Name: 病毒粒子为肿瘤显像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 了解植物病毒纳米颗粒用于肿瘤靶向成像的方法。本研究展示荧光标记CPMV在小鼠异种移植模型中的制备、功能化及体内分布检测，为癌症靶向治疗提供新策略。

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本工作得到了美国国立卫生研究院/国立生物医学成像与生物工程研究所（NIH/NIBIB）R00 EB009105（授予NFS）和P30 EB011317（授予NFS）基金、NIH/NIBIB培训基金T32 EB007509（授予AMW）、凯斯西储大学跨学科联盟投资基金（授予NFS）以及凯斯综合癌症中心基金P30 CA043703（授予NFS）的支持。我们感谢斯坦梅茨实验室的本科学生研究人员提供的实际协助：Nadia Ayat、Kevin Chen、Sourav (Sid) Dey、Alice Yang、Sam Alexander、Craig D'Cruz、Stephen Hern、Lauren Randolph、Brian So 和 Paul Chariou。

1. VNP（CPMV、BMV、PVX 和 TMV）的扩增
<ol>
	<li>将室内植物培养室的控制参数设置为每日15小时光照期（100%光照，25 °C，65%湿度）和9小时黑暗期（0%光照，22 °C，60%湿度）。</li>
	<li>根据表1中的时间线对植物进行接种。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CPMV</td>
			<td>PVX、TMV 和 BMV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">第0天：每盆种植3粒豇豆种子。</td>
			<td>第0天：每盆播种约30粒弯叶烟（N. benthamiana）种子。每周施肥一次，每5升水加入1汤匙肥料。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第14天：将弯叶烟移栽至每盆1株。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第10天：通过机械接种法，使用少量碳化硅对豇豆的初生叶片接种CPMV（5 μg/50 μl/叶片）。</td>
			<td>第28天：通过机械接种法，使用少量碳化硅对3至5片叶片分别接种PVX、TMV或BMV（5 μg/50 μl/叶片）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第20天：收获叶片并储存于-80 °C。</td>
			<td>第42天：收获叶片并储存于-80 °C。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 叶片培养、接种和收获的时间线。
注意：此处仅以 CPMV 的扩增作为示例进行说明。
2. VNP（CPMV、BMV、PVX 和 TMV）纯化
注意：所有步骤均在冰上或 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>使用标准搅拌机将100 g冷冻叶片与2倍体积的冷缓冲液（见表2）进行匀浆。用2-3层纱布过滤。</li>
	<li>对于PVX，使用1 M HCl将pH值调节至6.5。加入0.2%（w/v）抗坏血酸和0.2%（w/v）亚硫酸钠。</li>
	<li>将粗制植物匀浆在5,500 × g下离心20分钟。收集上清液。</li>
	<li>对于BMV，将25 ml上清液铺在5 ml 10%（w/v）蔗糖溶液上。在9,000 × g下离心3小时，将沉淀重悬于38.5%（w/v）CsCl溶液中。振荡混合5小时，然后继续进行步骤2.12。</li>
	<li>通过加入0.7倍体积的1:1（v/v）氯仿:1-丁醇萃取植物材料。搅拌混合物30-60分钟。</li>
	<li>将溶液在5,500 × g下离心20分钟。收集上层水相。</li>
	<li>加入NaCl至终浓度0.2 M，并加入8%（w/v）PEG（分子量8,000）。对于TMV，还需加入1%（v/v）Triton X-100。搅拌至少1小时，然后静置至少1小时。</li>
	<li>将溶液在15,000 × g下离心15分钟。将沉淀重悬于10 ml缓冲液中。对于PVX，加入0.1% β-巯基乙醇，并加入尿素至0.5 M。</li>
	<li>在8,000 × g下离心30分钟，收集上清液。</li>
	<li>将上清液在160,000 × g下超速离心3小时。将沉淀在5 ml缓冲液中重悬，过夜。</li>
	<li>用缓冲液配制等体积的10%、20%、30%和40%蔗糖溶液（从最重开始）形成10-40%蔗糖梯度。室温下静置过夜使梯度平衡。</li>
	<li>将重悬后的沉淀在蔗糖梯度上于100,000 × g下超速离心2小时（BMV为24小时）。</li>
	<li>收集光散射条带，并在缓冲液中透析。</li>
	<li>对VNPs进行表征（见下文），并在4 °C保存。如需长期保存，应置于-80 °C。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CPMV 和 TMV</td>
			<td>0.1 M 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0) 
			38.5 mM KH2PO4 
			61.5 mM K2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVX</td>
			<td>0.5 M 硼酸缓冲液 (pH 7.8) 
			0.5 M 硼酸 
			用 NaOH 调节 pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMV</td>
			<td>SAMA 缓冲液 (pH 4.5) 
			250 mM 醋酸钠 
			10 mM MgCl2 
			2 mM β-巯基乙醇（新鲜添加）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 每种VNP的缓冲液及其配方。
注意：此处仅以 CPMV 的扩增为例进行演示。
3. VNP（CPMV、BMV、PVX 和 TMV）表征
<ol>
	<li>采用紫外/可见光谱法测定病毒纳米颗粒（VNPs）的浓度。
	<ol>
		<li>使用 NanoDrop 分光光度计测量 2 μl 样品的吸光度。</li>
		<li>利用比尔-朗伯定律（A=εcl，其中 A 为吸光度，ε 为消光系数，c 为浓度，l 为光程）确定颗粒和染料的浓度。NanoDrop 的光程为 0.1 cm。 
		病毒纳米颗粒特异性的消光系数如下： 
		CPMV： 8.1 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处） 
		PVX： 2.97 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处） 
		TMV： 3.0 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处） 
		BMV： 5.15 cm-1mg-1ml（在 260 nm 处）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过尺寸排阻快速蛋白液相色谱（FPLC）分析颗粒。
	<ol>
		<li>使用 Superose 6 尺寸排阻柱和 ÄKTA Explorer 系统，将 50–100 μg 的 VNPs 溶于 200 μl 的 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中上样。</li>
		<li>将检测器设置为 260 nm（核酸）、280 nm（蛋白质）以及所连接染料的激发波长。</li>
		<li>以 0.5 ml/min 的流速运行 72 分钟。</li>
		<li>洗脱图谱及 A260:A280 比值可反映 VNP 制备物是否纯净，以及颗粒是否完整并正确组装。 
		以下 A260:280 比值表明 VNP 制备物纯净： 
		CPMV： 1.8±0.1 
		PVX： 1.2±0.1 
		TMV： 1.1±0.1 
		BMV： 1.7±0.1</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行变性 Bis-Tris 聚丙烯酰胺 4–12% 梯度凝胶电泳（预铸 NuPAGE 凝胶）以分析制备物的纯度及与单个衣壳蛋白的偶联情况。
	<ol>
		<li>向 9 μl 磷酸钾缓冲液中的 10 μg 颗粒中加入 3 μl 4x LDS 上样缓冲液。对于 BMV，额外加入 1 μl 4x LDS 上样缓冲液和 3 μl β-巯基乙醇，以还原大量二硫键。</li>
		<li>在 100 °C 的金属浴中孵育 5 分钟。</li>
		<li>将样品上样至 SDS 凝胶。</li>
		<li>在 1x MOPS 电泳缓冲液中以 200 V 电压运行 1 小时。</li>
		<li>在紫外光下成像凝胶，以观察荧光标记的衣壳蛋白。</li>
		<li>对于非荧光蛋白，使用考马斯亮蓝染色液（0.25% (w/v) 考马斯亮蓝 R-250，30% (v/v) 甲醇，10% (v/v) 乙酸）染色 1 小时。</li>
		<li>用含 30% 甲醇和 10% 乙酸的溶液脱色过夜。必要时更换脱色液。</li>
		<li>在白光下对凝胶进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）分析颗粒的完整性。
	<ol>
		<li>将样品用 20 μl 去离子水中稀释至 0.1–1 mg/ml。</li>
		<li>将 20 μl 样品液滴置于 Parafilm 膜上。</li>
		<li>将 TEM 铜网覆盖于液滴上，静置 2 分钟。用滤纸从铜网上吸去多余液体。</li>
		<li>将铜网置于去离子水液滴上清洗一次，再用滤纸吸干。</li>
		<li>将铜网置于 20 μl 的 2% (w/v) 醋酸铀酰液滴上染色 2 分钟，再用滤纸吸去多余染色液。</li>
		<li>再次用去离子水清洗铜网一次。</li>
		<li>在透射电子显微镜下观察铜网。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. VNPs 与 PEG 及荧光染料的化学偶联、纯化与表征
<ol>
	<li>对于以下反应的计算，VNPs 的摩尔质量为： 
	CPMV： 5.6 × 106 g/mol 
	PVX： 35 x 106 g/mol 
	烟草花叶病毒 41 x 106 g/mol 
	BMV： 4.6 × 106 g/mol</li>
	<li>使用一步法将染料和聚乙二醇（PEG）偶联至CPMV和PVX表面的赖氨酸残基 NN-羟基琥珀酰亚胺偶联反应：将2,500摩尔当量（所有摩尔过量均指每VNP的摩尔过量）Alexa Fluor 647 琥珀酰亚胺酯和4,500当量NHS-PEG（分子量5,000）溶于DMSO中，加入至CPMV的0.1 M磷酸钾缓冲液中。处理PVX时，加入10,000摩尔过量的NHS-染料和NHS-PEG。调节缓冲液和DMSO体积，使CPMV和PVX的终浓度为2 mg/ml，DMSO含量为总体反应体积的10%。将反应混合物在室温避光条件下孵育过夜。CPMV和PVX分别具有300和1,270个可标记的赖氨酸残基。读者可参考以下文献，以进一步了解CPMV和PVX的化学修饰： 13-15).</li>
	<li>通过重氮盐偶联反应将染料和聚乙二醇（PEG）连接至烟草花叶病毒（TMV）的酪氨酸残基，随后进行铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应。
	<ol>
		<li>通过混合400 μl的0.3 M炔烃重氮盐来制备重氮盐（炔烃） p对甲苯磺酸一水合物，3.0 M 亚硝酸钠 25 μl，以及溶于乙腈的 0.68 M 蒸馏 3-乙炔基苯胺 75 μl，在 4 °C 下反应 1 小时。</li>
		<li>向1.25 ml的TMV（20 mg/ml储备液）中加入3.3 ml含100 mM NaCl的硼酸盐缓冲液（pH 8.8）。</li>
		<li>在冰浴中将烟草花叶病毒（TMV）与450 μl重氮盐（炔基）溶液反应3小时，通过重氮偶联反应在TMV上引入炔基连接基团。溶液将变为浅棕色。TMV含有2,140个可用于偶联的酪氨酸残基。</li>
		<li>使用蔗糖垫纯化最终产物，具体步骤如4.4所述。</li>
		<li>使用铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）连接叠氮功能化的Alexa Fluor 647和PEG-叠氮（分子量5,000）。每摩尔外壳蛋白加入2当量的染料叠氮和PEG-叠氮，并与1 mM CuSO₄孵育4，2 mM AMG 和 2 mM 抗坏血酸钠，室温孵育 15 分钟。调整缓冲液体积，使 TMV 的终反应浓度为 2 mg/ml。（读者可参考以下文献，以进一步了解烟草花叶病毒（TMV）的化学修饰： 16,17).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将染料偶联至BMV半胱氨酸突变体（cBMV）的赖氨酸，将聚乙二醇（PEG）偶联至其半胱氨酸：
	<ol>
		<li>向0.1 M TNKM缓冲液（50 mM Tris碱，50 mM NaCl，10 mM KCl，5 mM MgCl₂）中的cBMV加入2,000摩尔当量溶于DMSO的Oregon Green 488琥珀酰亚胺酯。2，pH 7.4）。调整缓冲液和DMSO的体积，使BMV的终浓度为1 mg/ml，DMSO含量占总反应体积的10%。将反应混合物在4 °C避光孵育过夜。</li>
		<li>使用离心过滤器纯化颗粒，具体步骤如4.4所述。</li>
		<li>加入2,000倍摩尔过量的PEG-马来酰亚胺（分子量2,000），反应条件与之前相同，在4 °C下孵育反应混合物2小时。cBMV含有180个可反应的赖氨酸和半胱氨酸。读者可参考以下文献以进一步了解BMV的化学修饰：18).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化： 以160,000 × g离心2.5小时，使溶液通过40%（w/v）蔗糖垫层。将沉淀物重新溶解于缓冲液中。或者，使用截留分子量为10 kDa的旋转过滤器对适当的缓冲液进行透析。</li>
	<li>表征： 采用上述方法对聚乙二醇化并荧光标记的VNPs进行分析：紫外/可见光光谱法、SDS凝胶电泳、FPLC和TEM（未显示，但请参见 图6和图7) .</li>
</ol>
5. 使用小鼠异种移植模型进行肿瘤靶向与成像
<ol>
	<li>在含有5%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，使用175 cm2细胞培养瓶培养HT-29人结肠癌细胞。</li>
	<li>用无菌PBS洗涤细胞两次，加入5 ml胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟以消化细胞。加入5 ml RPMI培养基终止胰蛋白酶反应。在4 °C下以500 × g离心5分钟收集细胞，并用新鲜RPMI培养基重悬至5×106个细胞/50 μl（使用台盼蓝染色和血细胞计数板确定总细胞数）。注射前与等体积Matrigel混合（所有溶液和试剂均保持无菌）。</li>
	<li>获取6周龄NCR nu/nu小鼠，并给予无苜蓿饮食喂养2周。[注意：所有动物实验操作必须经IACUC批准。] 使用18½号无菌针头，在小鼠侧 flank 部位皮下注射5×106个细胞/100 μl（每只小鼠接种2个肿瘤）以建立肿瘤异种移植模型。定期监测动物状态，使用游标卡尺测量肿瘤大小，并让肿瘤生长至平均体积达20 mm3（约在接下来的12天内）。将小鼠随机分为两组：PBS组和VNP组（每组每时间点n = 3只动物）。使用1 ml 28号胰岛素注射器，经尾静脉注射100 μl无菌PBS或10 mg/kg VNP制剂。</li>
</ol>
注意：不会演示组织培养实验和活体动物研究。实际操作演示仅限于组织处理和数据采集。有关HT-29肿瘤异种移植模型的参考文献，请参见文献19。
评估VNPs肿瘤归巢能力的三种技术：
<ol start="4">
	<li>使用Maestro成像系统进行荧光成像： 在不同时间点（2、24 和 72 小时）使用 CO 处死小鼠2 气体。解剖动物，取出所有主要器官（脑、心、肺、脾、肾和肝）以及 flank 部位的肿瘤，将组织置于 Parafilm 上，使用黄色激发和发射滤光片（曝光时间 800 ms）通过荧光成像仪器检测组织中是否存在荧光信号（来源于与 VNPs 偶联的 A647 标记）。保存图像，并使用 ImageJ 1.44o 软件分析荧光强度<a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a>比较VNPs在肿瘤与其他主要组织中随时间的摄取模式。</li>
	<li>成像后，将每份组织切成两半，其中一半置于OCT包埋剂中用于冷冻切片和共聚焦分析；另一半收集至预先称重的冻存管中，并立即用液氮冷冻2-80 °C 保存，直至进行后续处理。</li>
	<li>荧光定量： 记录组织重量。将冷冻组织在室温下解冻后，分别放入含有1 ml PBS的50 ml Falcon管中。使用手持式组织匀浆器在PBS中匀浆2–3分钟，然后将匀浆液转移至微量离心管中。在13,000 × g离心10分钟，以去除未匀浆的组织。</li>
	<li>将每组（PBS 和 VNP 制剂/时间点）组织的上清液各 100 μl 用移液器转移至 384 孔黑色紫外板中。使用酶标仪检测荧光强度（激发/发射波长 600/665）。将获得的荧光值按组织重量进行归一化处理。</li>
	<li>免疫组织化学 制备冷冻切片机切片（10 μm），并于 -20 °C 保存。对组织切片进行细胞核染色（DAPI）和内皮细胞标志物染色（FITC 标记的小鼠抗 CD31 抗体）。进行共聚焦显微镜分析，以绘制荧光标记的 VNPs 在血管及肿瘤内部的分布定位。</li>
</ol>
注意： 本操作步骤将不进行演示，代表性数据见图8。有关免疫组织化学及所述染色方法的参考文献，读者可参阅文献19。

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<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案提供了一种对VNPs进行化学修饰的方法及其应用 体内 肿瘤成像。本文介绍的动物荧光成像、荧光定量和免疫组织化学技术可用于研究纳米颗粒的生物分布并评估其向肿瘤的靶向性。这些技术能够提供有关纳米颗粒通过EPR效应进入肿瘤组织的重要信息。结合多种分析方法的结果，可形成一种强大的综合策略，用于评估病毒样纳米颗粒（VNPs）的定位及其在体内的生物分布。
然而，在进行这些研究之前，必须首先获得高纯度的病毒制备物。除了机械接种外，病毒样颗粒（VNP）扩增的一种可能替代方法是农杆菌渗入法，该方法可具有较高的转化效率和积累速率。在扩增VNPs时，应注意将感染不同病毒的植株分开，以避免交叉污染。特别是烟草花叶病毒（TMV）极易通过机械方式传播和扩散。另一个需要特别注意的关键步骤是在冰上或4 °C条件下进行病毒纯化，所有缓冲液均应预冷至冰冻状态。较低的温度对于防止植物材料中存在的蛋白酶和氧化酶对VNPs造成损伤至关重要。
纯化病毒纳米颗粒（VNPs）的产量较低可能由多种因素引起。其中一个可能的原因是用于扩增的VNPs保存...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;病毒纳米颗粒的制备&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>室内植物培养室</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;豇豆（V. unguiculata）&lt;/em&gt; 种子（California black-eye no. 5）</td><td>伯比</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; 种子</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;N. benthamiana 种子由 Salk 研究所惠赠。种子通过植物繁殖获得。&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>碳化硅</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Pro-mix BX 育苗土</td><td>普雷米尔园艺</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>杰克牌专业20-10-20泥炭轻质肥料</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50.2 Ti 转子</td><td>贝克曼</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti 转子</td><td>贝克曼</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K 超速离心机</td><td>贝克曼</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>SLA-3000 转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯瓶</td><td>贝克曼</td><td>355607</td><td>对于 SLA-3000 转子</td></tr><tr><td>聚碳酸酯瓶</td><td>贝克曼</td><td>357002</td><td>对于 SS-34 转子</td></tr><tr><td>超清晰管</td><td>贝克曼</td><td>344058</td><td>用于蔗糖梯度和SW 32 Ti转子</td></tr><tr><td>聚碳酸酯瓶</td><td>贝克曼</td><td>355618</td><td>用于沉淀和 50.2 Ti 转子</td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>PowerEase 500 预制胶系统</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL（24 ml）凝胶过滤层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 色谱仪</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>贝克曼</td><td>392302</td><td>台式离心机</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 成像系统</td></tr><tr><td>组织撕裂器</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>FluoView 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;化学试剂与试剂&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-乙炔基苯胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>384孔黑色板</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>4X LDS 上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 叠氮化物</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 羧酸琥珀酰亚胺酯</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 ml 离心滤器</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>10 kDa 截留分子量</td></tr><tr><td>盐酸氨基胍</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>P5 级别</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸钠盐</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-2k</td><td>分子量 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanocs</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>分子量 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocs</td><td>PG1-SC-5k</td><td>分子量 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>俄勒冈绿 488 琥珀酰亚胺酯 *6-异构体*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>对甲苯磺酸一水合物</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>佩尔蒙特</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸钠</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜载网</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;组织培养&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>HT-29细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>康宁</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，0.05%（1X）含EDTA 4Na，液体</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;动物实验&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>18% 蛋白质啮齿类动物饲料</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>苜蓿-free饮食</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28 号规格</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质胶</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>NCR nu/nu 小鼠</td><td></td><td></td><td>凯斯西储大学学校&lt;br/&gt; 医学院无胸腺动物与异种移植核心设施</td></tr><tr><td>无菌注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18½ 号规格</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剂</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

纳米材料的应用有望彻底改变材料科学和医学领域。目前，多种不同的纳米颗粒正在被研究用于成像和治疗方面的应用。来源于植物的病毒纳米颗粒（VNPs）可被视为具有明确尺寸和形状的自组装生物纳米材料。Steinmetz 实验室正在研究的植物病毒包括由Cowpea mosaic virus（CPMV）和Brome mosaic virus（BMV）形成的二十面体颗粒，这两种颗粒的直径均为30 nm。我们还在开发来源于以下植物病毒的棒状和丝状结构：Tobacco mosaic virus（TMV）形成尺寸为300 nm × 18 nm的刚性棒状颗粒，而Potato virus X（PVX）则形成长度为515 nm、宽度为13 nm的丝状颗粒（有关VNPs的更多信息，请参见参考文献1和2）。
从材料科学家的角度来看，病毒纳米颗粒（VNPs）因其多种特性而成为极具吸引力的构建单元：这些颗粒具有单一分散性，且能够轻松实现大规模生产。 在植株中，具有极高的稳定性且生物相容性良好。此外，病毒纳米颗粒（VNPs）是可“编程”的单元，可通过基因改造或化学生物偶联方法进行特异性设计。 3VNPs 的结构已解析至原子分辨率，可在原子水平上进行空间精确定位的修饰。4，这种控制水平是目前最先进的技术所使用的合成纳米材料无法实现的。
本文中，我们描述了CPMV、PVX、TMV和BMV的增殖方法 Vigna unguiculata 和 Nicotiana benthamiana 植物。提供了每种病毒纳米颗粒（VNP）的提取和纯化方案。描述了对纯化后及化学标记的VNP进行表征的方法。本研究重点介绍使用荧光染料对VNP进行化学标记例如 Alexa Fluor 647）和聚乙二醇（PEG）。这些染料有助于追踪和检测VNPs 5-10，且聚乙二醇可降低蛋白质纳米颗粒的免疫原性，同时改善其药代动力学特性 8,11我们利用小鼠异种移植瘤模型展示了聚乙二醇化病毒纳米颗粒（PEGylated VNPs）的肿瘤靶向能力。通过组织荧光成像相结合的方法 离体 使用Maestro成像系统、匀浆组织中的荧光定量以及共聚焦显微镜来研究生物分布。病毒纳米颗粒（VNPs）通过网状内皮系统（RES）被清除；通过增强的通透性和滞留效应（EPR）实现肿瘤靶向。12VNP 纳米技术是一种强大的即插即用型技术，可用于成像和治疗疾病病灶 体内我们正在进一步开发病毒样颗粒（VNPs），以携带药物载荷和具有临床相关性的成像基团，以及组织特异性配体，用于靶向癌症和心血管疾病中过表达的分子受体。

<img alt="植物生长比较分析；实验设置，叶片颜色变化研究，黄化方法。" src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 植物病毒感染的植株。 感染CPMV的豇豆（Vigna unguiculata）植株（A）；感染PVX（B）、TMV（C）和BMV（D）的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株。图片拍摄于机械接种感染后约10天。
<img alt="吸光度与波长关系图；病毒比较：PVX、CPMV、BMV、TMV；光谱分析。" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352/4352fig2highres.jpg" src="/fil...

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。

纳米材料的应用有望彻底改变材料科学和医学领域。目前，多种不同的纳米颗粒正在被……

本实验的总体目标是研究荧光标记的病毒纳米颗粒在体内的肿瘤靶向性及生物分布。首先在小鼠肿瘤模型中增殖并纯化病毒，然后将染料和聚乙二醇（PEG）偶联到病毒颗粒上。在对功能化后的颗粒进行表征后，将其注射至荷有肿瘤异种移植物的小鼠体内。来自Maestro成像、荧光强度、组织匀质性测量以及免疫荧光的结果显示，病毒纳米颗粒在肿瘤及全身各器官中具有定位分布。纳米颗粒或病毒样颗粒（BMPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文描述了PLA病毒样颗粒（VMP）的制备、扩增、纯化、表征以及与肠组织偶联的实验步骤。最后，我们展示了利用黑色素瘤移植模型和荧光成像技术，V mps在肿瘤归巢与成像中的应用。目前，多种不同的纳米颗粒正在被研究用于成像和治疗领域。相较于金属或聚合物等合成材料，使用生物来源纳米颗粒的主要优势在于，植物来源的BMPs呈单分散状态，且其结构已知达到原子分辨率。植物病毒可通过分子农业进行大规模生产，并适用于基因工程和化学工程。在本演示中，我们展示了使用Fluor fours和PEG对病毒纳米颗粒进行化学修饰。Fluor fours将用于增强成像效果，而PEG则用于改善药代动力学特性。化学修饰可用于将治疗剂和造影剂负载到病毒纳米颗粒上，以用于临床成像，如磁共振成像（MRI）。本文展示了经修饰的病毒纳米颗粒与其他纳米颗粒类似的生物分布研究。病毒纳米颗粒在肿瘤部位的富集基于增强的通透性和滞留效应，该效应被称为被动性肿瘤靶向。我们最近发现，不同植物病毒的生物分布特征各不相同。在本演示中，我们将使用豇豆花叶病毒（copy mosa virus），该病毒被认为是病毒纳米技术的金标准。我们特别致力于开发、改造并研究来源于植物病毒的纳米材料。我们的实验室致力于深入理解菜豆畸矮病毒（cowpea mosaic virus）、芜菁花叶病毒（broccoli mosaic virus）、杆状马铃薯病毒（rock-shaped bacca mosaic virus）以及线状马铃薯X病毒（potato virus X）如何与哺乳动物系统相互作用。具体而言，我们希望探究病毒的形状和柔韧性如何影响其病毒样颗粒（EVO）的特性，并研究如何最优地设计这些颗粒以应用于组织特异性成像和药物递送。本文详细描述了卡拉病毒（kalp mosaic virus）、马铃薯X病毒（potato virus X）、褐斑花叶病毒（brown mosaic virus）以及烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus）的制备方法。从Vic、Gil和烟草属植物出发，我们描述了它们的功能化及其在临床前小鼠模型中的应用。在本实验中，我们将使用牛痘P花叶病毒，在室内培养室中进行孵育。每盆种植三粒牛痘P种子。第10天，通过机械接种法对每片叶片接种浓度为0.1微克/微升的CPMV，接种时先在叶片上均匀撒上少量碳化硅，然后轻

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

病毒粒子为<em在体内</em&gt;肿瘤显像

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。...

利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

来源：Kim, B. D.，等．在胶质母细胞瘤动物模型中通过纳米颗粒递送寡核苷酸载荷。J. Vis. Exp.

在小鼠胶质母细胞瘤模型中治疗性纳米颗粒的静脉注射

该视频展示了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中进行体内抗体定位的荧光成像方法。该方法包括将肿瘤细胞注射到小鼠体内，使其在皮下形成实体异种移植瘤。随后注射荧光标记抗体，通过肿瘤异种移植部位增强的荧光信号，验证抗体的特异性定位。...

活体荧光成像定位小鼠肿瘤异种移植模型中抗体分布

本视频展示了一种利用放射性免疫偶联物的技術 体内...

一种利用放射性标记抗体在小鼠模型中通过活体PET成像检测肿瘤的技术

本文详细介绍了肿瘤靶向纳米颗粒HerDox的光学成像分析步骤。特别是，本文描述了如何使用多功能成像设备检测肿瘤靶向性以及评估肿瘤穿透能力的具体方法。...

靶向递送至HER2阳性肿瘤的病毒蛋白纳米颗粒分析

本方案概述了执行所需的操作步骤 离体 验证 体内...

纳米抗体与抗体验证 在体 小鼠肿瘤异种移植NIRF成像实验 离体 流式细胞术与显微镜检查

对...的了解不足 体内 纳米药物的性能阻碍了其临床转化。用于评估的程序 体内...

全面评估的综合流程 在体 内 癌症纳米药物的性能评估

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

本文详细介绍了鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备与评价方法 体外 和...

鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗药物递送的重大障碍，而该疾病目前尚无治愈手段。本文报道了一种体内成像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台凭借其尺寸可绕过这一生理屏障，并在肿瘤部位富集。...

纳米颗粒递送寡核苷酸载荷在多形性胶质母细胞瘤动物模型中的应用

了解植物病毒纳米颗粒用于肿瘤靶向成像的方法。本研究展示荧光标记CPMV在小鼠异种移植模型中的制备、功能化及体内分布检测，为癌症靶向治疗提供新策略。

病毒纳米颗粒用于在体肿瘤成像

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