Name: 外科技术治疗脊髓交付:在哥廷根小型猪演示程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习脊髓靶向给药的外科技术，通过椎板切除术和脊髓支架在哥廷根小型猪模型中实现精准安全的生物治疗剂递送。该方法可转化应用于临床神经疾病治疗。

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感谢埃默里大学动物资源部门工作人员提供的兽医护理。资助来源包括：肌萎缩侧索硬化症协会、美国国防部以及Neuralstem公司。

1. 动物使用
本文所展示的操作步骤已获得埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验使用体重约为15-20 kg的雌性哥廷根小型猪。
2. 麻醉
动物在手术前约12小时开始禁食。动物镇静和麻醉诱导采用肌内注射混合药物，包括氯胺酮（35 mg/kg）、乙酰丙嗪（1.1 mg/kg）和阿托品（0.04 mg/kg）。随后对动物进行气管插管，并通过氧气和1-3%异氟烷维持全身麻醉。此时，需剃除每只动物的背部和头部毛发。麻醉深度由兽医人员进行监测，监测指标包括趾间反射、角膜反射和眼睑反射的消失情况，以及心率、呼吸频率、脉搏血氧饱和度、直接/间接血压、呼气末二氧化碳浓度测定，以及肌张力和对有害刺激的反应。
3. 定位
将动物带入手术室，并置于特制的框架上，使其呈俯卧位，该框架的设计旨在模拟患者在Jackson脊柱手术台上的体位。框架采用可调节的吊带，置于动物胸部和骨盆下方，使腹部自然下垂，从而减少对腹部和胸部的压力，避免硬膜外静脉出血（图1）。该框架还可为手术过程提供脊柱的外部固定 1。
此外，将动物置于加热循环垫上以维持体温，并对耳缘静脉进行插管，用于术中输液及必要时给药。最后，使用酒精和氯己定或聚维酮碘溶液对手术区域进行消毒，并在手术区域覆盖手术巾。
4. 椎板切除术
进行长约10-15 cm的皮肤切口，双侧剥离椎旁肌群。接着实施后路多节段椎板切除术。使用咬骨钳和手术钻切除覆盖C3-C5或L2-L4节段的三个椎骨的椎板和棘突。
5. 脊柱支架的放置
我们将Spinal Derrick称为一种用于向脊髓递送（基因和细胞）治疗药物的装置2-5。有关该装置设计与演化的详细讨论，可参见Riley et al., 20114。
为了将装置固定在患者身上，需在主要切口上下方的皮肤上做1 cm的切口，将经皮固定柱穿过这些切口，并连接到主要切口上下方的椎板上。
接下来，将两个一体化牵开器连接到切口部位上下方的四个经皮固定杆上，以暴露已进行椎板切除术的脊柱区域。
6. 硬脑膜切开
借助Woodson牙科器械和11号刀片，通过硬脑膜做一个2.5 cm的切口，暴露脊髓。使用4-0 Nurolon缝线将硬脑膜从软脑膜层剥离，并固定于深部椎旁肌组织上。
将手术棉片放置于切口的头端和尾端。这些棉片可部分阻隔脑脊液流动，同时为外科医生提供一个安全的目标位置，以便放置吸引器而不损伤脊髓。在人类手术中，会在手术显微镜放大下分离软脑膜表面。但由于技术限制，该步骤在动物实验中既不需要也不可行。
7. 脊髓注射及脊髓井架侧向移位以进行额外注射
注射前立即给予甲基泼尼松龙（125 mg，静脉注射）以防止脊髓肿胀。
此时，平台导轨系统已安装到位，侧轨已调节至合适的长度。吊舱 将载物端装载到两个横杆上，Z轴驱动装置安装在万向节上。接着，将装载好的套管放置到微型驱动装置上。利用显微注射平台上的万向节，调节冠状面和矢状面角度，以确保注射轨迹垂直于脊髓表面。套管定位完成后进行注射。针头应准确定位于背根进入区（DREZ）内侧。在3.5倍手术放大镜下识别DREZ，并沿垂直于脊髓表面的轨迹，在某一位置刺入脊髓 &lt;向内侧1毫米。
在人体中，术前磁共振成像（MRI）可为手术规划提供脊髓尺寸的基线评估。此外，通过测量脊髓的厚度来确定腹角的目标深度。
悬液在软脑膜接触点下方4 mm深度处注入。由聚醚酰亚胺塑料制成的法兰盘作为软脑膜表面的限位器，防止针头插入过深。当针尖到达目标位置后，将刚性金属外鞘向上回拉，使柔性导管暴露。注射完成后，针头需在原位保留额外1分钟，以防止细胞沿套管注射通道反流。
通过轻微调整微驱动装置的内外侧或头尾方向，以避免损伤表面血管。穿刺部位可能会出现一些出血。当遇到此类出血时，将微型棉片置于出血的穿刺点上，并对其施加吸引，以吸出导管穿刺部位的血液，防止血液在脊髓内积聚。这种方法可有效促使血液凝固。应避免使用电灼或直接压迫止血。
拔出针头后，将立体定位装置沿头尾轴移动至下一个目标位点，位点之间相距2或4毫米，或根据需要调整距离，以避开脊髓背侧表面可见的血管。该过程将根据具体研究方案的要求重复进行多次。
8. 漂浮导管
使用特制的细径输注套管进行注射。该套管由固定长度的30号斜面针头连接一段长度可变的30号柔性硅胶管组成。远端配有Hamilton鲁尔锁接头，可连接至微注射泵。近端的硅胶管被套入一根24号刚性外层套管内，外层套管固定在注射针头近端的法兰上。该法兰既用于固定外层套管，又作为注射针头插入深度的限位装置。每次注射时，使用已预先校准的MINJ-PD微注射泵（Tritech Research, Inc.，美国洛杉矶，加利福尼亚州），以每分钟5 μl的速度注入适当体积的治疗悬液。
9. 结束
完成所有注射后，轻柔地移除脊柱吊架，并将切口分四层闭合。使用4.0号Nurolon缝线以水密方式缝合硬脊膜。深层肌肉层采用0号Vicryl缝线缝合。筋膜层也使用0号Vicryl缝线以水密方式闭合。真皮层最后用2.0号Vicryl缝线行连续缝合。皮肤闭合使用3-0 Nylon缝线完成。
10. 恢复与疼痛管理
动物在麻醉恢复后拔管，并监测2小时。随后将动物转移至单独的笼子中，每天至少监测一次食物摄入、排便和排尿情况。
为进行疼痛管理，将芬太尼透皮贴剂（75 mcg）钉在动物背部，以提供术后三天的镇痛作用。此外，术后最多还可给予丁丙诺啡（0.05 mg/kg，每日两次，肌内注射）三天。
11. 结果与代表性结果
术前进行临床和行为观察，之后根据研究设计在术后第1至第7天每天记录，此后每周记录一次，直至实验终点。行为学数据用于评估神经功能障碍，方法如前所述6。感觉功能通过前肢和后肢脚趾对机械刺激是否产生回缩反应来评估。运动功能采用Tarlov评分（表1）进行评价：0分——瘫痪，无任何活动；1分——后肢可感知肌张力，有轻微活动；2分——后肢可活动，但无法坐起或站立；3分——能够站立和行走，但共济失调，且持续时间较短；4分——完全恢复，运动功能正常。
手术安全性的评估依据是动物能否恢复至术前基线状态。短暂性神经功能缺损通常应在术后第1天至第7天之间基本恢复，具体恢复情况可能因动物品系及手术操作（如注射次数等参数）不同而有所差异。永久性病态的定义为持续存在的神经功能缺损，且在动物达到IACUC规定的默认实验终点时仍未恢复（图2）。

<ol><li>Usvald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dosing+regimen+and+reproducibility+of+intraspinal+grafting+of+human+spinal+stem+cells+in+immunosuppressed+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs.</a> Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+spinal+cord+therapeutics+delivery%3A+stabilized+platform+and+microelectrode+recording+guidance+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Stereotact.+Funct.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation.</a> Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).</li>
<li>Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+viral+vector+direct+injection+approach+to+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).</li>
<li>Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+and+Cannula+Design+Improvements+for+Spinal+Cord+Therapeutics+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery.</a> Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+spinal+cord+therapeutics+delivery%3A+preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+microinjection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform.</a> Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).</li>
<li>Raore, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+multilevel+intraspinal+stem+cell+therapy%3A+assessment+of+surgical+risks+in+Gottingen+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs.</a> Spine. 36, 164-171 (2011).</li>
<li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+stem+cell+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat. Rev. Neurol. , (2011).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+Stem+Cell+Transplantation+in+ALS%3A+A+Phase+I+Safety+Trial%2C+Technical+Note+%26+Interim+Safety+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes.</a> Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).</li>
<li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+intraspinal+injection+of+neural+stem+cells+in+patients+with+ALS%3A+results+of+a+Phase+I+trial+in+12+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients.</a> Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).</li>
</ol>

Boulis 博士是用于实现安全、准确地向人脊髓注射的装置的发明者。Neuralstem 公司已获得该技术的独家授权。Boulis 博士获得了该项费用的发明人份额，并拥有该技术分发所产生的特许权使用费收益权利。其他作者无任何利益冲突需要披露。

尽管所述技术已获准在人体中应用7-9，但要使脊髓治疗取得成功，仍有一些关键问题有待解答。必须对脊髓实质内注射的耐受性进行系统深入的理解，才能规划和实施针对脱髓鞘性、退行性及创伤性脊髓疾病治疗的临床试验。目前，对于大型哺乳动物脊髓在不引起暂时性或永久性病损的前提下可耐受的注射次数，尚无明确认识。同样，注射位点之间的间距也可能影响病损的发生。此外，在注射过程中，宏观（例如，与通气相关或患者无意的移动）和微观（即，伴随通气和心搏产生的振荡）的脊髓运动均可能对脊髓造成风险。明确大型动物模型中发生病损的阈值，将有助于所有脊髓治疗项目的剂量计算。我们的转化型脊髓移植实验室可为当前所有正在设计脊髓治疗临床试验的团队提供临床前研发支持。

<table><tbody><tr><td>脊柱牵引器 </td><td>Neuralstem, Inc.</td><td></td><td>Neuralstem, Inc. 已获得该技术的独家授权 </td></tr><tr><td>MINJ-PD 微量注射泵</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td></td><td>为此特定应用定制 </td></tr><tr><td>浮动套管</td><td>Neuralstem, Inc.</td><td></td><td>为此特定应用专门设计</td></tr></tbody></table>

脊髓给药治疗的外科技术：在哥廷根小型猪中进行手术操作的示范

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

本文提供了一种将基因和细胞疗法递送至脊髓的外科技术与装置组合的紧凑可视化描述。尽管该技术是在动物身上进行演示，但该手术程序已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，目前正用于肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者脊髓内的干细胞移植。尽管FDA已认可在特征明确的啮齿类动物模型中获得的治疗有效性的原理验证数据，但使用大型动物仍被视为验证外科手术、装置以及最终疗法在人体应用中安全性的关键环节。猪的脊柱和脊髓在尺寸、解剖结构以及总体脆弱性方面被公认为更接近人类。此外，在猪身上进行暴露和操作脊髓以及关闭切口的外科过程与人类几乎无法区分。我们认为，健康的猪模型代表了评估操作安全性的关键第一步。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Tarlov 评分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>瘫痪，无任何活动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>后肢可感知肌张力，有轻微活动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>后肢可活动，但无法坐立或站立</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>能够站立和行走，但共济失调且持续时间短暂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>完全恢复，运动功能正常</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. Tarlov 评分。通过评分动物的运动功能来评估神经功能障碍及恢复情况。</...

简要的视觉描述，介绍用于将（基因和细胞）疗法递送至脊髓的外科技术及装置。该技术已在动物模型中得到演示，具有完全的可转化性，目前正应用于人类临床。

这是一种紧凑的可视化描述，展示了一种外科手术技术与装置的结合，用于将（基因与细胞）治疗递送至脊髓……

本实验的总体目标是安全递送生物治疗剂，并精确靶向脊髓内特定的实质区域。首先需进行动物术前准备，随后实施椎板切除术并组装脊柱固定装置。然后打开硬脑膜并进行脊髓内注射。最后，缝合硬脑膜、肌肉、筋膜和皮肤。最终，可通过采集行为学和靶向数据，获得显示安全性和靶向效果的结果。本文所述的技术涉及使用稳定平台以及柔性套管将生物有效载荷递送至脊髓。该方法的优势在于能够实现精准递送，可替代传统的立体定向技术——后者由于脊髓具有活动性，难以在脊髓区域应用。除了精准性之外，该技术还提供了安全余量，即使患者发生移动，也能确保操作安全。在此情况下，由于固定平台的作用以及呼吸和心跳过程中脊髓在椎管内的移动不会因套管的柔韧性而进一步损伤脊髓，因此不会造成脊髓损伤。在对迷你猪禁食12小时后，通过肌肉注射氯胺酮、ace、丙嗪和阿托品进行镇静，随后对动物进行气管插管，并以氧气和1%至3%的异氟烷维持麻醉。按照书面方案中所述方法监测麻醉深度。剪除动物背部和头部的毛发。将已镇静的动物转运至手术室，并将其俯卧位固定于定制框架上，以模拟在Jackson脊柱手术台上的体位。该框架采用可调节的吊带，置于动物胸部和骨盆下方，使腹部自然下垂，从而减少对腹腔和胸腔的压力，避免硬膜外静脉出血。该固定架还可提供脊柱的外部固定。进行操作时，将动物放置在加热循环垫上，以维持其体温。随后，在耳缘静脉插入导管，用于术中输液和给药。然后用酒精和氯己定或碘伏溶液准备手术区域，并在手术区域铺置手术巾。做一条10至15厘米的皮肤切口，使用单极电刀双侧剥离椎旁肌。接着，使用罗恩凿子和手术钻开始进行后侧多节段椎板切除术，切除棘突，并对覆盖C3至C5或L2至L4节段的椎骨进行椎板切开术。脊柱固定架是一种用于将基因和细胞治疗递送至脊髓的装置。为将该装置固定于患者体内，需在主切口上下方各做一厘米长的皮肤切口。通过切口置入经皮固定柱，并将其安装至椎板，以暴露所需的脊髓区域并完成椎板切除术。插入集成的牵开叶片，并将其连接至固定架上。在牵拉棘突的同时将组织回缩。剪除棘间韧带和黄韧带，完成椎板切除术。套管由一根30号针头连接30号塑料管构成，外覆两层金属鞘，其中外层为可移动鞘，内层为固定鞘。使用连接至微注射泵的 Hamilton 注射器锁，将外径为 24 号的外层套管安装在注射针的近端法兰和鞘上，近端用于暴露脊髓。首先，注射一次甲基泼尼松龙推注剂量。然后小心操作以分离硬脊膜，使其脱离脊髓。使用Woodson牙科器械和11号刀片穿过硬脑膜做一个2.5厘米的切口。然后使用4-0尼龙缝线将硬脑膜从剥离层反射并固定到深部脊旁肌上。在脊髓周围放置外科棉片。然后，先将平台导轨系统从顶部安装，将吊篮装载到两根导轨上，并将Z轴驱动装置安装到万向节上。接着，将装有样品的套管置于微驱动装置上，利用微注射平台上的万向节调节冠状面和矢状面角度，以确保注射轨迹垂直于脊髓表面，且与套管的放置位置一致。随后，将针头置于背根进入区（dres）内侧，上提刚性金属外鞘，使柔性导管暴露出来。使用预先校准的微量注射泵向目标位点注射。然后将针头留置原位额外一分钟，以防止细胞回流至套管注射轨迹中。拔出针头后，将立体定位装置移至下一个目标位点，沿头侧-尾侧轴移动2至4毫米，避开脊髓背侧表面可见的血管。轻柔地移除脊柱牵开器后，Derrick 使用 4-0 神经缝线以水密方式缝合硬脊膜。用 Vicryl 缝线关闭深层肌肉层和筋膜层后，在麻醉恢复后使用 3-0 尼龙缝线缝合皮肤，拔管，并监测动物两小时。术后镇痛方面，将透皮芬太尼贴剂固定于动物背部，持续三天。必要时，术后可给予布托啡诺治疗最多三天。然后将动物转移至单独的笼子中，并至少每天监测一次。通过采集食物摄入量、排便及微量营养素相关行为学数据，以评估神经系统的发病情况。如前所述，手术的安全性由动物恢复至术前基线状态的能力来确定。短暂性神经功能缺损通常应在术后第1天至第7天之间基本消退，具体恢复时间可能因品种和手术方式而有所不同。永久性并发症的定义为持续存在的神经功能缺损，在动物达到IACUC默认实验终点时仍未恢复。其他方法（如免疫化学）可用于确定重要的数据，例如细胞的活力、细胞的迁移情况以及注射的准确性。

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