从小鼠心脏中分离原代类似黑色素细胞的细胞

本实验的总体目标是从小鼠心脏中分离出具有活性的心脏类黑色素细胞。首先，从安乐死的小鼠体内取出心脏；第二步，通过酶消化和机械震荡将心脏组织剪碎并解离细胞。

接下来，将细胞悬液进行离心，收集含有心肌细胞和类似黑色素细胞的沉淀物并重新悬浮。最后一步是接种和培养。最终分离得到的心脏类似黑色素细胞可用于膜片钳研究或微阵列分析，以评估在病理生理应激下的细胞兴奋性或转录组状态。

与现有的用于分离和培养心肌细胞的方法相比，该技术的主要优势在于能够分离出大量类似可穿戴心脏黑素细胞的细胞。我们最初是在发现小鼠心脏中存在一种新的细胞群体时，产生了采用此方法的想法，目的是研究其生理特性。首先，准备两套已灭菌的手术器械，一套用于解剖心脏，另一套用于切碎组织。

接下来，准备培养基添加剂，但在接种细胞之前不要将其加入培养基中。在生物安全柜中操作，将配制好的培养基通过滤器灭菌后，于4°C保存。通过将0.05克DNA's one溶解于100毫升含10% FBS和抗生素的DPBS中，配制DNA's one溶液。

接下来，通过将0.5克胰蛋白酶加入含抗生素的100毫升DPBS中，制备0.5%胰蛋白酶溶液。最后，准备好完成该操作所需的其他设备，包括培养皿、50毫升锥形管、40微米细胞滤筛、含抗生素的DPBS、60毫米和35毫米培养皿。在处死P0至P2期新生小鼠后，用酒精擦拭其胸部，并将其置于含DPBS的10厘米P2培养皿中。在体视显微镜下小心打开胸腔，完整取出带有心房的心脏。

用 DPBS 清洗心脏，并将其转移至新的 10 厘米培养皿中。将带有离体心脏的培养皿移入组织培养操作台，并在后续步骤中遵循无菌操作技术。首先，用含抗生素的无菌 DPBS 将心脏清洗三次。

将心脏置于60毫米的培养皿中，并加入6至8毫升0.5%胰蛋白酶溶液。接着，将心脏剪成小块，在37°C下孵育30分钟。孵育完成后，将培养皿中的溶液转移至无菌的10毫升锥形管中。

使用10毫升无菌移液管快速但轻柔地将溶液重悬30至50次，然后通过40微米细胞滤网将所得悬液过滤至一个新的洁净50毫升锥形管中。离心后，小心吸除上清液，并将剩余沉淀物重悬于6至8毫升无菌DPBS中。重复此步骤两次。

离心后第三次洗涤，小心吸除或抽去洗涤液，并将沉淀物重悬于6毫升添加补充物的培养基中。接着，用无菌移液管吸取重悬的细胞悬液，转移至35毫米培养皿中。在过夜孵育后，收集来自三只新生小鼠的分离心肌细胞，吸去培养基及未贴壁的细胞，然后用DPBS洗涤培养皿一次，加入新鲜培养基，并定期更换培养基。

每两天更换一次培养基，从新生或胚胎心脏分离的细胞可在培养条件下维持长达三周，而从成年心脏分离的细胞则可维持长达10天。为了从成年小鼠心脏中分离出类似黑色素细胞的细胞，首先在组织培养超净台中用含有抗生素的无菌DPBS清洗切除的心脏。用弯头解剖镊轻轻挤压心脏以去除残留血液，然后再次用DPBS冲洗心脏。

接下来，从心脏中去除心房和房室环，并将切除的组织样本放入一个35毫米的培养皿中。使用弯头剪刀和镊子将心脏切成小块。向培养皿中加入6至8毫升0.5%胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下孵育45至60分钟。

孵育结束后，重复之前展示的步骤，以获得成年心肌细胞的悬液并进行铺板。在本示例中，白色箭头在两个图中均标示了心肌黑色素细胞。请注意，在缺乏荧光标记的情况下，心肌黑色素细胞很难与附着在培养皿上的心房肌细胞区分；浅蓝色箭头所指为附着不良的心房细胞，如图所示；该细胞为从新生小鼠心脏中分离得到的健康心肌黑色素细胞。

它们具有广泛的树突状突起，并且与皮肤黑色素细胞非常相似。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在数小时内完成。观看本视频后，您应能充分了解如何从心脏中分离出有活力的黑色素细胞。

这将适用于生理学和分子分析。