通过高通量 PCR 实现对Streptococcus sanguinis的全基因组范围基因敲除

本实验的总体目标是通过高通量 PCR 技术在血链球菌中实现全基因组范围的单基因敲除。该目标首先通过高通量 PCR 扩增获得三个扩增片段来实现，包括抗生素抗性基因以及目的基因的上游和下游 DNA 序列。第二步是利用上述三个 PCR 扩增片段作为模板，获得线性重组 PCR 扩增产物。

接下来，制备感受态的 s sanguine 细胞。最后一步是将线性重组的 PCR 扩增片段转化入感受态的 s sanguineous 细胞中。最终通过菌落 A 的 PCR 扩增和 DNA 测序来验证正确的突变体。

与自杀质粒敲除等传统方法相比，该技术的主要优势在于能够直接通过高通量方法创建全基因组范围的缺失突变体。PCR 引物可根据书面实验方案中所述方法，利用基于缓症链球菌 SK36 基因组序列的内部脚本进行设计和合成。针对目标基因上游一千碱基序列、APH(3')-IIIa 基因（编码卡那霉素抗性蛋白）以及目标基因下游一千碱基序列，分别设计了三组引物用于扩增。

基因特异性引物。R1 和 F3 根据目标基因的 5' 端和 3' 端序列设计，用于高通量扩增目标 s sanguine 基因上游或下游 1 千碱基的区域。首先在冰上，于 15 毫升锥形管中配制 PCR 混合液。

参见文本，将含有基因组DNA的PCR反应混合物23微升使用多通道移液器加入至96孔PCR板的每个孔中。针对目的基因的上游序列，使用多通道移液器将10微摩尔工作浓度的引物板中的F1和R1引物各1微升分别加入PCR板中。同样地，使用F3和R3引物对目的基因的下游序列进行扩增。密封PCR板，并在94°C下预变性1分钟，随后进行30个循环：94°C变性30秒。

54摄氏度下30秒，68摄氏度下1.5分钟。扩增完成后，制备含适量溴化物的1%琼脂糖凝胶，凝胶需具有48孔，适用于多通道移液器加样。取4微升PCR产物与1微升5×DNA上样缓冲液混合。

在96孔板上，使用10微升多通道移液器将样品加入琼脂糖凝胶中。以135伏电压电泳运行30分钟。在UVP凝胶成像与分析系统下观察凝胶中的条带。

根据生产商提供的说明，使用纯链96 PCR纯化试剂盒通过离心法纯化PCR产物，以洗脱DNA。向结合板的每个孔中加入40微升无菌双蒸水。随机选取板上若干纯化后的扩增子，检测DNA浓度。

使用 NanoDrop 分光光度计，将板上扩增产物的浓度调整至约 10 纳克每微升。接着，使用 eco R one 酶切含有卡那霉素抗性基因 gisette 的质粒，使其可作为 PCR 模板。使用 kayak quick PCR 纯化试剂盒纯化酶切后的质粒，并将线性化质粒 DNA 的终浓度调整至 10 纳克每微升。

按照书面实验步骤中列出的 F two 和 R two 引物，配制 25 微升的 PCR 反应体系，用于卡那霉素抗性盒片段的扩增。结合本视频，按此处指示进行 PCR 扩增。为检测 PCR 产物，采用 1% 琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析。

然后，汇集来自10个PCR纯化个体的大量抗性盒扩增子。将扩增子浓度调整至每微升10纳克。该实验流程中最困难的环节是通过三个PCR扩增子获得最终线性化的、具有转化能力的PCR产物。

为确保成功，需将三种PCR引物调整至接近等量。取每种10纳克/微升的PCR引物各一微升，加入一个PCR板中，同时加入PCR模板。然后配制PCR反应混合液，包括书面实验步骤中列出的F1和R3引物。

接下来，对样品进行PCR扩增。在PCR扩增产物纯化和定量后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。与之前相同，将重组的PCR扩增产物于-20°C保存。

首先，按照本视频附带的书面实验步骤准备Todd Hewitt培养基和马血清培养基，分别取2毫升和10毫升培养基加入两个15毫升的锥形管中。将5微升从-80摄氏度冰箱中取出并解冻的s sanguine SK 36菌种接种至2毫升培养基中。将密封良好的培养物在37摄氏度下过夜培养。

在过夜培养后，同样在相同条件下预培养10毫升培养基试管。将50微升培养物转移至10毫升培养基试管中。在37摄氏度下培养该试管3小时。

孵育结束后立即向96孔板中的每个eppendorf管加入2微升70纳克/毫升的SK 36感受态刺激肽以及2微升线性重组PCR扩增产物，并在37摄氏度预热。将3小时孵育后的SK 36菌液各330微升转移至每管中。以无菌双蒸水替代DNA作为对照。

孵育试管在37摄氏度下反应一小时。将离心管置于冰上，取100微升每种转化产物涂布于含500微克/毫升红霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上，在37摄氏度下微需氧条件下培养两天。对于每个替换突变株，随机挑取两个单菌落，分别接种到5毫升含有500微克/毫升红霉素的BHI培养基中。将每种接种物在37摄氏度下微厌氧条件下过夜培养。

将每种培养物用30%甘油在-80摄氏度下冷冻保存。为检测突变株是否含有预期的基因替换，使用F1和R3引物在96孔PCR板中对每个突变株进行菌落PCR。

使用每个单菌落的约1微升过夜培养物作为25微升PCR扩增反应中的DNA模板。进行PCR扩增以确认突变基因的替换，从而精确定位双条带突变体或污染性PCR扩增子。通过凝胶电泳对PCR扩增子进行检测，电泳时间不少于4小时，凝胶长度需超过12厘米。

在此琼脂糖凝胶电泳条件下，使用含0.2%琼脂糖的凝胶进行溴化乙锭染色。任何长度差异大于或等于100个碱基对的扩增产物均可被清晰识别。 alternatively，当预期由卡那霉素抗性盒和野生型基因扩增产生的条带差异小于100个碱基对时，可使用靶基因内部的T1引物，通过PCR检测是否能够扩增出野生型基因。

为进一步确认基因缺失，使用Pure Link 96 PCR纯化试剂盒纯化扩增产物，并利用结合卡那霉素抗性盒的P one引物进行测序。在使用F1与R one引物扩增上游序列、F three与R three引物扩增下游序列的PCR结果经测序验证后，仅保留正确的突变株。每个s. sanguinis基因上下游约一千碱基对的序列在96孔板体系中，根据设计的引物及PCR条件获得。

在每次PCR反应中，均从S. sanguineus基因组DNA中扩增出特异性产物，表明引物F1和R3对S. sanguineus靶标具有高度特异性，且以三个扩增产物作为DNA模板进行了PCR再扩增。通过高通量方法构建了线性重组PCR片段。将这些重组PCR片段依次包含各靶基因上游区域、cany抗性盒以及各靶基因下游区域，转入96孔板中，随后将片段转化至S. sanguineus SK36菌株，并在含cany的BHI琼脂平板上进行筛选。

在大多数转化实验中，经过微需氧条件下培养两天后，每个平板上均获得超过1000个菌落。当使用引物F1和R3对这些菌落进行PCR扩增时，通过凝胶电泳观察到一条与预期突变体大小相符的单一DNA条带，该结果出现在尝试敲除潜在必需基因的情况下。在尝试敲除某些必需基因时，大多数转化实验中应无法获得菌落。

然而，在对这些菌落进行PCR扩增后，仍获得了转化子，琼脂糖凝胶电泳结果显示出现了三条2D DNA条带，其大小分别对应于预期的突变型片段和野生型片段。对于某些突变体，预期的突变型PCR扩增片段与野生型片段大小过于接近，难以通过长胶电泳分离。在此情况下，根据野生型基因序列设计了针对目标基因的内部T1引物。

使用内部 T one 引物和 F1 引物进行 PCR。以野生型 SK 36 作为该 PCR 的阳性对照菌株。若使用内部引物从突变株中扩增出预期大小的条带，则判定该基因为必需基因。

由于先前已通过使用 P one 引物进行 DNA 测序，确认了突变体中存在卡那霉素抗性盒。根据本方案，共收集了 2048 个非必需的 S. sanguineus 基因突变体。排除了其中四个完全包含在其他开放阅读框内的开放阅读框。

在实验条件下，鉴定出218个对s sanguine生存至关重要的基因。观看这些视频后，您应该能够很好地理解如何利用高通量PCR进行全基因组范围的基因分析。