Name: 解剖，文化与分析非洲爪蟾胚胎视网膜组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学习非洲爪蟾视网膜组织解剖、细胞培养与钙成像技术，用于研究发育生物学和神经生物学中的细胞生理活动。该方法结合共聚焦显微镜实现单细胞水平的基因表达分析。

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我们衷心感谢 John Hayes 博士提供脚本；感谢 Eric Bradley 博士和 Christopher Del Negro 博士在共聚焦显微镜方面的协助；感谢 Drew Hughes、Laura Odorizzi、Alex Garafalo、Rebecca Lowden 和 Liz MacMurray 在项目开发和提供初步数据方面的工作；感谢 Greg Smith 博士在统计分析方面的有益建议。本研究得到了美国国立卫生研究院资助（NINDS IR15N5067566-01，授予 MSS）以及霍华德·休斯医学研究所向威廉与玛丽学院提供的科学教育资助的支持。

所有实验均按照威廉与玛丽学院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。本方案中提及的发育阶段依据 Nieuwkoop 和 Faber46 的标准。
1. 解剖
<ol>
 <li>将细胞培养基和无钙镁溶液（CMF）平衡至室温。同时准备 pH 7.4–7.6 的 0.1X Marc's 改良林格液（MMR）。</li>
 <li>在细胞培养超净工作台内使用紫外灯照射以下物品 30 分钟进行灭菌（放置于工作台前，需先用 70% 乙醇喷洒每件物品）：
 <ul>
 <li>35 mm 塑料培养皿。</li>
 <li>60 mm 塑料培养皿。</li>
 <li>35 mm Nunclon 表面培养皿。</li>
 <li>1.5 ml 微离心管。</li>
 <li>p1000 移液器（1,000 μl 移液器）。</li>
 <li>防气溶胶 p1000 吸头（1,000 μl 移液器防气溶胶吸头）。</li>
 <li>耐酒精记号笔。</li>
 <li>精细解剖镊。</li>
 <li>*15 ml 锥形管（仅用于钙活性成像）。</li>
 <li>*仅用于钙活性成像。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>待超净台完成紫外灭菌且溶液已平衡至室温后，开启超净台层流，用 70% 乙醇喷洒手套和培养基瓶，然后将培养基瓶放入超净台内。</li>
 <li>在超净台内，使用 p1000 移液器为每块细胞培养板准备以下物品，并确保正确标记：
 <ul>
 <li>一个含 10 ml 细胞培养基的 60 mm 塑料培养皿——解剖板。</li>
 <li>一个含 2 ml 细胞培养基的 35 mm Nunclon 表面培养皿——培养板（Nunclon 塑料培养皿无需额外添加黏附剂处理）。</li>
 <li>一个空的 1.5 ml 微离心管——外植体消化管。</li>
 <li>*一个含 15 ml 细胞培养基的 15 ml 锥形 Falcon 管，用于在钙活性成像时洗去多余的 Fluo4-AM。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>在超净台内，使用 p1000 移液器为每次解剖操作准备以下物品（单次操作可解剖多个视网膜）：
 <ul>
 <li>一个含 2 ml CMF 的 35 mm 塑料培养皿——外植体清洗板。</li>
 <li>一个含 2 ml CMF 的 35 mm 塑料培养皿——外植体消化板。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>在超净台外准备以下物品：
 <ul>
 <li>每块细胞培养板对应一个含 10 ml 0.1X MMR 的 60 mm 塑料培养皿——暂存板。</li>
 <li>每块细胞培养板对应一个含 10 ml 0.1X MMR 的 60 mm 塑料培养皿——同胞板。</li>
 <li>每次解剖操作对应一个含 10 ml 0.1X MMR 加 0.5 mg/ml MS-222（三卡因）的 60 mm 塑料培养皿——麻醉板。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>向外植体消化板中加入 40 μl 含 5% 胰蛋白酶的 CMF 溶液（终浓度为 0.1% 胰蛋白酶），轻轻摇动混匀，置于一旁备用。</li>
 <li>若解剖的胚胎早于 30 期，向解剖板中加入 10 mg 胶原酶 B（终浓度为 1 mg/ml 胶原酶 B），轻轻摇动使其溶解，置于一旁备用。</li>
 <li>选择目标发育阶段的胚胎，用非无菌转移移液管将其转移至暂存板，并用精细镊子去除卵黄膜（若胚胎尚未孵化）。</li>
 <li>用非无菌转移移液管将若干相同发育阶段的胚胎转移至同胞板。</li>
 <li>若胚胎为 25 期或更早，可直接进行解剖；否则，用非无菌转移移液管将胚胎转移至麻醉板，静置直至胚胎运动及对刺激的反应完全停止，此过程可能持续约一分钟。</li>
 <li>在解剖显微镜下（4X 物镜，10X 目镜）进行解剖操作（图 2）。</li>
</ol>
对于25期或更早期的胚胎：
<ol start="13">
 <li>将胚胎转移至 解剖板 使用非无菌移液管。</li>
 <li>使用两对精细镊子，在胚胎腹侧进行正中矢状切口，从后端开始，向前延伸并穿过胚胎前部的胶腺。</li>
 <li>小心地抓住切口两侧并向左右分开，使胚胎展开，背侧朝向内面 解剖板，腹侧外胚层展开，以暴露其内的内胚层和中胚层。</li>
 <li>开始去除内胚层和中胚层（图2A和2B）。该组织的第一层也是最大的一层，外观非常“蓬松”，细胞较大且无明显排列。</li>
 <li>去除该层后，体节和脊索将变得可见。为了获得更好的对比度，将胚胎转移至另一个含有10 ml细胞培养基和100 &mu;1% 硫酸尼罗蓝溶液（溶于水）中染色 2-3 分钟，然后转移回 解剖板这将使外胚层、体节和脊索着色，以便于识别和定位。</li>
 <li>聚焦于胚胎的前部，小心地去除脊索及任何残留的中胚层组织，以暴露脑部和视泡（图2C).</li>
 <li>当脑部和视泡完全暴露后，使用镊子在脑后方切断神经管及下方的外胚层。</li>
 <li>将这一部分（脑部和视泡）翻转，使外胚层朝上。</li>
 <li>注意不要损伤下方的视泡，小心地去除外胚层（图 2D).</li>
 <li>最后，使用镊子将视泡从脑组织中分离出来（图2D和2E).</li>
</ol>
对于发育阶段超过25期的胚胎：
<ol start="23">
 <li>当胚胎处于麻醉板中时，用镊子去除胚胎的腹侧部分。</li>
 <li>为了获得更好的对比度，在转移至解剖板之前，将胚胎移至含有10 ml 0.1X MMR和100 μl 1% 硫酸尼罗蓝的60 mm塑料培养皿中，孵育2-3分钟。这将使外胚层染成蓝色。</li>
 <li>一旦胚胎置于解剖板中，向后拉开覆盖在视网膜（或发育阶段26-30胚胎的视泡）上的外胚层（图2F和2G）。如果使用了硫酸尼罗蓝，外胚层将被染成蓝色，而下方的视网膜组织则不会着色。</li>
 <li>用镊子小心地取出视网膜或视泡（图2H、2I和2J）。操作时可用一对镊子固定胚胎，另一对镊子用于摘除视网膜或视泡，这样更为方便。</li>
</ol>
2. 组织解离与细胞接种
重要提示 - 转移组织时，切勿让视网膜或视泡接触任何气液界面；否则细胞将发生裂解。
<ol>
 <li>一旦视泡或视网膜被分离后，小心地转移至 外植体清洗板 使用带气溶胶阻隔的枪头，用 p100 微量移液器吹打混匀，静置 30 秒。</li>
 <li>转移80 &mu;0.1% 胰蛋白酶在 CMF 中的 l 外植体解离板 到 外植体解离管.</li>
 <li>使用100 μL移液器及防气溶胶吸头，将视网膜或视泡从 外植体清洗板 到 外植体解离管，避免转移外植体的清洗液。</li>
 <li>让组织在其中解离 外植体解离管 室温孵育1小时。每孔使用一只视网膜，但若需增加每孔细胞数量，也可根据需要在每孔中使用多于一只视网膜。</li>
 <li>接种细胞时，首先缓慢移除40 &mu;溶液中的 l 外植体解离管 使用 P100 微量移液器和抗气溶胶吸头弃去液体。将 P100 设置为 40 &mu;l 和抗气溶胶吸头，将细胞（此时组织已解离）转移至 培养板吸取细胞至培养板时，应缓慢移液，并将细胞保持在培养板中央的小范围内。</li>
</ol>
注意：如果在实验过程中需要多次拍摄细胞图像，可在 培养板 底部用少量超级胶水粘附一个网格（Cellattice）。这样可在操作的不同阶段对相同细胞以相同方向进行成像。
<ol start="6">
 <li>让细胞静置至少1小时，使其充分贴附于Nunclon培养板。此后操作需格外轻柔，以免细胞脱落。</li>
 <li>通过观察与细胞同温度培养的同胞胚胎，判断并培养细胞至所需发育阶段。若不再对活细胞进行后续操作，此时可用MEMFA溶液固定细胞。</li>
</ol>
重要提示：我们的大部分实验均在细胞接种后6小时内完成固定。细胞在培养中的存活时间取决于组织解剖时所处的发育阶段以及细胞中残留卵黄的含量；从较早期（神经胚阶段）解剖获得的细胞在培养中可保持健康状态5至6天，而从较晚期胚胎（游动蝌蚪阶段）获得的细胞在培养中仅可维持活力2至3天。
3. 钙成像 47-49
本方案利用钙离子敏感性染料 Fluo4-AM 和共聚焦显微镜对单个细胞中的钙瞬变进行定量分析。所有使用 Fluo4-AM 的操作步骤均需避光进行，因为 Fluo4-AM 对光敏感。所有洗涤步骤应使用 p1000 微量移液器和防气溶胶吸头进行加样或移除。移液时应缓慢操作，并沿培养板边缘进行，以避免扰动细胞。由于培养物通常在解剖后 6 小时内即进行固定，因此不更换培养基。对于需要长期培养的情况，应每天更换一次培养基。
<ol>
 <li>Fluo4-AM 于 -20 ℃ 保存 &deg;C，建议储存于5 &mu;l 分装。使用前，解冻一份 5 &mu;避光保存一份 Fluo4-AM，并加入 2 &mu;将 Pluronic F-127 溶液直接加入该等分试样中。</li>
 <li>在将细胞培养所需时间（至少1小时）后，从细胞培养基中移除1 ml的培养液 培养皿将此加入Fluo4-AM和Pluronic中，轻轻吹打混匀。</li>
 <li>缓慢地将所有溶液重新转移至边缘 培养板 待成像细胞并在此溶液中静置1小时，以吸收Fluo4-AM。</li>
 <li>为洗去细胞培养基中过量的 Fluo4-AM，请完成以下洗涤步骤：
 <ul>
 <li>从培养板中移除 1 ml 培养基。</li>
 <li>向培养板中加入 3 ml 新鲜的细胞培养基（来自 15 ml 圆锥形试管）。</li>
 <li>再进行两次洗涤，每次缓慢移除 3 ml 培养液，并加入 3 ml 新鲜的细胞培养基。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>此时细胞应置于4 ml细胞培养基中，并含有Fluo4-AM。Fluo4-AM进入细胞后会被酶切，从而防止其扩散出细胞或进入任何膜结合区室。</li>
 <li>在将培养板置于共聚焦显微镜载物台上进行成像之前，保持盖子处于关闭状态，用永久性记号笔在培养皿侧面（即培养皿底部，而非盖子）画一条垂直的红色线条，以防止记号笔颗粒污染培养物。该垂直线用于指示培养板相对于视野的方向，以便后续能够重新确定单个细胞的精确朝向和排列。</li>
 <li>现在可以将培养板装载到共聚焦显微镜载物台上进行成像。使用激光扫描共聚焦显微镜的明场设置（物镜20倍）观察细胞。选择一个细胞密度较高且无细胞团块的区域，最好视野中包含Cellatice盖玻片上的大网格编号，以便后续对培养物成像时更容易重新定位到相同的视野 原位 杂交。成像前，调节焦距穿过培养物，拍摄细胞下方网格的明场图像，以记录细胞培养的位置和方向。这有助于在后续分析中重新对齐细胞。</li>
 <li>提升焦平面，并在开始钙成像之前获取细胞的明场图像图3A).</li>
 <li>当细胞的中心平面处于聚焦状态时，即可开始对钙活性进行成像。成像参数将根据显微镜型号和具体应用而有所不同。我们使用488 nm氩离子激光器对细胞进行成像，持续时间为1、2或12小时，参数设置如下：
 <ul>
 <li>1 hr 图像:
 <ul>
 <li>氩气488 nm激光以最大30 mW功率的4%进行扫描。</li>
 <li>每 4 秒扫描一次（每小时 900 次扫描）。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>2 小时图像：
 <ul>
 <li>氩气488 nm激光以最大30 mW功率的4%进行扫描。</li>
 <li>每 8 秒扫描一次（每小时 450 次扫描）。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>12 小时图像：
 <ul>
 <li>氩气488 nm激光以最大30 mW功率的2%进行扫描。</li>
 <li>每48秒扫描一次（每小时75次扫描）。</li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 </li>
</ol>
这些参数将为每个时间点生成一组900张静态图像。随后，可通过使用ImageJ等图像处理软件分析随时间变化的图像中的荧光强度（图3B），来记录钙活性50。
4. 细胞固定
<ol>
 <li>成像后，从培养板中移除 3 ml 溶液，向剩余的 1 ml 培养基中加入 1 ml 2X MEMFA，固定细胞 30 分钟。</li>
 <li>固定后，吸除 MEMFA，并用一系列体积均为 1 ml 的溶液对细胞进行每次 5 分钟的洗涤以进行脱水：
 <ul>
 <li>25% 乙醇溶于 1X 磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
 <li>50% 乙醇溶于 1X PBS。</li>
 <li>75% 乙醇溶于 sdd H2O（无菌去离子蒸馏水）。</li>
 <li>将最后一次洗涤替换为 1 ml 100% 乙醇，并将培养板置于 -20 °C 保存。</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
注意：甲醇也可用于这些洗涤步骤及储存。
5. 荧光原位杂交（FISH）
可使用标准的FISH实验方案对培养物进行检测 非洲爪蟾 如所述 51 根据Anderson实验室所述的细胞培养改良方法进行修改 52. Anderson实验室方案的修改内容如下。所有洗涤步骤均在35 mm Nunclon培养板中进行，每次使用约1 ml溶液，除非另有说明。溶液配制方法详见Sive 等 53 除非另有说明。
重要提示：对已进行钙活性成像的细胞进行原位杂交时，切勿使用荧光素标记的RNA探针。抗荧光素抗体会与细胞中残留的Fluo4-AM结合，可能导致培养中所有细胞均出现阳性信号。
第1天：通透化与杂交
<ol>
 <li>复水洗涤应根据储存时所用的脱水溶剂进行梯度处理。在我们的实验中，使用1X PBS对乙醇进行梯度洗涤。</li>
 <li>复水后，在1X PBS中于室温下再洗涤三次，每次5分钟。</li>
 <li>在Falcon管中混合25 ml 0.1 M三乙醇胺（pH 8.0）与62.5 μl乙酸酐，并迅速混匀至完全分散，具体操作如Anderson实验室52方案所述。将细胞培养物在此混合液中于室温孵育10分钟。乙酸酐处理后，用1X SSC缓冲液于室温洗涤5分钟。</li>
 <li>移除最后一次SSC洗涤液，加入0.2 M HCl（溶于sdd H2O）处理10分钟，以通透细胞。</li>
 <li>用1X PBS洗涤两次，每次5分钟，以去除HCl。</li>
 <li>在60 °C摇动水浴中用原位杂交缓冲液预杂交，至少6小时，但不可过夜预杂交，否则会显著降低信号强度。</li>
 <li>在60 °C下以750 μl稀释探针（从纯化探针按1:250稀释）杂交过夜，时间为8–14小时。纯化探针的浓度范围为1.0–1.5 μg/μl。</li>
</ol>
第2天：去除未结合的探针并进行抗体孵育
<ol start="8">
 <li>移除探针，并在 60 °C 下用 0.2X SSC 溶液冲洗培养物 5 分钟。在 60 °C 下用新鲜的 0.2X SSC 溶液洗涤 1 小时。</li>
 <li>将培养物从水浴中取出，在室温下静置 5 分钟，使其适应室温。</li>
 <li>在室温下用 0.2X SSC 溶液冲洗 5 分钟。</li>
 <li>在含有 0.1% Triton-X-100 的 1X PBS（PBT）中洗涤 15 分钟。</li>
 <li>为灭活内源性过氧化物酶，在 PBT 中的 2% H2O2 溶液中洗涤 1 小时。</li>
 <li>用含有 0.1% Tween 20 的 1X Tris 缓冲盐水（TBST）洗涤 15 分钟。</li>
 <li>在马来酸缓冲液（MAB）中含 2% 封闭试剂的溶液中于室温封闭 1 小时。我们发现，与在 PBT 中使用 20% 羊血清封闭的先前方法相比，该封闭方法可提高检测灵敏度。</li>
 <li>将培养物在 4 °C 下于 1 ml 含有 1:1,000 稀释的 POD 标记抗体的 MAB 溶液（含 2% 封闭试剂）中孵育过夜。</li>
</ol>
第3天：去除未结合抗体并进行荧光显色
<ol start="16">
 <li>移除抗体溶液，并在室温下用TBST清洗3次，每次5分钟。</li>
 <li>在室温下用TBST清洗4次，每次15分钟，同时以低速持续振荡。</li>
 <li>在室温下用PBT清洗2次，每次10分钟。</li>
 <li>加入750 μl以PBT按1:200稀释的荧光素-酪胺或按1:25稀释的Cy3酪胺溶液。室温孵育5分钟后，加入2.5 μl 0.3% H2O2，振荡反应40分钟以使信号充分显色。</li>
 <li>在室温下用TBST振荡清洗至少4次，每次15分钟。</li>
 <li>待信号完全显色后，在1X PBT中清洗5分钟。</li>
 <li>在室温下用1X MEMFA固定1小时，随后置于4 °C的1X PBS中保存。</li>
</ol>
6. 图像 FISH 结果并与钙成像数据共同配准
<ol>
 <li>FISH 完成后，对细胞培养板进行成像，以确定哪些细胞对特定探针显示出阳性荧光信号。使用 Cellattice 盖玻片找到钙成像过程中研究的精确视野，并将培养板方向与钙成像图像帧的方向对齐。</li>
 <li>将焦平面调整至细胞的中心层面，使用氦氖（HeNe）543 nm 激光器（功率为其最大 1 mW 功率的 15%）拍摄一张高分辨率图像（图 3C）。</li>
 <li>在钙成像实验所获得的原始 900 帧图像序列中，通过图像处理软件（如 ImageJ 50）将单个细胞定义为感兴趣区域（ROI），并提取 ROI 的荧光数据，形成一组代表时间-荧光配对值的数据点（图 4）。</li>
 <li>将 FISH 结果图像与钙成像中识别出的 ROI 叠加（图 3D）。</li>
 <li>将每个 ROI 登记为对该探针呈阳性、阴性，或未知——若对应于该 ROI 的细胞在 FISH 图像视野中已无法找到，则记为未知。</li>
 <li>使用统计分析脚本（通过 MATLAB 或其他编程语言编写）处理 ROI 荧光数据，以比较不同解剖阶段之间的钙活性水平（图 5A 和 5C），或比较对不同 FISH 探针呈阳性的细胞之间的钙活性（图 5B 和 5D）。我们实验室使用的所有脚本均可应要求免费提供。</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

由于视网膜具有在所有脊椎动物中高度保守且特征明确的细胞类型，因此它是研究调控细胞类型特化与分化的分子-细胞过程的理想模型。原代细胞培养为研究多种生物学过程提供了有力手段，包括基因表达、蛋白质动态变化以及单细胞分辨率下的钙信号和电活动。本文介绍了一种从非洲爪蟾（Xenopus laevis）分离的视泡组织中建立原代细胞培养的简便技术。非洲爪蟾是此类研究的理想模式生物，因为其视泡组织在发育最早期即易于获取，且原代细胞培养可在仅含简单盐溶液的明确培养基中进行。
尽管该方法易于适应大多数实验室环境，但有几个步骤需要特别仔细操作。解剖应使用 freshly sharpened forceps 进行。较早期的胚胎（&lt; st. 30）在含有胶原酶B的细胞培养基中处理效果更佳。所有涉及将组织或细胞从一种培养基转移至另一种培养基的操作，都必须格外小心，以防止组织或细胞接近气-液界面。含有组织的移液管应完全浸没在充足的液体中，并缓慢排出细胞或组织。细胞接种后，所有液体转移操作（包括Fluo4-AM的添加、细胞培养基更换或固定洗涤）都必须谨慎进行，因为细胞容易脱落。与所有细胞培养...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;用于解剖与培养&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>BD Falcon Easy Grip 组织培养皿，35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>一次性聚苯乙烯培养皿，60 × 15 mm</td><td>Fisher</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Nunclon Surface 培养皿（带通气孔）</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Dumont精细镊子（Dumostar #55）</td><td>Fisher</td><td>NC9341917</td><td></td></tr><tr><td>Cellattice 微刻痕塑料盖玻片，25 mm</td><td>Fisher</td><td>50-313-17</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸乙酯-间氨基苯甲酸盐（MS-222）</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-003-G025</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 胰蛋白酶（1:250）粉末</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B，来源于 &lt;em&gt;艰难梭菌&lt;/em&gt;</td><td>罗氏</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>硫酸尼罗蓝（可选）</td><td>Pfaltz Bauer</td><td>N05550</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 真空过滤/储存瓶系统，0.22 &amp;mu;m 孔 33.2 厘米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; CN 膜</td><td>康宁</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;用于钙成像&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 1 mM DMSO 溶液，细胞永久性</td><td>Life Technologies</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>10% Pluronic F-127 水溶液 </td><td>Life Technologies</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 共聚焦显微镜系统 </td><td>蔡司</td><td>模型已停用</td><td></td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>罗氏</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;用于荧光 &lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 荧光原位杂交（FISH）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗地高辛-POD，Fab 片段</td><td>罗氏</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>抗DNP-HRP抗体 </td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEL747A</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS酯</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>NHS-荧光素 </td><td>赛默飞世尔科技</td><td>46409</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺，去离子</td><td>Amresco</td><td>0606-950ML</td><td></td></tr><tr><td>酵母RNA，IX型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐（来自猪肠黏膜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-250KU</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表2. &lt;/strong&gt; 特定试剂与设备。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;参考文献&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;目录&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;细胞培养基&lt;/td&gt; &lt;td&gt;张和Spitzer，2009&lt;sup&gt;54&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;116 mM NaCl&lt;br/&gt; 0.67 mM KCl&lt;br/&gt; 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 1.31 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 4.6 mM Tris&lt;br/&gt; 1% (v:v) 青霉素/链霉素 &lt;br/&gt; 用 HCl 调节 pH 至 7.8。&lt;br/&gt; 通过0.22 μm滤器过滤除菌 &amp;mu;m CN滤膜&lt;br/&gt; 4 ℃保存 &amp;deg;C.&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;无钙镁培养基 (CMF)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;顾 &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 1994&lt;sup&gt;42&lt;/sup&gt;；Gu 和 Spitzer，1995&lt;sup&gt;55&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;116 mM NaCl&lt;br/&gt; 0.67 mM KCl&lt;br/&gt; 4.6 mM Tris&lt;br/&gt; 0.4 mM EDTA&lt;br/&gt; 1% (v:v) 青霉素/链霉素 &lt;br/&gt; 用 HCl 将 pH 值调至 7.8。&lt;br/&gt; 通过0.22 μm滤器过滤除菌 &amp;mu;m CN滤光片&lt;br/&gt; 4°C 下保存 &amp;deg;C. &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;马来酸缓冲液（MAB）&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sive &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2000&lt;sup&gt;53&lt;/sup&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 mM 马来酸 &lt;br/&gt; 150 mM NaCl（pH 7.5）&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Marc's Modified Ringers (MMR)，10倍浓缩液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sive &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2000&lt;sup&gt;53&lt;/sup&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 mM NaCl&lt;br/&gt; mM KCl&lt;br/&gt; 1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 5 mM HEPES &lt;br/&gt; pH 用 NaOH 调至 7.4&lt;br/&gt; 0.1X MMR 还含有 50 mg/ml 硫酸庆大霉素，并用 NaOH 将 pH 调至 7.4。&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;MEMFA溶液，10倍浓缩液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sive &lt;em&gt;等人&lt;/em&gt;, 2000&lt;sup&gt;53&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1 M MOPS（pH 7.4）&lt;br/&gt; 2 mM EGTA&lt;br/&gt; 1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 3.7% 甲醛&lt;br/&gt; 一种10倍浓度的溶液（不含甲醛）可在4℃保存 &amp;deg;C. 加入新配制的甲醛（体积为标准37%储备液的1/10）。 &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 杂交缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sive &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2000&lt;sup&gt;53&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50% 甲酰胺&lt;br/&gt; 5X SSC&lt;br/&gt; 1 mg/ml 酵母RNA&lt;br/&gt; 100 mg/ml 肝素&lt;br/&gt; 1X 登哈特溶液&lt;br/&gt; 0.1% 吐温-20&lt;br/&gt; 0.1% CHAPS&lt;br/&gt; 10 mM EDTA&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;溶液。&lt;/strong&gt; *庆大霉素（gentamicin）是一种抗生素，被用于我们的MMR溶液中，而青霉素（penicillin）和链霉素（streptomycin）则被用于我们的培养基中。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

xenopus laevis 胚胎视网膜组织的分离、培养与分析

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

神经板前部区域发育为脊椎动物视网膜的过程，一直是临床与基础研究的重要焦点。除了在理解与治疗视网膜疾病方面具有明显的医学意义外，脊椎动物视网膜的发育还持续作为研究神经元细胞类型决定与分化的关键且精巧的模型系统1-16。神经视网膜由六种不同类型的细胞（神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、光感受器细胞、双极细胞和 Müller 胶质细胞）组成，这些细胞以典型的层次结构排列，该模式在所有脊椎动物中高度保守12,14-18。
尽管研究完整发育胚胎中的视网膜对于理解这一复杂器官如何从前脑的突起发育为分层结构至关重要，但许多科学问题仍可得益于采用原代视网膜前体细胞培养的方法7,19-23。例如，分析在不同发育阶段取出并解离的组织中的细胞，可揭示单个细胞在不同发育时期的特化状态，即在不与邻近组织相互作用的情况下细胞的命运8,19-22,24-33。原代细胞培养还允许研究者使用特定试剂处理培养物，并在单细胞水平上分析结果5,8,21,24,27-30,33-39。Xenopus laevis 是研究早期神经发育的经典模型系统19,27,29,31-32,40-42，特别适用于视网膜原代细胞培养10,38,43-45。
在发育的最早阶段，即神经诱导完成后，即可获取视网膜前体组织25,38,43。此外，由于胚胎中的每个细胞都含有卵黄储备，因此视网膜细胞可以在成分明确的简单培养基中进行培养，该培养基仅包含缓冲盐溶液，从而避免了使用孵育液或其他血清类产品所带来的干扰效应10,24,44-45。
然而，从周围组织中分离视网膜组织并进行后续处理具有较大挑战性。本文介绍一种用于解剖和解离非洲爪蟾（Xenopus laevis）视网膜细胞的方法，该方法将用于制备原代细胞培养物，进而可在单细胞水平上分析钙活性和基因表达。尽管本文所展示的主题是自发性钙瞬变的分析，但该技术可广泛适用于多种研究问题和研究方法（图1）。

成功分离的视泡（25期）和视网膜（35期）示例见图2E和2J。尽管本方案可用于发育的各个阶段，但关键是要仅获取视网膜组织，以确保后续实验的准确性。在各个阶段均需小心去除表皮，并确保镊子不会刺破视网膜组织。在35期或更晚阶段，晶状体可见为视网膜上方的一层透明结构，可用镊子谨慎刮除。
成功接种的原代细胞培养物如图3A所示。在组织解离过程中，切勿将视网膜外植体在清洗液中停留超过推荐的30秒孵育时间，以防止组织在清洗液中过早解离。此外，应确保组织在胰蛋白酶溶液中充分解离满1小时（较晚期的胚胎和幼体阶段可能需要更长时间），以使细胞在培养板中均匀分布。细胞接种后，在移动培养板和更换溶液时应格外小心，避免将细胞从培养板上冲走。
图3B 和图3C 分别展示了钙活性扫描和荧光原位杂交实验（FISH）的图像。在钙成像中呈现亮绿色的细胞，表示其因内部钙库释放而导致细胞内钙水平出现瞬时升高。随后可通过FISH检测这些细胞的基因表达情...

Xenopus laevis 为研究视网膜细胞在原代细胞培养中的细胞命运决定及单个视网膜细胞的生理功能提供了一个理想的模型系统。本文介绍了一种分离视网膜组织并建立原代细胞培养的方法，该培养物可用于钙活性成像及后续分析 原位 杂交

Xenopus laevis 胚胎视网膜组织的分离、培养与分析

神经板前部区域发育为脊椎动物视网膜的过程一直是临床与基础研究的重要焦点。除了在理解和治疗视网膜疾病方面具有明显的医学相关性外，脊椎动物视网膜的发育也持续作为研究神经元细胞类型决定与分化的关键且精巧的模型系统1-16。神经视网膜由六种明确的细胞类型（神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、光感受器细胞、双极细胞和 Müller 胶质细胞）组成，这些细胞以典型的层次结构排列，该模式在所有脊椎动物中高度保守12,14-18。尽管研究完整胚胎中视网膜的发育过程对于理解这一复杂器官如何从前脑突起发育为分层结构至关重要，但许多科学问题仍可从采用预定视网膜细胞原代培养的方法中获益7,19-23。例如，分析在不同发育阶段取出并解离的组织中的细胞，可揭示单个细胞在不同发育时期的特化状态，即在不与邻近组织相互作用的情况下细胞的命运8,19-22,24-33。原代细胞培养还允许研究者向培养物中添加特定试剂，并在单细胞水平上分析其效应5,8,21,24,27-30,33-39。非洲爪蟾（Xenopus laevis）作为早期神经发育研究的经典模型系统19,27,29,31-32,40-42，在视网膜原代细胞培养方面尤为适用10,38,43-45。预定视网膜组织自发育最早期阶段即可获取，紧随神经诱导之后25,38,43。此外，由于胚胎中的每个细胞均含有卵黄储备，视网膜细胞可在极为简单的定义培养基中培养，该培养基仅由缓冲盐溶液组成，从而避免了使用血清或其他含血清成分带来的干扰效应10,24,44-45。然而，从周围组织中分离视网膜组织并进行后续处理仍具挑战性。本文介绍一种用于非洲爪蟾（Xenopus laevis）视网膜细胞解剖与解离的方法，该方法将用于制备原代细胞培养物，进而实现对单细胞分辨率下的钙活性与基因表达的分析。尽管本文所展示的研究主题为自发性钙瞬变的分析，但该技术广泛适用于多种研究问题与方法（图1）。

本实验的总体目标是制备非洲爪蟾视网膜细胞的原代细胞培养。首先去除视网膜周围的组织以暴露视网膜，第二步是切除视网膜组织。接下来，将视网膜组织解离为单个细胞。最后一步是将视网膜细胞接种到未克隆培养皿上，并加入Fluo-4 AM进行钙成像。最终，通过共聚焦显微镜检测视网膜细胞培养物中的钙活性。该方法有助于解答发育生物学、神经生物学和细胞生物学领域中的一些关键问题，例如钙离子和电活动在视网膜发育中的作用，以及单细胞水平上的基因表达。通常，初次接触该实验操作的研究者会遇到困难，因为及时且准确的解剖需要精细的运动操作能力。由于解剖步骤复杂，手眼协调动作至关重要，因此对该方法进行直观演示尤为关键。在超净工作台内开始此操作时，准备并标记以下物品：一个含有10毫升细胞培养基的60毫米塑料培养皿，用作解剖板。可选地，可在解剖板中加入10毫克胶原酶B，使其终浓度达到每毫升1.0毫克，以帮助分离25期或更早期胚胎的组织层。此外，准备一个35毫米的培养皿，内含2毫升细胞培养基，用作培养板；一个空的1.5毫升微量离心管，用作组织块解离管；以及一个15毫升的圆锥形Falcon管，内含15毫升液体。细胞培养基。然后准备2个35毫米的塑料培养皿，各加入2毫升无钙镁溶液（CMF），用于解剖，其中一个作为组织块解离板，另一个作为组织块冲洗板，置于超净台外。准备两个60毫米的塑料培养皿，各加入10毫升溶液。0.1 XMMR，一个用作暂存板，另一个用作同胞板，另准备一个60毫米塑料培养皿，内含10毫升0.1 XMMR加0.5毫克/毫升MS 22。随后，向外植体解离板中加入40微升CMF中的5%胰蛋白酶。轻轻混匀后静置。接着，在解剖显微镜下使用两把精细镊子进行解剖。从胚胎后端开始，在腹侧做一正中矢状切口，并向前延伸，穿过胚胎前部的胶腺。轻轻撑开切口的两侧，使胚胎完全展开。这将使胚胎的背侧朝向解剖板。随后打开腹侧外胚层，以暴露内胚层和中胚层。接下来，去除该组织的第一层也是最大的一层——内胚层和中胚层。内胚层外观蓬松，细胞较大且缺乏明显的组织结构。去除这一层后，体节和Noor将变得可见。为了获得更好的对比度，将胚胎转移至另一个含有10毫升细胞培养基和100微升1%硫酸尼罗蓝溶液的60毫米塑料培养皿中，孵育2到3分钟。随后，将其转移回解剖培养皿中。这将使外胚层、体节和脊索着色，便于识别和定位。聚焦于胚胎的前部，小心地移除Noor以及任何残留的中胚层，以暴露脑部和视泡。当脑部和视泡完全暴露后，使用镊子在脑后方切断神经管及下方的外胚层。将此部分翻转，使外胚层朝上。操作时需小心，避免损伤下方的视泡，并仔细去除外胚层。最后，用镊子将视泡从脑部分离，以解剖25期以后的胚胎。首先，在麻醉板中用镊子移除胚胎的腹侧部分。为了获得更好的对比度，将胚胎转移至含有10毫升0.1 XMMR和100微升1%硫酸尼罗蓝的60毫米塑料培养皿中，染色2至3分钟，以标记外胚层。然后将胚胎转移至解剖培养皿中，小心固定胚胎位置，去除覆盖在外胚层下方的视网膜或视泡。一旦视泡或视网膜被分离出来，使用P 100微量移液器配合防气溶胶吸头，小心地将其转移至X explant清洗板中。注意避免其接触任何气液界面。随后让explant静置30秒。接下来，将80微升含0.1%胰蛋白酶的无钙镁液（CMF）从外植体解离板转移至外植体解离管中。随后，将视网膜或视泡从外植体洗涤板转移至外植体解离管中，注意避免将外植体洗涤液一并转移。然后在室温下将组织置于explan解离管中解离一小时。若需在实验过程中对细胞拍摄多张图像，可用少量瞬间胶将网格贴附于培养板的底面。这样可在实验过程的不同时间点对相同位置、相同方向的细胞进行成像，以实现细胞的准确接种。首先，缓慢从外植体解离管中移除 40 微升溶液并弃去。然后使用带有抗气溶胶吸头的 P100 移液器，缓慢将细胞转移至培养板中。将细胞吸取至培养板时，应缓慢移液，并将细胞集中在培养板中央的小区域内。该图展示了一个细胞在一小时成像过程中钙活性的示例。这些图像提供了在不同发育阶段分析的胚胎视网膜细胞钙成像实验的代表性结果。简而言之，结果表明，钙活动具有发育阶段依赖性，在发育第35阶段，钙活性与特定探针阳性的细胞之间表现出显著的相关性，且在此阶段出现钙振荡峰。在鱼类实验中，尽管未观察到具有统计学显著性的差异，但呈现出一种趋势：表达GABA能标记物的细胞其钙振荡活性水平高于表达谷氨酸能标记物或PT F1 A.A基因（该基因编码一种与促进GABA能表型相关的转录因子）的细胞。一旦掌握该技术，若操作得当，完成一块培养板的实验大约需要3小时30分钟。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如细胞培养、C2杂交或电生理记录，以回答更多问题，例如哪些细胞表达特定的表型标记物，或用于分析电生理记录结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何解剖视网膜组织、分离视网膜组织以及接种视网膜细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

解剖，文化与分析<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;胚胎视网膜组织

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Xenopus laevis 胚胎视网膜组织的分离、培养与分析

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