鸣禽听觉刺激下的功能性磁共振成像（fMRI）

本实验的总体目标是展示一种优化的方案，用于在鸣禽大脑的听觉和鸣唱控制区域中成功可视化声音感知与处理过程。通过功能磁共振成像（fMRI）实现这一目标，首先需制备高质量的听觉刺激材料，并将其纳入开-关区块实验设计中，以便在功能磁共振成像（fMRI）扫描期间向鸟类呈现。第二步是为扫描做准备：先将鸟类麻醉，然后将其置于特制的动物承载床上，再将承载床放入MRI扫描仪的孔腔内。随后可在听觉刺激过程中采集fMRI图像。

最后一步是预处理所获取的MRI数据，包括将图像标准化至斑胸草雀图谱。最终通过基于体素的统计分析，实现对所得结果的可视化，并定位听觉刺激所诱导的脑部激活区域。相较于在太阳鸟研究中更常用的一些其他方法（如电生理学、组织学和分子定位技术），该技术的主要优势在于，fMRI是一种非侵入性的活体方法，可对同一受试个体进行纵向研究，并能一次性对全脑进行无先验假设的分析，无需预先确定参与特定神经过程的神经结构位置。

初次使用该方法的研究者可能会遇到困难，因为在鸟类中实施功能磁共振成像与在人类或啮齿类动物中使用该方法存在显著差异，且挑战性大得多。这不仅是因为这些鸟类的大脑体积较小，还因为它们的颅骨包含大量含气腔隙，容易引发磁化率伪影。通过采用对这类伪影敏感性低于梯度回波序列的自旋回波序列，我们能够以很高的空间特异性实现鸣禽全脑的功能成像。此外，扫描仪的孔径空间狭小，可能对听觉刺激产生畸变。

因此，为了开始本方案的准备工作，需使用光纤麦克风在七特斯拉磁共振系统的孔洞内播放声音刺激时同步记录声音信号，并验证所用磁共振系统引起的声音失真情况。此处可见，在磁体孔洞内鸟类头部位置记录的白噪声与扫描仪外部记录的白噪声相比，某些频率成分被增强或抑制。为补偿这种人为增强效应，需使用Wave Lab软件对每个刺激信号应用均衡器函数，以校正上述设置中的频率响应。

在此方案中，函数由一个包含屏幕上所示参数的高斯核组成。此处，鸣禽声音刺激应由特定鸟类的多个独立鸣唱动机组成，这些动机之间穿插着静音时段；需调整这些静音时段的持续时间，以确保所有刺激中声音与静音的总量保持一致。每个刺激的总时长为16秒，对应于两幅功能性磁共振成像（fMRI）图像的采集时间。

使用预处理软件对每首歌曲的强度进行归一化处理，使其均方根值一致，并在400赫兹处应用高通滤波器，然后将其整合到完整的刺激序列中。实验可使用呈现软件设计，采用开-关区组设计，交替呈现听觉刺激期与静息期。每个区组持续16秒，对应于两幅图像的采集时间，每种刺激类型呈现25次，从而在每位受试者中针对每种刺激采集50幅图像。

不同被试内部及被试之间的条件呈现顺序应随机化。同时设置实验范式，使其能够接收来自扫描仪的触发信号。这可以确保在fMRI序列的每次重复扫描过程中，扫描软件都会向听觉呈现软件发送一个触发信号，后者随之记录扫描编号并执行相应的指令。

本文介绍了一种专门针对成年斑马雀的实验方案。斑马雀应在12小时光照、12小时黑暗的光周期条件下饲养于鸟舍中，并在整个研究期间可随时获取食物和饮水。每次实验所需的最少个体数量为15只。

该样本量考虑了自旋回波功能磁共振成像（fMRI）的敏感性以及实验中所测量生物学现象的自然个体间变异性。实验准备时，首先使用塑料管将喙部面罩连接至气体控制器设备，并将其安装在7 T磁共振系统（MR系统）的磁共振成像床（MRI床）上。打开氧气和氮气钢瓶，并启动气体控制器设备。

接着打开反馈控制的系统和热空气流动装置。然后，通过将斑胸草雀的喙部引入面罩并固定其头部，使用氧气和氮气混合气体中的 3% 异氟烷对其进行麻醉，直至鸟类完全麻醉。可通过轻轻拉扯脚掌来确认麻醉状态。

当鸟类完全镇静后，其足部将不再回缩，同时眼睛会闭合。在整个实验过程中，插入泄殖腔温度探针以监测体温，并将气动传感器置于腹部下方以监测呼吸频率。

然后在整个实验过程中使用外套固定鸟类的身体。将呼吸频率维持在每分钟40至100次之间，并保持体温恒定在40摄氏度。如果呼吸频率过低或过高，应相应调整麻醉深度。

如果问题仍然存在，应停止实验并将动物从装置中移出。为了恢复，将非磁性动态扬声器放置在斑胸草雀头部两侧，并将其连接至放大器。确保扬声器的导线远离温度探针，因为这可能会影响温度读数。

当距离过近时，将表面射频线圈放置在斑胸草雀头部上方。然后将斑胸草雀置于磁体中心。最后，在扫描前将麻醉水平降低至1.5%异氟烷。

开始扫描时，首先确定大脑在磁体中的位置。在矢状面、水平面和冠状面各获取一组单层梯度回波定位图像，以及后续用于功能扫描定位的多层定位图像。然后通过将梯度上升时间增加至1000微秒，以降低梯度噪声。

接下来，准备一个快速采集弛豫增强序列，即罕见的T2加权fMRI序列。然后设定覆盖几乎整个大脑的15个矢状面切片。现在在呈现软件中选择听觉实验协议，以确保听觉呈现软件不会遗漏扫描仪发出的任何触发信号。

首先启动听觉实验方案。待方案完全加载后，再开始 FMRI 序列。每次 FMRI 实验开始前，应先采集 10 张虚拟图像，以使信号在开始听觉刺激前达到稳态。

采集完成后归零。将数据填充至 64×64，以初步查看结果来评估数据质量。使用功能工具。

在 ParaVision 软件中，计算所有“开启”区段与基线之间的差异性 BOLD 反应。如果在初级听觉区域未观察到激活，则表明鸟类可能由于技术问题或麻醉水平的原因未能听到或处理听觉刺激。应验证实验装置并重复测量。

功能像采集完成后，在与先前的 FMRI 扫描相同的方向上运行一个解剖学 3D rare T 二权重序列。然后将该数据零填充至 256 × 256 × 256。

最后将斑马雀从MRI检查床上移开，并将其置于装有加热灯的笼子中，使其从麻醉状态中恢复。通常情况下，斑马雀从异氟烷麻醉中恢复所需时间不到五分钟。数分钟后，鸟类会尝试站立，一旦完全恢复，它将不再坐在笼底，而是停栖在树枝上，此时可开始数据处理。

首先，将MR数据转换为Analyze或NIfTI格式。然后在SPM中开始数据处理之前，需要通过将体素尺寸乘以10来调整鸣禽fMRI数据。由于fMRI分析软件是为处理人类fMRI数据而开发的，因此最简单的方法是使用MRI Cropper软件人为增大鸟类fMRI数据的体素尺寸。

请注意，此调整不会影响数据本身，不会对数据进行重新采样或任何其他修改。接下来，对获取的数据进行预处理。

使用 SPM 时，首先对 FMRI 数据进行八次初步重对齐，并将解剖学 3D 数据集与 FMRI 时间序列进行共配准。然后将 3D 数据和已共配准的 FMRI 时间序列归一化至斑胸草雀脑 MRI 图谱。

将变换矩阵应用于FMRI数据集，并使用0.5毫米高斯核对数据进行平滑处理。然后在SPM 8中进行基于体素的统计分析，首先在个体鸟类水平上进行分析，随后进行组水平分析。最后，为了可视化结果并定位功能激活区域，将统计参数图投射到斑胸草雀图谱、高分辨率3D斑胸草雀脑图谱上。本实验在生物成像实验室设计了所述斑胸草雀FMRI结果分析所使用的立体定位坐标，即MRI图谱数据集。

脑区划分和核团划分可通过此处所示网站免费获取。此处展示的是左半球三维重建的侧视图，图中将图谱中的结构划分投影在其正中矢状切面上。我们可以看到，在不同听觉刺激下，初级听觉区域L区及邻近的次级听觉区域相对于静息状态所诱发的fMRI BOLD反应示例。

T 值根据图中显示的色标进行颜色编码，仅显示 T 检验结果具有显著性的体素。这是斑马雀功能性磁共振成像（FMRI）实验的另一个示例。图像显示了鸟类自身鸣唱在脑区 XMLD 和 HVC 区域的选择性反应。

图像下方的数字表示距中线的毫米坐标。正值表示切片和统计结果来自右半球。本视频中描述的方案可轻松适用于其他鸣禽，如八哥。

这是此类功能性磁共振成像实验结果的一个示例。在欧洲椋鸟中，该图显示了同一鸟类个体在不同季节下，听觉刺激相对于静息状态所诱发的脑区激活。在鸣禽中实施并优化功能磁共振成像技术，为鸣禽研究领域开辟了新的研究方向。

已有研究表明，该技术对于分析这些动物模型中发声交流所涉及的复杂感觉运动和认知过程是一种有价值的实验手段。此外，由于其具有非侵入性和全脑成像的优势，功能磁共振成像（fMRI）可作为补充方法，用于辅助更为常见的局部性和侵入性研究手段。在太阳鸟中不断增多的fMRI实验数量，证明了该技术在认知研究问题上的适用性；未来应进一步努力拓展MRI实验的应用范围，超越听觉处理这一在麻醉状态下仍保持活跃的过程，转向对清醒状态下经训练适应成像方案的受试动物的研究。

这可能会为鸟类积极参与电磁干扰实验并能实验性地控制其注意力的研究提供新的可能性。