with+higher+cell+proliferation+at+the+migratory+front+as+revealed+by+the+photoactivatable+protein%2C+KikGR%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR.</a> Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).</li>
<li>Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+iUBC-KikGR+photoconvertible+transgenic+mice+for+live+time-lapse+imaging+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development.</a> Genesis. 49, 591-598 (2011).</li>
<li>Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green-to-red+photoconvertible+fluorescent+proteins%3A+tracking+cell+and+protein+dynamics+on+standard+wide-field+mercury+arc-based+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes.</a> BMC Cell Biol. 11, 15(2010).</li>
<li>Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+protein%2C+supervillin%2C+accelerates+F-actin-dependent+rapid+integrin+recycling+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility.</a> Traffic. 11, 782-799 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).</li>
<li>Lazic, S., Scott, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2cb+regulates+late+myocardial+cell+addition+from+a+second+heart+field-like+population+of+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish.</a> Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of zebrafish development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).</li>
<li>Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Foxd3+and+Mitf+regulates+cell+fate+plasticity+in+the+zebrafish+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest.</a> Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).</li>
<li>Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconvertible+fluorescent+protein+EosFP%3A+biophysical+properties+and+cell+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications.</a> Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

近年来，已成功构建出表达光转化蛋白（如 Kaede 或 KikGR）的转基因动物模型。这些动物发育正常，表明这些蛋白对胚胎发育无毒性作用。首次关于利用光转化实验追踪动物胚胎中细胞的研究由 Hatta 及其合作者完成，他们将编码 Kaede 的 mRNA 或 DNA 注射到单细胞期斑马鱼胚胎中以实现广泛表达，或利用 Gal4-UAS 系统在神经组织中表达 Kaede 和 KikGR6。该研究成功实现了细胞运动的可视化以及神经形态的追踪，证明了该工具在研究神经管形成、感觉板发育以及早期联合轴突在后脑中的导航等形态发生过程中的广泛应用价值6。在鸡胚模型中，通过电穿孔将 KikGR 导入神经管，并在神经嵴或神经管中进行光转化，用于选择性地标记鸡胚迁移流中神经嵴细胞的亚群8。在小鼠中也对 Kaede 和 KikGR 的光转化性能进行了比较，结果表明 KikGR 是最适合用于胚胎干细胞和小鼠细胞标记及谱系研究的光转化蛋白，因其在发育过程中呈中性、荧光亮度高，并能快速且完全地完成光转化9。最近，Griswold 及其合作者构建了转基因小鼠品系 iUBC-KikGR...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">饲养鱼类和收集鱼卵所需的设备（详见《斑马鱼手册》22）。</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6 体视显微镜</td><td>配备 488 nm 激光器</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td>配备 488 nm、561 nm 和 405 nm 激光器</td></tr><tr><td>加热块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corp</td><td></td><td>Ashland MA USA</td></tr><tr><td>微量移液器加样头（Microloader）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;鱼卵水培养基&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>60 &amp;mu;g/ml Instant Ocean 海盐溶于 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;E3 培养基&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.17 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.00001% (w/v) 亚甲蓝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;4 mg/ml 三卡因储备液&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>400 mg 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>97.9 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 ml 1M Tris (pH9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>调节 pH 至 7，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;1% LMA（低熔点琼脂糖，Lonza）&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>1 g LMA / 100 ml 1× E3 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分装后于 4 &amp;deg;C 保存</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用光转化蛋白在斑马鱼发育过程中进行细胞示踪

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

胚胎发生是一个动态过程，最适合通过能够记录活体发育变化的技术进行研究。in vivo 使用基因编码的荧光蛋白已被证明是阐明完整生物体中动态形态发生过程的有效策略。在过去十年中，光激活和光转换荧光蛋白的发展使得研究标记蛋白特定亚群的命运成为可能1。与光激活蛋白不同，光转换荧光蛋白（PCFPs）可在光转换前以其天然发射状态被直接追踪和成像，从而更易于通过光学观察识别和选择目标区域。PCFPs（如 Kaede2、KikGR3、Dendra4 和 EosFP5）在紫外光或蓝光照射下可由绿色转变为红色，这是由于其含有 His-Tyr-Gly 三肽序列，可形成绿色发色团，并通过光催化β-消除反应及随后π共轭体系的延伸，转化为红色发色团3。PCFPs 及其单体变体分别是追踪细胞6-10 和研究蛋白质动态行为11-14 的有用工具。近年来，PCFPs 已在多种动物模型中表达，例如斑马鱼6、鸡7,8 和小鼠9,10，用于细胞命运追踪。本文报道了一种在活体斑马鱼胚胎中对 PCFPs 进行细胞特异性光转换，并在后续发育阶段追踪光转换后蛋白的实验方案。该方法可在组织特异性水平上研究斑马鱼模型中形态发生所依赖的细胞生物学事件。

本文介绍了一种在活体斑马鱼胚胎中对光转化荧光蛋白（PCFPs）进行光激活转换，并在发育过程中的特定时间点追踪已光转化蛋白的方法。该方法可用于监测活体脊椎动物个体发育过程中不同发育事件所涉及的细胞生物学过程。

胚胎发育是一个动态过程，通过能够记录体内发育变化的技术进行研究最为理想。使用……

本实验的总体目标是在活体斑马鱼胚胎中追踪光转换细胞。首先将表达组织特异性光转化荧光蛋白的胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，随后对目标区域内的荧光蛋白进行完全的光转化，从而实现上述目标。然后将胚胎小心地从琼脂中取出，并在28.5摄氏度的养鱼用水中培养至后续发育阶段。最后，将光转化后的胚胎再次包埋于低温熔点琼脂中。最终，通过共聚焦显微镜观察，可获得结果显示：由于光转化蛋白的稳定性，在后续阶段仍能精确定位光转化的细胞。因此，我们认为今天介绍的这一方法在细胞与发育生物学领域将具有重要的应用价值。我们相信，该方法在细胞迁移、组织动态以及其他细胞行为的研究中将发挥重要作用。实验操作将由我实验室的博士后研究员 Veronica Lombardo 演示，实验所用为表达光可转换荧光蛋白的转基因斑马鱼。选择最亮的、处于纯合状态的胚胎，并在达到所需发育阶段后，于28.5摄氏度下继续培养。使用镊子将胚胎放入盛有胚胎培养液的玻璃容器中进行脱膜，以麻醉胚胎。使用玻璃移液管或剪去尖端的移液枪头，逐个将胚胎转移至三卡溶液中。将麻醉后的胚胎转移至培养皿盖上，并保持胚胎处于尽可能小体积的培养基中。使用30摄氏度的含1%低熔点琼脂糖的Trica溶液通过移液将胚胎转移至琼脂糖中，然后将其置于玻璃底培养皿的盖子内。待琼脂糖聚合后，使用光滑的塑料吸头调整胚胎的方向。将样品置于配备405、488和561纳米激光源以及20倍物镜的倒置共聚焦显微镜下，并用Trica溶液覆盖。使用488和561纳米激光对包含感兴趣区域的样品完整结构进行Z轴扫描成像。选择时间序列工具，设置两个无间隔循环，分别用于光转化前和光转化后。选择该区域的工具，并为图像转换定义一个或多个感兴趣区域。接着，选择漂白工具，并设置在扫描后开始漂白。此处使用的两种工具之一是30毫瓦405纳米的二极管激光器。通过调整激光强度、目标区域的扫描次数和扫描速度，精心优化实现完全光转化所需的最低激光光量。使用488纳米和561纳米激光扫描样品，以观察残留的绿色荧光以及光可转化荧光蛋白经光转化后产生的红色荧光。光转化完成后，弃去溶液，并用针头或光滑的塑料尖端小心地将胚胎从农杆菌溶液中取出。将胚胎置于避光条件下，于28.5摄氏度的胚胎培养水中培养，直至达到所需发育阶段。再次包埋胚胎，然后使用488纳米和561纳米激光，对样本（包括目标区域）重新生成Zack图像。由于本方案不影响正常发育，因此可在后续发育阶段继续观察光转化后的胚胎。以下是一个光转化实验的示例。在斑马鱼发育过程中，从受精后48小时到72小时，利用一种在内皮细胞核中表达kick G的转基因报告品系追踪内皮细胞。如图所示，在光转化之前，kick G在内皮组织中表达，仅可通过488纳米氩激光进行控制扫描，并使用561纳米激光检测红色荧光，此时未检测到任何光转化后的kick GR。随后，使用405纳米二极管激光器在10%强度下进行20次迭代，对目标区域进行完全光转化，并再次使用488纳米和561纳米激光器扫描头部血管。在此图面板中，目标区域内绿色荧光蛋白（green kick G）已完全转变为红色，以追踪光转化后的内皮细胞在后续阶段的动态。在光转化后24小时（即受精后约72小时）观察胚胎，评估源自光转化目标区域的内皮组织。由于红色荧光光转化的 kick g 蛋白稳定性较高，以及在其发育后合成了新的绿色非光转化 kick G 蛋白，因此同时观察到了非光转化和光转化的 kick G 蛋白。该技术为发育生物学领域的研究人员探索多种鱼类的细胞生物学及组织重塑奠定了基础。

cell-tracking-using-photoconvertible-proteins-during-zebrafish

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在斑马鱼发育的细胞追踪使用Photoconvertible蛋白

本方案描述了在活体斑马鱼胚胎中对单个神经元或神经嵴细胞进行成像的方法。该方法利用荧光共聚焦延时显微镜观察细胞行为及肌动蛋白的定位。...

斑马鱼胚胎中单个神经元和神经嵴细胞的活体成像及肌动蛋白细胞骨架观察

多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。...

活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。...

斑马鱼单细胞命运图谱绘制

本视频展示了利用表达光可转换绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼幼鱼追踪白细胞募集的过程。通过将红色荧光染料标记的细菌预先注射到内耳囊中并诱导光转换，可观察白细胞在体内的迁移、吞噬及扩散过程，从而深入了解免疫反应动态。...

基于光转化的细菌感染转基因斑马鱼中白细胞追踪

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

我们建立了光转换PSmOrange系统，作为一种强大、直接且成本低廉的工具，用于 体内...

利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。...

一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP)...

多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

本文介绍了一种通过紫外光照射活体动物中表达荧光蛋白Eos的特定区域，实现细胞光转化的实验方案。...

活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

本方案描述了一种在活体斑马鱼胚胎的心内膜细胞中对Kaede荧光蛋白进行光转化的方法，该方法可用于追踪心内膜细胞在房室管及房室心脏瓣膜发育过程中的动态变化。...

通过细胞光转化追踪斑马鱼胚胎中的心内膜组织运动

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

学习使用光转换荧光蛋白在活体斑马鱼胚胎中进行细胞追踪的方法。该技术结合共聚焦显微镜，可在发育过程中精确监测细胞生物学事件，为发育生物学和细胞生物学研究提供重要工具。

利用光转化蛋白在斑马鱼发育过程中进行细胞示踪

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