Name: 全基因组基因缺失链球菌血统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: 学习利用高通量PCR技术在Streptococcus sanguinis中实现全基因组单基因缺失的方法。该方法通过重组PCR扩增和转化技术，为细菌基因功能研究提供高效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01DE018138（PX）以及弗吉尼亚联邦大学校长研究激励计划（PRIP）144602-3（PX）的部分支持。我们感谢陈磊博士、窦月坦博士和王小静博士在构建全基因组突变体过程中提供的帮助。同时感谢弗吉尼亚联邦大学DNA核心实验室提供的DNA测序服务。

1. 引物设计
<ol>
	<li>引物是使用基于内部脚本设计的 S. sanguinis SK36 基因组序列。设计三对引物 F1/R1、F2/R2 和 F3/R3，用于扩增目的基因上游 1-kb 的序列 aphA-3 编码卡那霉素抗性的基因（Kmr）蛋白3 以及目标基因下游的1-kb序列（图1）。在这些引物中，F1 和 R3 是使用 EMBOSS 程序套件中的 ePrimer3 设计的（<a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a>）以扩增目标基因上游或下游的侧翼区域。根据目标基因的 5' 和 3' 序列设计基因特异性引物 R1 和 F3。R1 和 F3 引物在其 5' 端含有 25 个碱基的接头序列，该序列与 aphA-3 基因。每对引物的熔解温度均设计为尽可能接近60 °C，以便在96孔板格式的所有PCR反应中使用统一的退火温度。</li>
	<li>根据基因顺序，在96孔板中合成F1、R1、F3和R3引物。每块板包含相同基因顺序的一种引物类型。使用多通道移液器将引物稀释至96孔工作引物板中，用于PCR扩增，终浓度为10 μM。</li>
</ol>
2. 高通量 PCR 扩增与纯化
<ol>
	<li>为了高通量扩增目标 S. sanguinis 基因上游或下游1 kb的片段，需在冰上于15 ml锥形管中配制PCR混合液，其中包含1640 μl ddH2O、250 μl 10x高保真PCR缓冲液、200 μl 10 mM dNTP混合物、100 μl 50 mM MgSO4、100 μl 10 ng/μl S. sanguinis SK36基因组DNA以及10 μl高保真Platinum Taq DNA聚合酶。使用多通道移液器将23 μl该混合液转移至96孔PCR板的每个孔中。再使用多通道移液器将10 μM工作浓度引物板中的F1和R1（或F3和R3）各1 μl转移至PCR板对应孔中。密封PCR板后进行扩增：94 °C预变性1分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、54 °C退火30秒、68 °C延伸1.5分钟。</li>
	<li>制备含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶，凝胶需具有48个孔以适配多通道移液器加样。在96孔板中将4 μl PCR产物与1 μl 5x DNA上样缓冲液混合，使用10 μl多通道移液器将样品加入琼脂糖凝胶孔中。以135 V电压电泳30分钟，随后在UVP凝胶成像与分析系统下观察条带。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用PureLink 96 PCR纯化试剂盒并通过离心法对PCR产物进行纯化。洗脱DNA时，向结合板的每个孔中加入40 μl无菌ddH2O。</li>
	<li>随机选取板上若干纯化后的扩增产物，使用NanoDrop分光光度计检测DNA浓度，并将板上所有扩增产物的浓度调整至约10 ng/μl。</li>
	<li>使用EcoRI酶切含有Kmr抗性盒的质粒作为PCR模板。酶切后的质粒通过QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，并将线性质粒DNA的浓度调整至最终10 ng/μl。配制25 μl的Kmr抗性盒扩增反应体系，包括16.4 μl ddH2O、2.5 μl 10x高保真PCR缓冲液、2 μl 10 mM dNTP混合物、1 μl 50 mM MgSO4、1 μl 10 μM F2引物、1 μl 10 μM R2引物、1 μl线性质粒DNA以及0.1 μl高保真Platinum Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94 °C预变性1分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、68 °C延伸1分钟。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将10个独立PCR反应所得的Kmr抗性盒扩增产物经QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后合并成一批。将合并后的扩增产物浓度调整至10 ng/μl。</li>
	<li>为获得最终的线性重组PCR扩增产物，将三个PCR扩增片段（每种取1 μl，近似等摩尔量）混合于同一PCR板孔中作为PCR模板。加入其余PCR组分：14.4 μl ddH2O、2.5 μl 10x高保真PCR缓冲液、2 μl 10 mM dNTP混合物、1 μl 50 mM MgSO4、1 μl 10 μM F1引物、1 μl 10 μM R3引物以及0.1 μl高保真Platinum Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94 °C预变性2分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、68 °C延伸3.5分钟，最后在68 °C延伸4分钟。</li>
	<li>在琼脂糖凝胶上检测PCR扩增产物。按照前述方法对PCR扩增产物进行纯化和定量，并将重组后的PCR扩增产物于-20 °C保存。</li>
</ol>
3. 感受态细胞的制备
<ol>
	<li>制备Todd Hewitt肉汤，用10 N NaOH调节pH至7.6，加热至沸腾后冷却至室温，并使用0.22 μm聚苯乙烯滤器进行灭菌4。在15 ml锥形管中，向11.7 ml Todd Hewitt肉汤中加入300 μl热灭活的马血清（终浓度为2.5%），配制成TH+HS培养基。将TH+HS培养基分装为每管2 ml和10 ml。</li>
	<li>取5 μl保存于-80 °C的S. sanguinis SK36菌种接种至2 ml TH+HS培养基中，于37 °C紧密封盖培养过夜，同时将10 ml TH+HS培养基管预温育。</li>
	<li>过夜培养后，取50 μl菌液转接至10 ml TH+HS培养基中，于37 °C继续培养3小时（对应OD660为0.07–0.08），立即用于转化实验。</li>
</ol>
4. 细胞转化与抗生素筛选
<ol>
	<li>在96孔板上的EP管中加入2 μl 70 ng的S. sanguinis SK36感受态刺激肽（CSP）和2 μl线性重组PCR扩增产物（约50 ng），并在37 °C预热。将330 μl培养3小时的SK36菌液转移至各管中，在37 °C孵育1小时。以无菌ddH2O代替DNA作为对照。</li>
	<li>将96孔板置于冰上，取100 μl各转化产物涂布于含500 μg/ml卡那霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上。在37 °C微需氧条件下孵育2天。</li>
</ol>
5. 突变体验证与保存
<ol>
	<li>对每个替换突变株，随机挑取2个单菌落，接种至含有500 μg/mL卡那霉素的5 mL BHI培养基中，于37 °C微需氧条件下过夜培养。将每种培养物用30%甘油在-80 °C条件下冷冻保存。</li>
	<li>为检测突变株是否含有预期的基因替换，使用F1和R3引物在96孔PCR板中对每个突变株进行菌落PCR。以单个菌落的约1 μl过夜培养物作为DNA模板，进行25 μl的PCR扩增反应。PCR程序为：94 °C预变性5 min；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30 sec、55 °C退火30 sec、68 °C延伸3.5 min；最后68 °C延伸4 min。</li>
	<li>为了准确鉴定双条带突变体或污染的PCR扩增子，将PCR扩增子进行电泳分析，电泳时间为4小时 &gt;12 cm长的含溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶。在此琼脂糖凝胶电泳条件下，任何长度差异≥100 bp的扩增产物均可被清晰识别。当扩增产生的条带来源于Kmr cassette 与野生型基因的预期差异在于 &lt; 100 bp，使用内部T1引物通过PCR检测是否可扩增出野生型基因。</li>
	<li>为进一步确认该缺失，使用 PureLink 96 PCR 纯化试剂盒纯化扩增产物，并利用结合 Km 的 P1 引物进行测序r 胶卷盒。仅保留经测序确认的正确突变体。</li>
</ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为了尽量减少用外源性抗生素基因替换目标基因时可能对邻近基因产生的极性效应，在初始引物设计过程中采取了两个步骤。对于大多数被删除的基因，引物R1和F3的设计旨在删除从起始密码子后6个碱基开始至终止密码子前30个碱基之间的编码区。保留最后30个碱基对，以保护下游相邻基因可能使用的核糖体结合位点。当两个相邻基因位于相反方向且两种蛋白质的N端彼此靠近时，两基因之间的保留区域扩展至100个碱基对，以避免删除潜在的启动子区域。aphA-3基因的启动子在用于基因删除的重组构建体中被排除5。在aphA-3基因中引入了一个核糖体结合位点以实现翻译。为了验证我们的策略，我们随机构建了10个和随后96个等位交换突变株。在卡那霉素筛选平板上分别获得了10个和93个突变株，表明在大多数情况下，无启动子的aphA-3基因能够良好表达。随后，我们为S. sanguinis基因组中所有基因的删除设计并合成了针对无启动子aphA-3基因的引物。然而，我们发现S. sanguinis中某些基因表达水平较低或不表达，这可能会影响无启动子a...

<table><tbody><tr><td>引物 F2</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>TGACTAACTAGGAGGAATAAATG&lt;br/&gt;GCTAAAATGAGAATAT</td></tr><tr><td>引物 R2</td><td>同上</td><td></td><td>CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA&lt;br/&gt;CAATTCATCCAGT</td></tr><tr><td>引物 F2p</td><td>同上</td><td></td><td>GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td></tr><tr><td>引物 P1</td><td>同上</td><td></td><td>GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td></tr><tr><td>引物 P2</td><td>同上</td><td></td><td>GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td></tr><tr><td>引物 5' 端_R1_seq</td><td>同上</td><td></td><td>GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td></tr><tr><td>引物 5' 端_F3_seq</td><td>同上</td><td></td><td>GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td></tr><tr><td>引物 5' 端_R1p_seq</td><td>同上</td><td></td><td>CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td></tr><tr><td>CSP</td><td>Synprep</td><td></td><td>序列：NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td>Platinum Taq DNA 聚合酶高保真体系</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>R0101S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01185</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>BD Biosciences</td><td>237500</td><td>脑心浸液培养基</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007403</td><td>马血清</td></tr><tr><td>Km</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>卡那霉素</td></tr><tr><td>TH 肉汤</td><td>BD Biosciences</td><td>249240</td><td>Todd Hewitt 肉汤</td></tr><tr><td>PureLink 96</td><td>Invitrogen</td><td>K310096</td><td>PureLink 96 PCR 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>滤器</td><td>Corning</td><td>431117</td><td>0.22 &amp;mu;m 聚苯乙烯滤膜</td></tr><tr><td>Anoxomat 系统</td><td>Mart Microbiology b.v.</td><td>Anoxomat Mark II</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>Sorvall Legend RT Plus 微孔板转子</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>UVP LLC</td><td>BioDoc-It 210</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Labnet's Gel XL</td><td>Labnet</td><td>E0160</td><td>Labnet's Gel XL</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td>Microcentrifuge 5415 R</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040, 4661020</td><td>Finnpipette F1</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td>N805-0200</td><td>GeneAmp PCR 系统 9700</td></tr></tbody></table>

通过高通量 pcr 实现对streptococcus sanguinis的全基因组范围基因敲除

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

转座子诱变和单基因敲除是细菌全基因组基因敲除中采用的两种方法 1,2尽管转座子诱变法耗时较短、成本较低，且无需完整的基因组信息，但该方法存在两个缺陷：（1）混合突变体文库中可能存在不同突变体之间的竞争失衡，导致竞争力下降的突变体被负向筛选；（2）转座子插入可能导致基因部分失活，而非完全丧失功能。单基因缺失分析可在一定程度上弥补转座子诱变法的这些不足。为提高全基因组范围单基因缺失的效率，我们尝试建立一种高通量的全基因组单基因缺失技术，利用 Streptococcus sanguinis 作为一种模式生物。每种基因敲除构建体在 S. sanguinis 基因组设计包含目标基因上游的1-kb区域，该 aphA-3 基因，编码卡那霉素抗性蛋白，以及目标基因下游1 kb的序列。针对每个缺失构建体的这三个组分，分别设计并合成了三组引物F1/R1、F2/R2和F3/R3，并以96孔板形式进行PCR扩增。引物R1和F3包含25 bp的序列，分别与目标区域互补 aphA-3 基因的5'端。大规模PCR扩增 aphA-3 基因仅需操作一次即可构建所有单基因敲除载体。该基因的启动子 aphA-3 基因最初被排除在外，以尽量减少卡那霉素抗性盒可能产生的极性效应。为了构建基因敲除载体，采用96孔板格式进行高通量PCR扩增和纯化。每个基因敲除所用的线性重组PCR扩增片段将通过四轮PCR反应，使用高保真DNA聚合酶制备。初始对数生长期的 S. sanguinis 在添加了2.5%灭活马血清的Todd Hewitt肉汤中培养，以提高对PCR重组构建体转化的感受态。在此条件下，最高可达20%的 S. sanguinis 可使用约 50 ng 的 DNA 进行细胞转化。基于该方法，最终从 2,270 个基因中获得了 2,048 个单基因敲除突变体。 S. sanguinis 排除完全包含在其他开放阅读框内的四个基因的开放阅读框 S. sanguinis SK36 和 218 个潜在必需基因。构建基因缺失载体的技术具有高通量特性，可简便地用于任何可转化细菌的全基因组范围单基因缺失。

使用引物 F1 和 R1 以及 F3 和 R3 进行 PCR 扩增后，分别以 96 孔板形式获得了每个 S. sanguinis 基因上下游约 1 kb 的片段（图 2A）。在本研究的 PCR 条件下，使用设计的引物，每个 PCR 反应均能从 S. sanguinis 基因组 DNA 中扩增出特异性产物。该结果表明，这些引物对 S. sanguinis 的靶标具有高度特异性。通过以三个扩增产物作为 DNA 模板，使用引物 F1 和 R3 进行 PCR 重新扩增，在 96 孔板上高通量地构建了线性重组 PCR 产物（约 3 kb），其结构依次包含每个目标基因上游区域、卡那霉素抗性盒以及每个目标基因下游区域（图 2B）。随后将这些重组 PCR 构建体转化至 S. sanguinis SK36 菌株，并在 BHI 琼脂平板上通过卡那霉素筛选。在大多数转化实验中，经过微需氧条件下 2 天培养后，每块平板可获得超过 1000 个菌落。当使用引物 F1 和 R3 对这些菌落进行 PCR 扩增时，凝胶电泳结果显示...

以Streptococcus sanguinis为模式生物，建立了一种高效的全基因组范围单基因突变方法。该方法通过高通量重组PCR和转化实现。

通过高通量 PCR 实现对Streptococcus sanguinis的全基因组范围基因敲除

转座子诱变和单基因敲除是细菌全基因组基因敲除中应用的两种方法1,2。尽管转座子诱变具有……

本实验的总体目标是通过高通量 PCR 技术在血链球菌中实现全基因组范围的单基因敲除。该目标首先通过高通量 PCR 扩增获得三个扩增片段来实现，包括抗生素抗性基因以及目的基因的上游和下游 DNA 序列。第二步是利用上述三个 PCR 扩增片段作为模板，获得线性重组 PCR 扩增产物。接下来，制备感受态的 s sanguine 细胞。最后一步是将线性重组的 PCR 扩增片段转化入感受态的 s sanguineous 细胞中。最终通过菌落 A 的 PCR 扩增和 DNA 测序来验证正确的突变体。与自杀质粒敲除等传统方法相比，该技术的主要优势在于能够直接通过高通量方法创建全基因组范围的缺失突变体。PCR 引物可根据书面实验方案中所述方法，利用基于缓症链球菌 SK36 基因组序列的内部脚本进行设计和合成。针对目标基因上游一千碱基序列、APH(3')-IIIa 基因（编码卡那霉素抗性蛋白）以及目标基因下游一千碱基序列，分别设计了三组引物用于扩增。基因特异性引物。R1 和 F3 根据目标基因的 5' 端和 3' 端序列设计，用于高通量扩增目标 s sanguine 基因上游或下游 1 千碱基的区域。首先在冰上，于 15 毫升锥形管中配制 PCR 混合液。参见文本，将含有基因组DNA的PCR反应混合物23微升使用多通道移液器加入至96孔PCR板的每个孔中。针对目的基因的上游序列，使用多通道移液器将10微摩尔工作浓度的引物板中的F1和R1引物各1微升分别加入PCR板中。同样地，使用F3和R3引物对目的基因的下游序列进行扩增。密封PCR板，并在94°C下预变性1分钟，随后进行30个循环：94°C变性30秒。54摄氏度下30秒，68摄氏度下1.5分钟。扩增完成后，制备含适量溴化物的1%琼脂糖凝胶，凝胶需具有48孔，适用于多通道移液器加样。取4微升PCR产物与1微升5×DNA上样缓冲液混合。在96孔板上，使用10微升多通道移液器将样品加入琼脂糖凝胶中。以135伏电压电泳运行30分钟。在UVP凝胶成像与分析系统下观察凝胶中的条带。根据生产商提供的说明，使用纯链96 PCR纯化试剂盒通过离心法纯化PCR产物，以洗脱DNA。向结合板的每个孔中加入40微升无菌双蒸水。随机选取板上若干纯化后的扩增子，检测DNA浓度。使用 NanoDrop 分光光度计，将板上扩增产物的浓度调整至约 10 纳克每微升。接着，使用 eco R one 酶切含有卡那霉素抗性基因 gisette 的质粒，使其可作为 PCR 模板。使用 kayak quick PCR 纯化试剂盒纯化酶切后的质粒，并将线性化质粒 DNA 的终浓度调整至 10 纳克每微升。按照书面实验步骤中列出的 F two 和 R two 引物，配制 25 微升的 PCR 反应体系，用于卡那霉素抗性盒片段的扩增。结合本视频，按此处指示进行 PCR 扩增。为检测 PCR 产物，采用 1% 琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析。然后，汇集来自10个PCR纯化个体的大量抗性盒扩增子。将扩增子浓度调整至每微升10纳克。该实验流程中最困难的环节是通过三个PCR扩增子获得最终线性化的、具有转化能力的PCR产物。为确保成功，需将三种PCR引物调整至接近等量。取每种10纳克/微升的PCR引物各一微升，加入一个PCR板中，同时加入PCR模板。然后配制PCR反应混合液，包括书面实验步骤中列出的F1和R3引物。接下来，对样品进行PCR扩增。在PCR扩增产物纯化和定量后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。与之前相同，将重组的PCR扩增产物于-20°C保存。首先，按照本视频附带的书面实验步骤准备Todd Hewitt培养基和马血清培养基，分别取2毫升和10毫升培养基加入两个15毫升的锥形管中。将5微升从-80摄氏度冰箱中取出并解冻的s sanguine SK 36菌种接种至2毫升培养基中。将密封良好的培养物在37摄氏度下过夜培养。在过夜培养后，同样在相同条件下预培养10毫升培养基试管。将50微升培养物转移至10毫升培养基试管中。在37摄氏度下培养该试管3小时。孵育结束后立即向96孔板中的每个eppendorf管加入2微升70纳克/毫升的SK 36感受态刺激肽以及2微升线性重组PCR扩增产物，并在37摄氏度预热。将3小时孵育后的SK 36菌液各330微升转移至每管中。以无菌双蒸水替代DNA作为对照。孵育试管在37摄氏度下反应一小时。将离心管置于冰上，取100微升每种转化产物涂布于含500微克/毫升红霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上，在37摄氏度下微需氧条件下培养两天。对于每个替换突变株，随机挑取两个单菌落，分别接种到5毫升含有500微克/毫升红霉素的BHI培养基中。将每种接种物在37摄氏度下微厌氧条件下过夜培养。将每种培养物用30%甘油在-80摄氏度下冷冻保存。为检测突变株是否含有预期的基因替换，使用F1和R3引物在96孔PCR板中对每个突变株进行菌落PCR。使用每个单菌落的约1微升过夜培养物作为25微升PCR扩增反应中的DNA模板。进行PCR扩增以确认突变基因的替换，从而精确定位双条带突变体或污染性PCR扩增子。通过凝胶电泳对PCR扩增子进行检测，电泳时间不少于4小时，凝胶长度需超过12厘米。在此琼脂糖凝胶电泳条件下，使用含0.2%琼脂糖的凝胶进行溴化乙锭染色。任何长度差异大于或等于100个碱基对的扩增产物均可被清晰识别。 alternatively，当预期由卡那霉素抗性盒和野生型基因扩增产生的条带差异小于100个碱基对时，可使用靶基因内部的T1引物，通过PCR检测是否能够扩增出野生型基因。为进一步确认基因缺失，使用Pure Link 96 PCR纯化试剂盒纯化扩增产物，并利用结合卡那霉素抗性盒的P one引物进行测序。在使用F1与R one引物扩增上游序列、F three与R three引物扩增下游序列的PCR结果经测序验证后，仅保留正确的突变株。每个s. sanguinis基因上下游约一千碱基对的序列在96孔板体系中，根据设计的引物及PCR条件获得。在每次PCR反应中，均从S. sanguineus基因组DNA中扩增出特异性产物，表明引物F1和R3对S. sanguineus靶标具有高度特异性，且以三个扩增产物作为DNA模板进行了PCR再扩增。通过高通量方法构建了线性重组PCR片段。将这些重组PCR片段依次包含各靶基因上游区域、cany抗性盒以及各靶基因下游区域，转入96孔板中，随后将片段转化至S. sanguineus SK36菌株，并在含cany的BHI琼脂平板上进行筛选。在大多数转化实验中，经过微需氧条件下培养两天后，每个平板上均获得超过1000个菌落。当使用引物F1和R3对这些菌落进行PCR扩增时，通过凝胶电泳观察到一条与预期突变体大小相符的单一DNA条带，该结果出现在尝试敲除潜在必需基因的情况下。在尝试敲除某些必需基因时，大多数转化实验中应无法获得菌落。然而，在对这些菌落进行PCR扩增后，仍获得了转化子，琼脂糖凝胶电泳结果显示出现了三条2D DNA条带，其大小分别对应于预期的突变型片段和野生型片段。对于某些突变体，预期的突变型PCR扩增片段与野生型片段大小过于接近，难以通过长胶电泳分离。在此情况下，根据野生型基因序列设计了针对目标基因的内部T1引物。使用内部 T one 引物和 F1 引物进行 PCR。以野生型 SK 36 作为该 PCR 的阳性对照菌株。若使用内部引物从突变株中扩增出预期大小的条带，则判定该基因为必需基因。由于先前已通过使用 P one 引物进行 DNA 测序，确认了突变体中存在卡那霉素抗性盒。根据本方案，共收集了 2048 个非必需的 S. sanguineus 基因突变体。排除了其中四个完全包含在其他开放阅读框内的开放阅读框。在实验条件下，鉴定出218个对s sanguine生存至关重要的基因。观看这些视频后，您应该能够很好地理解如何利用高通量PCR进行全基因组范围的基因分析。

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

全基因组基因缺失<em&gt;链球菌血统</em通过高通量PCR

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

用于构建携带多个基因敲除的酵母菌株的Green Monster流程

来源：Tomás, J. M., 等. 利用空突变体解析细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用。 J. Vis. Exp. (2022)。本视频展示了在E.

在细菌宿主中扩增自杀质粒

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

本论文描述了一种双重数字PCR检测方法，可用于同时定量Enterococcus...

一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

我们介绍一种简便、快速且相对经济的基因敲除Streptococcus...

构建无基因克隆的基因中断型Streptococcus mutans菌株

本文介绍一种利用已有的抗生素抗性盒缺失构建体作为基础，在其他大肠杆菌（E.

通过带有可切除抗生素抗性盒的 P1 转导在 Escherichia coli 中实现基因缺失

本文介绍了一种用于纯化Streptococcus...

Streptococcus mutans 中一种高分子质量蛋白的纯化

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia...

无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

本文描述了构建Aeromonas中特定糖基转移酶或含糖基转移酶区域的空突变株，以及为确定其编码酶在糖链生物合成中的作用和功能、并阐明该糖链在细菌致病性中的作用而开展的运动性测定和鞭毛纯化实验。...

构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

学习利用高通量PCR技术在Streptococcus sanguinis中实现全基因组单基因缺失的方法。该方法通过重组PCR扩增和转化技术，为细菌基因功能研究提供高效工具。

通过高通量 PCR 实现对Streptococcus sanguinis的全基因组范围基因敲除

探索更多视频