解剖，文化与分析非洲爪蟾胚胎视网膜组织
December 23rd, 2012
非洲爪蟾提供了一个理想的模型系统，为研究细胞命运和生理功能的个人视网膜细胞的原代细胞培养。在这里，我们提出了一种技术，用于解剖视网膜组织并产生成像的原代细胞培养活性钙和原位杂交分析。
该程序的总体目标是制备非洲爪蟾视网膜细胞的原代细胞培养物。这是通过首先去除周围组织以暴露视网膜来实现的。第二步是切除视网膜组织。
接下来，视网膜组织解离成单个细胞。最后一步是将视网膜细胞接种在 UnCloned 培养皿上，并在凌晨 4：00 添加 flu oh 进行钙成像。最终，共聚焦显微镜用于检测视网膜细胞培养物中的钙活性。
这种方法可以帮助回答发育生物学、神经生物学和细胞生物学领域的关键问题，例如钙和电活动在视网膜发育中的作用，以及单细胞水平上的基因表达。通常，刚接触此程序的人会很挣扎，因为精细运动对于及时准确的解剖是必要的。这种方法的视觉演示至关重要，因为解剖步骤很困难，因为复杂的手眼运动是必不可少的。
要在通风橱内开始此过程，请准备并标记以下内容，一个装有 10 毫升的 60 毫米塑料培养皿。用作解剖板的细胞培养基。或者，可以将 10 毫克胶原酶 B 添加到解剖板中，最终浓度为 1.0 毫克/毫升，以帮助分离组织层，以便解剖 25 期或更年轻的胚胎。
此外，准备 1 个 35 毫米的 lon 表面培养皿，其中包含 2 毫升。用作培养板的细胞培养基。一个空的 1.5 毫升微量离心管用作外离解离管和一个 15 毫升的 15 毫升锥形猎鹰管，其中包含 15 毫升。
细胞培养基。然后准备 2 个 35 毫米塑料培养皿，其中包含 2 毫升用于解剖的 CMF，一个用作解释解离板，另一个用作引擎盖外的 X 解释冲洗板。准备两个 60 毫米的塑料培养皿，容量为 10 毫升。
0.1 XMMR，一个用作固定板，另一个用作兄弟板，还有一个 60 毫米塑料培养皿，含有 10 毫升，0.1 XMMR 加 0.5 毫克/毫升。MS 2 22.之后，将 40 微升、5% 的 CMF 中 tripsin 添加到解释解离板中。
旋转混合，然后放在一边。接下来，使用解剖镜，使用两对细镊子进行解剖。在胚胎的腹侧做一个矢状中切口，从后端开始，继续穿过胚胎前部的水泥腺。
通过展开切口的两侧，小心地打开胚胎。这导致胚胎的背侧面向解剖板。然后打开腹侧外胚层，露出内胚层和中胚层。
接下来，去除该组织的第一层也是最大的一层内胚层和中胚层。内胚层外观非常蓬松，细胞大，组织不明显。删除此图层后，体节和 Noor 将变得可见。
为了获得更好的对比度，将胚胎转移到单独的 60 毫米塑料培养皿中，该培养皿中装有 10 毫升细胞培养基和 100 微升 1% 尼罗河蓝硫酸盐溶液，并孵育 2 到 3 分钟。然后，将其转移回解剖板。这将对外胚层、体节和 Noor 进行染色，以便于识别和定位。
专注于胚胎的前部，小心地去除 Noor 和任何剩余的中胚层，以暴露大脑和视囊泡。一旦大脑和视囊泡完全暴露，用镊子切断大脑后方的神经管和下面的外胚层。将此部分翻转过来，使外胚层位于顶部。
小心避免损坏下面的视囊泡，并小心地去除外胚层。最后，用镊子将视囊泡与大脑分离，以解剖 25 期以上的胚胎。首先，用麻醉板中的镊子去除胚胎的腹侧部分。
为了获得更好的对比度，将胚胎转移到含有 10 毫升、0.1 XMMR 和 100 微升 1% 尼罗蓝硫酸盐的 60 毫米塑料培养皿中，放置 2 到 3 分钟，以对外胚层进行染色。然后将其转移到解剖板上。然后将胚胎固定到位，小心地去除位于覆盖外胚层正下方的视网膜或视囊泡。
解剖视囊泡或视网膜后，使用 P 100 微量移液器使用防气溶胶吸头小心地将其转移到 X 外冲洗板上。小心不要让它接触任何空气液体边界。然后让 explan 静置 30 秒。
接下来，将 80 微升 CMF 中的 0.1% 胰蛋白酶从解释解离板转移到解释解离管中。之后，将视网膜或视囊泡从解释外冲洗板转移到解释外分离管。避免转移 explan 冲洗液。
然后让组织在室温下在解释解离管中解离 1 小时。如果要在整个实验过程中拍摄细胞的多个图像，请用小滴强力胶将网格连接到培养板的底部。这将允许在程序的不同点拍摄相同方向的相同细胞的图像，以对细胞进行接种。
首先，从解释解离管中缓慢取出 40 微升溶液并丢弃。然后使用带有防气溶胶吸头的 P 100 将细胞缓慢转移到培养板中。将细胞吸到板上时，缓慢移液并将细胞保持在板中心的一小块区域内。
该图显示了单个细胞在一小时成像中的钙活性示例。这些图提供了在不同发育阶段分析的胚胎视网膜细胞钙成像实验的代表性结果。简而言之，结果表明，钙在发育上受到调节，在第 35 阶段出现加标峰，将钙活性与特定探针阳性的细胞相关联。
在鱼类实验中，虽然没有统计学上的显著差异，但 GABA 能标志物阳性的细胞比谷氨酸能标志物或 PT F1 A.A 基因编码阳性的细胞显示出更高水平的钙加标活性，PT F1 A.A 基因编码是一种与促进 GABA 能表型相关的转录因子一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在大约 3 小时 30 分钟内完成一个板。在此程序之后，其他方法（如细胞培养和 C 2 杂交或电生理记录）可用于回答其他问题，例如哪些细胞表达特异性表型标志物或分析电生理记录。看完这个视频，你应该对如何解剖视网膜组织、解离视网膜组织和铺板视网膜细胞有一个很好的了解。
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概览
本文介绍了一种从非洲爪蛙制备视网膜细胞原代细胞培养的技术。该方法包括解剖视网膜组织，将其分离成单个细胞，并使用共聚焦显微镜成像钙活动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生理学
背景
- 非洲爪蛙是研究视网膜细胞的宝贵模型。
- 理解细胞命运决定对发育生物学至关重要。
- 钙成像提供了对细胞活动的洞察。
- 原位杂交允许进行基因表达分析。
研究目的
- 开发一种可靠的视网膜细胞培养方法。
- 分析视网膜细胞培养物中的钙活动。
- 增强对视网膜细胞生理学的理解。
使用的方法
- 从非洲爪蛙解剖视网膜组织。
- 将视网膜组织分离成单个细胞。
- 将视网膜细胞接种在未克隆的培养皿上。
- 使用共聚焦显微镜进行钙成像。
主要结果
- 成功从视网膜组织中生成原代细胞培养物。
- 有效成像培养的视网膜细胞中的钙活动。
- 展示基因表达分析的原位杂交。
结论
- 该技术为研究视网膜细胞生理学提供了一个稳健的模型。
- 钙成像是评估细胞活动的有价值工具。
- 这种方法可以促进视网膜生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Primary cell culture of Xenopus laevis retinal tissue enables mechanistic interrogation of developmental signaling pathways and cell fate specification in a genetically tractable vertebrate model. This approach supports target validation by allowing direct observation of calcium dynamics and gene expression at single-cell resolution, reducing ambiguity in early-stage hypothesis testing. The method provides a scalable, reproducible system for de-risking retinal biology targets prior to translational investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of retinal cell specification through calcium activity and gene expression readouts.
- Operational Value: Provides a defined, serum-free culture system that minimizes confounding variables in early target assessment.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular perturbations to phenotypic outcomes in developing retinal cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified retinal cell populations suitable for high-content imaging and ligand screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of calcium transient frequency and amplitude as functional biomarkers of neuronal maturation.
- Reproducibility: Standardized dissection and dissociation protocols support consistent cellular yields across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures early retinal neurodevelopment processes conserved across vertebrates, informing models of congenital retinal disorders.
- Biomarker Alignment: Permits correlation of calcium signaling patterns with cell-type-specific markers (e.g., GABAergic, glutamatergic) for target engagement studies.
- Preclinical Continuity: Bridges in vivo developmental mechanisms with in vitro validation, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis-driven exploration of retinal cell physiology before commitment to lead identification or preclinical programs.
- Discovery Biology: Facilitates interrogation of developmental pathways and neuronal differentiation through live-cell calcium imaging and molecular profiling.
- Screening: Prepares standardized retinal cell cultures for compound exposure studies and functional readout validation.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell resolution data on calcium activity and gene expression to support comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects early developmental mechanisms to potential therapeutic targets in retinal degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying retinal cell types across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity in retinal cell fate determination.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue dissection and dissociation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early functional validation of targets in a disease-relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal biology targets based on phenotypic and signaling data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and sterile tissue handling.
- Dependence on precision instrumentation including dissecting microscope, microinjectors, and confocal microscopy setup.
- Necessitates standardized reagent preparation (e.g., collagenase B, trypsin, Nile blue sulfate) for consistent tissue dissociation.
- Adaptation considerations for different Xenopus developmental stages due to changes in tissue adhesion and size.
- Practical limitation: Manual dissection throughput is constrained by the need for fine motor control and visual guidance.
