Name: 文化与偏振刺激人体肠道黏膜植的新方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学习一种在体外培养人体肠道黏膜并模拟体内生理刺激的新方法。该技术通过顶端施加刺激并保持组织极性，可同时分析多达20种条件，用于研究免疫反应和益生菌效应。

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感谢 Erika Mileti 提供出色的技术支持，感谢 Antonio Di Sabatino 博士提供氧气培养箱。
基金：本工作获得了欧盟第七框架计划（IBDase、ERC：Dendroworld）和Fondazione Cariplo向MR提供的资助，以及Marie Curie国际培训流动网络（Cross-Talk，资助协议编号：21553-2）向KT提供的支持。

1. 组织的获取与准备
<ol>
	<li>组织（健康或炎症性肠病黏膜）在手术期间获取。一旦标本被切除，应尽快转移至实验室，并保持其在含钙溶液中++/毫克++含青霉素/链霉素的无钙镁HBSS缓冲液，4 °C或冰上保存。</li>
</ol>
*样本的大小取决于组织的可获得性：所获取的组织部分严格限定为诊断不需要的组织，且在健康个体与炎症性肠病（IBD）患者之间可能存在很大差异。健康组织取自因结肠癌接受手术的患者。
<ol start="2">
	<li>轻轻冲洗组织，清除所有肠系膜物质。在培养皿中使用无菌剪刀和镊子将黏膜层与黏膜下层分离，期间将组织保持在HBSS缓冲液中（不必完全浸没）。尽量减少镊子接触黏膜表面。</li>
	<li>将黏膜切成至少1 cm宽、尽可能长的条状。使用两把无菌手术刀，操作方式类似于切割食物。</li>
	<li>用HBSS轻柔清洗干净的黏膜，并将其展开放置于培养皿中，使顶侧朝上。</li>
</ol>
2. 组织切片的固定
<ol>
	<li>配制新鲜培养基（tisDMEM）。使用添加谷氨酰胺（2 mM）和丙酮酸钠（1 mM）的DMEM，在使用时加入15%北美胎牛血清（FBS-Na）、1% ITS-X 和 200 ng/ml EGF。</li>
	<li>用剩余的FBS-Na填充一个10 cm的培养皿（约使用30 ml，使金属网格完全浸没），并将金属网格浸入其中。保持培养皿敞开，将塑料圆筒支撑在皿盖上。</li>
</ol>
*金属网格由铁制成。网孔为方形，边长为0.5 mm。
<ol start="3">
	<li>用10或20 μl移液器吸取3 μl手术胶。用镊子牢固夹住塑料圆筒，同时小心地将胶水涂抹至其边缘之一。</li>
	<li>轻轻将圆筒放置于黏膜的顶端侧，尽可能靠近组织条的一侧边缘。</li>
	<li>为使胶水有足够时间牢固黏附圆筒与组织，同时准备中心小室的器官培养板：在中心小室中加入850 μl–1 ml培养基，并将金属网格支撑于培养板中心小室的边缘上。</li>
	<li>使用两把无菌手术刀，如前所述，切除圆筒边缘多余的组织。</li>
	<li>轻轻提起附着组织的圆筒，将其基底外侧放置于培养板中心的金属网格上。</li>
</ol>
3. 刺激
<ol>
	<li>使用您选择的刺激物及其适宜浓度。</li>
	<li>将适量体积加至塑料圆筒中心，注意移液枪头不要触碰圆筒或黏膜表面。确保所加液体均匀覆盖圆筒内部表面。推荐加样体积： 
	大号塑料圆筒：200 μl 
	中号塑料圆筒：100 μl 
	小号塑料圆筒：50 μl</li>
	<li>在常规培养箱中孵育，最长不超过 3 小时。</li>
</ol>
*如果希望延长孵育时间，请务必使用更小体积的刺激物（10-20 μl），并将组织直接置于1 Atm压力、100% O2的环境中（参见3.5）。
<ol start="4">
	<li>移除组织顶面的含刺激物培养基，切勿更换新鲜培养基，因为若在顶面保留较厚的液体层，会阻碍气体交换，导致组织无法获得足够的 O2。盖好培养板。</li>
	<li>将组织置于 1 Atm 压力、100% O2 的环境中。</li>
</ol>
4. 收获
<ol>
	<li>总培养时间达 24 小时（± 2.5 小时）后，借助解剖刀轻轻刮除胶水，小心地将圆柱体从组织上移除，并根据所需的分析目的进行保存（如用于免疫组织化学和/或免疫荧光检测则进行固定，或用于 RNA 纯化与基因表达谱分析、蛋白质纯化与 Western blot 检测则在液氮中速冻）。</li>
	<li>收集基底外侧培养基用于细胞因子分泌谱分析。以 8,000 rpm 离心 7 分钟以沉淀碎片，将上清液转移至离心管（或分装），并立即在 -20 °C 下保存。</li>
</ol>
*如果需要长期保存上清液，请将其置于 -80 °C 保存。

<ol><li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li>
<li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?</a> Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).</li>
<li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems%3A+prediction+for+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056(2009).</li>
<li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).</li>
<li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li>
<li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li>
<li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li>
<li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li>
<li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

长期以来，人们一直强调需要建立符合生理相关性的模型，以有效测试人类肠黏膜的治疗方法。许多研究人员已发现，迄今为止用于该目的的细胞模型5和小鼠模型6均存在潜在的人工假象和缺陷。事实上，尽管常常获得有前景的临床前数据，但这些结果却很少能转化为显著的临床获益。
本研究中描述的方法对现有方案7, 8进行了一种相对简单但有效且新颖的改进，可用于极化培养和刺激人肠道黏膜外植体。
该模型可能为在将任何潜在治疗方法推进至临床之前生成有效的临床前数据提供一种极佳的补充途径。因此，有可能避免不利的临床结果9，研究人员可更安全地将治疗方法推进至临床，用于处理急性炎症状况。
该模型的主要优势在于能够比较极化刺激与非极化刺激，并可在24小时时间范围内动态观察组织的反应。一个非常重要的参数是，在每次实验中，不同处理均应用于来自同一患者的组织外植块，从而能够消除患者间的个体差异。由于外植块相对于活检样本具有较大的尺...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Eurocalne</td><td>ECM4006XL</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Lonza</td><td>DE17602E</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12614</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Na</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>100X ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-bio</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>BE17605E</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NaPyr</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>克隆环 6x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>克隆环 8x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-0080</td><td></td></tr><tr><td>克隆环 10x10 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-01010</td><td></td></tr><tr><td>金属网格</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中心井器官培养板</td><td>BD Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>外科胶水（Vetbond）</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>氧气罐</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气瓶</td><td>Air Liquid Sanit&amp;#224;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型的人类肠道黏膜外植体培养与极化刺激方法

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

目前很少有模型能够真实模拟复杂的人类肠道微环境，在该环境中会发生多种相互作用。正常的稳态直接依赖于这些相互作用，因为它们可塑造完整的免疫应答，一方面对食物抗原诱导耐受，另一方面对随食物意外摄入的致病微生物启动有效的免疫反应。
肠道稳态的维持还依赖于微生物群（包括食物相关有益菌株）与宿主之间多种复杂的相互作用，这些相互作用调控着黏液的黏附与降解、上皮屏障产生抗菌肽的过程，以及上皮细胞的“教育”过程，从而控制肠道定居淋巴细胞群体的耐受性或免疫原性表型。迄今为止，使用培养的细胞系或外周血单个核细胞进行的体外实验（in vitro）极难重现这些相互作用。此外，小鼠模型在肠道黏膜的多个组分（如黏液层结构、共生菌群组成）方面与人类肠道存在显著差异。因此，针对肠易激综合征、炎症性肠病或结直肠癌等重要应激相关或病理状况的多种临床治疗方案的研究一直难以开展。
为了解决这些问题，我们开发了一种新型系统，能够以极化方式刺激保留了宿主微生物群和免疫反应在体条件作用的人肠道黏膜外植体。极化的顶端刺激对于所引发的免疫反应结果具有重要意义。已有大量研究表明，相同的刺激物在绕过肠上皮顶端面、从基底侧刺激上皮细胞或直接与固有层组分接触时，可能产生完全不同的反应，导致免疫表型从耐受性转变为免疫激活性，并在局部引发不必要的过度炎症。
我们通过在黏膜顶端表面粘附一个洞穴状圆柱体来实现极化刺激，该圆柱体限定了刺激区域，具体操作将在实验方案中描述。我们利用此模型研究了三种不同乳杆菌（Lactobacilli）菌株的差异性效应。结果表明，该模型系统在评估益生菌于健康与疾病状态下的免疫调节特性方面具有很强的实用性。

我们成功地在体外培养中维持了健康人和炎症性肠病（IBD）患者的肠道黏膜组织健康状态至少24小时，保持了组织的良好活力。根据先前的观察结果1，只有在氧气环境（O2）中进行大部分培养时间（至少占总时间的85%）的情况下，才能实现这一目标，因为在常规培养箱中组织无法存活24小时（图2）。我们还发现，在该模型中，根据刺激的极性（顶端 vs 基底侧）以及刺激物的免疫原性不同，离体组织可表现出不同的反应2,3。
通过本方案，我们发现不同的益生菌菌株可引发组织产生不同的反应。Lactobacillus plantarum NCIMB8826 在健康组织上表现出出人意料的免疫原性。与其他两种 Lactobacilli 菌株相反，它不仅诱导淋巴样细胞向黏膜最表层迁移，还显著上调了与该迁移过程相关的趋化因子 CCL4 以及传统上与促炎活性相关的细胞因子 IL-1b。令人意外的是，尽管我们此前在结肠炎小鼠模型中观察到 L. paracasei<...

我们介绍一种在培养条件下维持人肠道黏膜并监测其对多种刺激反应的新方法，监测时间至少可达24小时。采用本方法可维持组织的极性，从而实现通过顶端途径进行生理性的刺激。

目前尚缺乏能够真实模拟复杂人类肠道微环境的模型，在该环境中存在着多种相互作用。恰当的……

以下实验的总体目标是模拟体内刺激人肠黏膜的情况。通过在组织的顶端侧粘附一个腔室圆筒，防止刺激物与基底侧接触，从而实现这一目标。第二步是施加刺激物，以便分析所引发的免疫反应。接下来，将刺激物从组织的顶端侧移除，以维持其 24 至 36 小时的活性。所获得的结果可显示不同益生菌菌株在免疫组织化学数据、细胞因子分泌、谱型分析等方面的差异性效应。与现有的 ASIC 小室等方法相比，该技术的主要优势在于可同时分析多达 20 种不同条件。该方法可将培养时间延长至36小时，并提供足量材料用于多种检测分析，如DNA-RNA分析、免疫组织化学、细胞因子分泌等。尽管该技术可为益生菌领域提供深入见解，也可应用于其他技术，并用于研究其他免疫调节剂（如生物制剂、抗炎药物等）的作用。健康个体或炎症性肠病患者的肠道黏膜组织必须在手术期间获取。标本切除后，应迅速转移至实验室，并在含青链霉素的HBSS中保持低温。随后，用缓冲液清洗组织，并去除任何肠系膜成分。接下来，使用无菌剪刀和镊子在HBSS缓冲液中将黏膜层与黏膜下层分离。在培养皿中，无需将组织完全浸没，但应尽量减少使用镊子接触黏膜表面。接下来，用两把无菌手术刀以类似切割食物的方式，将黏膜切成至少一厘米宽、尽可能长的条状。切割后，用无钙无镁的 HBSS 轻柔地冲洗并清洗黏膜。最后，将黏膜条平铺于培养皿中，使顶面朝上。首先，配制新鲜的TIS DMEM培养基。接着，向一个10厘米的培养皿中加入约30毫升的F-B-S-N-A，并将铁丝网完全浸入该溶液中。保持培养板敞开，将塑料圆筒放置在培养板上，然后盖上盖子。用移液枪吸取3 µL手术胶，用镊子牢固夹住塑料圆筒，同时小心地将胶水涂抹在圆筒的一侧边缘。接着，在胶水干燥过程中，轻轻地将圆筒置于黏膜顶端一侧，尽可能靠近组织条的一侧边缘。在组织培养板的中心孔中加入 850 至 1000 微升培养基，并将铁丝网架支撑在中心孔的边缘上。使用两把手术刀，切除圆柱形组织边缘多余的组织。现在轻轻提起带有组织的圆柱体，将组织的基底外侧朝下放置在培养板中央的铁丝网架上。接下来，进行组织刺激。在塑料圆柱体中心处加入所需浓度的刺激物。移液器枪头不得触碰圆柱体或黏膜表面，并确保圆柱体内的表面被均匀覆盖。现在将组织孵育最多三小时。使用较少量的刺激液，孵育时间超过三小时也是可行的。孵育结束后，从组织的顶面去除刺激液，但不要更换新鲜培养基。添加培养基会使组织缺氧。现在将氧气瓶充满一个大气压的100%氧气，持续培养24小时。操作氧气罐时务必小心，并确保使用后正确关闭。在24小时刺激培养后，使用手术刀轻轻刮除胶水，小心地将圆柱体从组织上移除。如需进行免疫组化或免疫荧光检测，则对组织进行固定；如需进行基因表达或蛋白质分析，则将组织在液氮中速冻。接下来，收集基底外侧培养基用于细胞因子分泌谱分析。随后，将培养基转移至离心管中，并按照所述方案离心沉淀碎片。健康个体与炎症性肠病（IBD）患者的离体人肠道黏膜组织至少培养24小时，以维持组织的良好状态。只有在至少85%的培养时间处于富氧环境的情况下，这才有可能实现。传统培养的黏膜表现则不如前者。随后，使用促炎性侵袭性沙门氏菌刺激健康组织。接种后两小时，与对照组相比，上皮表层的破坏已清晰可见。24小时后，变性范围变得相当广泛。有关实验应用及已发表结果的进一步讨论见其后续发表的书面论文。该技术为胃肠病学领域的研究人员提供了研究胃肠道内宿主与微生物相互作用的新途径。观看本视频后，您应能充分理解如何将人肠道黏膜进行体外培养并实施局部刺激。请务必注意，处理人体样本可能具有极高危险性，因此在进行该操作时必须始终采取必要的安全防护措施。

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科研

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Biology

生物学

文化与偏振刺激人体肠道黏膜植的新方法

来源：In, J. G.,等. 利用人类结肠类器官单层培养研究病原体、共生菌与宿主肠上皮之间的相互作用. J. Vis. Exp.

生成具有屏障功能的人类结肠类器官单层以研究宿主-病原体相互作用

在本视频中，我们介绍了建立一个 离体 用于研究小鼠肠组织片段与特定肠道细菌相互作用的肠道器官培养系统。该装置包含两对进出液端口，第一对连接肠组织管腔并将其与特定细菌悬液相连，第二对持续向装置的孔中供给培养基以维持 离体...

一种用于研究宿主-微生物群相互作用的离体肠道器官培养系统

我们介绍了一种从手术组织和活检样本中获取的小肠隐窝和结肠隐窝建立人类肠类器官和结肠类器官的方法。在这篇方法学文章中，我们介绍了成功培养和维持人类肠类器官与结肠类器官所必需的培养模式。...

从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

在肠道芯片微流控装置中将活性微生物组与微工程化人肠绒毛共培养

本方案描述了小鼠小肠混合细胞的分离与培养方法。这些原代肠道细胞培养物可用于通过多种技术研究介导肠肽分泌的信号通路。...

用于研究肠道激素分泌及肠内分泌细胞活体成像的小鼠小肠混合原代培养

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

本方案描述了如何诱导人干细胞来源的回肠单层细胞中M细胞的分化，并介绍了评估其发育的方法。...

人干细胞来源的回肠类肠体单层中M样细胞的诱导分化

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

该研究提出了一种方法 体外 细菌感染的研究 利用组织干细胞来源的肠道类器官。该方案描述了如何在二维条件下培养和分化类器官，并用黏附侵袭性...

利用侵袭素或基底膜提取物进行二维类器官培养以研究宿主-细菌相互作用

学习一种在体外培养人体肠道黏膜并模拟体内生理刺激的新方法。该技术通过顶端施加刺激并保持组织极性，可同时分析多达20种条件，用于研究免疫反应和益生菌效应。

一种新型的人类肠道黏膜外植体培养与极化刺激方法

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