Name: 集成光声眼底镜检查和谱域光学相干断层扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学习集成光声眼底镜与谱域光学相干断层扫描技术，实现小动物视网膜活体同步成像。该方法可检测视网膜光学吸收与散射对比，揭示视网膜循环功能变化及详细解剖结构。

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感谢美国国家科学基金会（CAREER CBET-1055379）和美国国立卫生研究院（1RC4EY021357，1R01EY019951）的慷慨支持。同时感谢中国国家留学基金委对魏松（Wei Song）的支持。

1. 系统配置
<ol>
	<li>PAOM 子系统
	<ol>
		<li>照明光源：Nd:YAG 激光器（SPOT-10-100，Elforlight Ltd，英国：20 μJ/脉冲；2 nsec 脉冲持续时间；最高脉冲重复频率为 30 kHz）。</li>
		<li>1064 nm 的输出激光通过一块 β-硼酸钡（BBO）晶体（CasTech，美国加利福尼亚州圣何塞）倍频至 532 nm。经激光线反射镜进一步分束后，532 nm 激光通过单模光纤（P1-460A-FC-5，Thorlabs）传输，而 1064 nm 激光被光电二极管（DET10A，Thorlabs）记录，用于触发光声信号采集。</li>
		<li>从单模光纤输出的激光通过检流计（GM，QS-7，Nutfield Technology）和望远镜结构（f1=75 mm 和 f2=14 mm，Edmund Optics）投射到视网膜上6。</li>
		<li>一个非聚焦针式换能器（中心频率 40 MHz，带宽 16 MHz，有效元件尺寸 0.4×0.4 mm2，美国南加州大学超声换能器技术 NIH 资源中心）与眼睑接触，用于检测视网膜产生的光声信号。在换能器尖端与动物眼睑之间涂抹超声耦合凝胶（Sonotech），以实现良好的声学耦合。</li>
		<li>光声信号由两个放大器（ZFL-500LN+，Mini-circuits；5073PR，Olympus）放大，并由数据采集卡（CS14200，Gage Applied）进行数字化处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SD-OCT 子系统
	<ol>
		<li>低相干光源：宽带超辐射发光二极管（IPSDD0804，InPhenix；中心波长：840 nm；6-dB 带宽：50 nm），该光源决定了轴向分辨率为 6 μm。</li>
		<li>近红外光通过一个定制的 50×50 单模光纤耦合器（OZ Optics）分为参考臂和样品臂。</li>
		<li>通过热反射镜（FM02，Thorlabs）与 PAOM 照明光合并后，OCT 样品臂与 PAOM 共用相同的扫描和投射光学系统6。</li>
		<li>采用自制光谱仪记录 SD-OCT 干涉信号，其中线阵 CCD 相机（Aviiva SM2，e2v）可实现 24 kHz 的 A 线扫描速率。典型光谱仪的设计可参考多篇已发表的文献11，目前商用的光纤耦合 SD-OCT 光谱仪也已可获得。测得 SD-OCT 的灵敏度优于 90 dB。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描方案
	<ol>
		<li>检流计的快速二维光栅扫描由模拟输出板（PCI-6731，National Instruments）控制，该板同时触发 PAOM 激光发射和 OCT 光谱仪的信号采集。因此，PAOM 和 OCT 子系统的数据采集实现了同步。</li>
		<li>PAOM 数据采集由记录 PAOM 激光序列的光电二极管触发（见 1.1.2）。</li>
		<li>三维体图像或二维眼底图像由 256 幅 B 扫描图像构成（每幅 B 扫描图像包含 256 条 A 线）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 系统校准
<ol>
	<li>优化BBO晶体的倍频效率以及单模光纤的耦合效率。在优化PAOM照明光时，操作人员需佩戴LG3护目镜（Thorlabs）以保护眼睛。</li>
	<li>将PAOM光纤输出激光准直至直径为2.0 mm。</li>
	<li>调整PAOM与SD-OCT的复合照明光路，使其同轴。</li>
	<li>将PAOM激发光设置为约40 nJ/脉冲，SD-OCT探测光设置为约0.8 mW，两者均被报道为对眼睛安全6,12。</li>
</ol>
3. 体内 多模态视网膜成像
<ol>
	<li>将大鼠转移至一个透明的聚丙烯盒中，使用异氟烷（Phoenix pharmaceutical, Inc.）与正常空气的混合气体进行麻醉，异氟烷浓度为1.5%，气体流速为2.0升/分钟，持续10分钟。</li>
	<li>将麻醉后的大鼠固定于一个自制的五轴可调式固定装置中（图1），并通过加热垫（Repti therm, Zoomed Laboratories, Inc.）维持其体温在约37 °C。在整个实验过程中，持续通过吸入1.0%浓度、1.5升/分钟流速的异氟烷与空气混合气体维持麻醉状态。</li>
	<li>使用手术剪剪除眼睫毛，以1%托吡卡胺滴眼液散瞳，并使用0.5%盐酸四环卡因滴眼液麻痹虹膜括约肌。每隔一分钟向大鼠眼部滴加一次人工泪液（Systane, Alcon Laboratories, Inc.），以防止角膜脱水及白内障形成。在成像过程中，使用脉搏血氧仪（8,600 V, Nonin Medical, MN）监测动物的心率、呼吸及血氧饱和度。</li>
	<li>打开谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）照明光源，检查探测光功率约为0.8 mW。</li>
	<li>启动振镜扫描系统，将SD-OCT照射光对准大鼠视网膜，并通过调节五轴动物固定装置确定视网膜感兴趣区域（ROI）。此处将视盘有意置于视野中心，而实际ROI应根据不同的研究需求进行选择。</li>
	<li>进一步调节动物固定装置，优化视网膜横截面在两个扫描方向上的SD-OCT成像质量（通过切换光栅扫描方向），直至达到最佳光学聚焦状态。</li>
	<li>将针式换能器置于五轴可调平台上，于换能器尖端滴加一滴超声耦合剂，并轻柔地将换能器接触动物眼睑。</li>
	<li>将光声显微成像（PAOM）激光器设置为外触发模式，启动振镜扫描，并开启PAOM视网膜横截面图像的实时显示。仔细调节换能器方向，直至PAOM图像信噪比（SNR）达到最佳，同时在两个扫描方向上均呈现均匀分布的光声振幅图样。</li>
	<li>设置扫描参数，同步进行SD-OCT与PAOM的视网膜成像。离线重建SD-OCT与PAOM的三维图像。我们的重建代码使用Matlab编写，三维可视化通过开源软件（Volview, Kitware）实现。SD-OCT图像重建算法详见参考文献11，PAOM图像重建算法详见参考文献6和13。如有需要，可重复步骤3.7)–3.9)。</li>
	<li>实验结束后，关闭SD-OCT探测光源，立即将动物从固定装置中取出，并保持其温暖直至自然苏醒。将动物置于黑暗环境中额外静置一小时，以促进眼部恢复。对于有经验的操作者，整个实验过程（包括麻醉与成像采集）耗时少于30分钟。</li>
</ol>

<ol><li>Kinyoun, J. L., Martin, D. C., Fujimoto, W. Y., Leonetti, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ophthalmoscopy+versus+fundus+photographs+for+detecting+and+grading+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Ophthalmoscopy versus fundus photographs for detecting and grading diabetic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33 (6), 1888-1893 (1992).</li>
<li>Schuman, J. S., Wollstein, G., Farra, T., Hertzmark, E., Aydin, A., Fujimoto, J. G., Paunescu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+optic+nerve+head+measurements+obtained+by+optical+coherence+tomography+and+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparison of optic nerve head measurements obtained by optical coherence tomography and confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Am. J. Ophthalmol. 135 (4), 504-512 (2003).</li>
<li>Strøm, C., Sander, B., Larsen, N., Larsen, M., Lund-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+macular+edema+assessed+with+optical+coherence+tomography+and+stereo+fundus+photography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diabetic macular edema assessed with optical coherence tomography and stereo fundus photography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (1), 241-245 (2002).</li>
<li>Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Optical-resolution+Photoacoustic+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (51), e2729(2011).</li>
<li>Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+photoacoustic+microscopy+and+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography.</a> Nat. Photonics. 3 (9), 503-509 (2009).</li>
<li>Jiao, S., Jiang, M., Hu, J., Fawzi, A., Zhou, Q., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+ophthalmoscopy+for+in+vivo+retinal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging.</a> Opt. Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).</li>
<li>Wei, Q., Liu, T., Jiao, S., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+chorioretinal+vasculature+in+albino+rats+using+photoacoustic+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mod.+Optic%22%5BJournal%5D)">Image chorioretinal vasculature in albino rats using photoacoustic ophthalmoscopy.</a> J. Mod. Optic. 58 (21), 1997-2001 (2011).</li>
<li>Liu, T., Wei, Q., Wang, J., Jiao, S., Zhang, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H.F+Combined+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography+can+measure+metabolic+rate+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">H.F Combined photoacoustic microscopy and optical coherence tomography can measure metabolic rate of oxygen.</a> Biomed. Opt. Express. 2 (5), 1359-1365 (2011).</li>
<li>Yu, D., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Prog. Retin. Eye Res. 20 (2), 175-208 (2001).</li>
<li>Song, W., Wei, Q., Liu, T., Kuai, D., Burke, J. M., Jiao, S., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+photoacoustic+ophthalmoscopy+with+scanning+laser+ophthalmoscopy%2C+optical+coherence+tomography%2C+and+fluorescein+angiography+for+a+multimodal+retinal+imaging+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Integrating photoacoustic ophthalmoscopy with scanning laser ophthalmoscopy, optical coherence tomography, and fluorescein angiography for a multimodal retinal imaging platform.</a> J. Biomed. Opt. 17 (6), 061206(2012).</li>
<li>Mark, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMark%2C+E+%22Brezinski+Optical+Coherence+Tomography%3A+Principles+and+Applications%22">Brezinski Optical Coherence Tomography: Principles and Applications</a>. , Academic Press. (2006).</li>
<li>Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+photoacoustic+ophthalmic+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free photoacoustic ophthalmic angiography.</a> Opt. Lett. 35 (1), 1-3 (2010).</li>
<li>Zhang, H. F., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+subcutaneous+structures+using+functional+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of subcutaneous structures using functional photoacoustic microscopy.</a> Nature protocols. 2, 797-804 (2007).</li>
<li>Ling, T., Chen, S. L., Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+and+wide-directivity+ultrasound+detection+using+high+Q+polymer+microring+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity and wide-directivity ultrasound detection using high Q polymer microring resonators.</a> Appl. Phys. Lett. 98 (20), 204103(2011).</li>
<li>Xie, Z., Jiao, S., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-scanning+optical-resolution+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Laser-scanning optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> Opt. Lett. 34, 1771-1773 (2009).</li>
</ol>

所有实验动物操作均经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。

本文介绍了一种结合光声显微镜（PAOM）与谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对大鼠眼球进行同步体内视网膜成像的详细操作方法。基于光散射的SD-OCT可能是临床视网膜成像的“金标准”3；然而，它对视网膜内的光吸收不敏感。新近开发的PAOM是目前唯一一种基于光吸收的眼科成像技术，可提供视网膜的光吸收特性6。由于血红蛋白和黑色素是内源性强光吸收色素，PAOM能够在无需额外对比剂的情况下，实现对视网膜/脉络膜血管以及视网膜色素上皮（RPE）结构与功能的研究。
在光声显微成像（PAOM）中，由于未聚焦超声换能器的有限活性元件，其灵敏度区域受限（约 2.8×2.8 mm2）10，导致光声信号在视场（FOV）边缘处的检测灵敏度下降。因此，应仔细调节换能器的倾斜角度，以实现视网膜视场的均匀性。一种可能替代传统压电换能器的方案是采用微环谐振器，其具有更低的等效噪声压强值和更宽的检测指向性14，可能在PAOM中提供信噪比更高、更均匀的视网膜图像。与谱域光学相干断层扫描（SD...

集成光声眼底显微术与谱域光学相干断层扫描

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

多种非侵入性眼科成像技术极大地促进了主要眼病的临床诊断和基础研究。现有的视网膜成像方法，如眼底照相1、共焦扫描激光检眼镜（cSLO）2和光学相干断层成像（OCT）3，在监测疾病的发生与发展以及开发新的治疗策略方面具有重要贡献。然而，这些技术主要依赖于视网膜反射的光子。因此，与视网膜病理生理状态通常密切相关的视网膜光学吸收特性，无法通过传统成像技术获取。
光声眼底显微成像（PAOM）是一种新兴的视网膜成像技术，能够以高灵敏度检测眼部的光吸收对比度4-7。在PAOM中，纳秒激光脉冲经瞳孔导入并扫描眼后部，以诱导产生光声（PA）信号，这些信号由贴附于眼睑的非聚焦超声换能器检测。由于血红蛋白和黑色素具有强烈的光吸收特性，PAOM能够以高对比度无创地成像视网膜和脉络膜血管系统，以及视网膜色素上皮（RPE）中的黑色素6,7。更重要的是，基于已较为成熟的光谱光声成像技术5,8，PAOM有望实现视网膜血管中血红蛋白氧饱和度的映射，这对于研究多种致盲性疾病的生理与病理过程（如糖尿病视网膜病变和新生血管性年龄相关性黄斑变性）具有重要意义9。
此外，作为目前唯一基于光学吸收的临床眼科成像技术，光声眼成像（PAOM）可与成熟的临床眼科成像技术相结合，利用多种光学对比机制实现对眼部更全面的解剖与功能评估。6,10 . 在本研究中，我们整合了光声显微成像（PAOM）和谱域光学相干断层扫描（SD-OCT），以实现同步 体内 大鼠视网膜成像，可同时揭示视网膜的光学吸收和散射特性。本文介绍了系统配置、系统校准及成像采集过程。

图2 显示了在白化大鼠（A 和 B）和色素性大鼠（C 和 D）中同步获取的SD-OCT与PAOM二维眼底图像。在SD-OCT眼底图像（图2A 和 图2C）中，由于血红蛋白对探测光的吸收，视网膜血管呈现暗色。在白化大鼠眼中，PAOM除了可显示视网膜血管（图2B 中的 RV），还可可视化脉络膜血管（图2B 中的 CV），这是由于缺乏视网膜色素上皮（RPE）中的黑色素。而在色素性大鼠眼中，由于黑色素浓度较高，PAOM除视网膜血管外，还能高对比度地成像RPE（图2D）。所有视网膜成像的最大扫描角度为26度，图像采集时间约为2.7秒。为展示PAOM的三维成像能力，图2b 所示数据的三维体渲染图像见于图3。
<img alt="用于光子实验和光谱分析的光学激发装置示意图，包含标注的组件。" s...

光声眼科成像（PAOM）是一种基于光学吸收的成像技术，可为当前可用的眼科成像技术提供互补的视网膜评估。我们报道了将PAOM与谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）结合，用于大鼠视网膜的同步多模态成像。

主要眼病的临床诊断和基础研究在很大程度上受益于多种非侵入性眼科影像技术……

本实验的总体目标是演示光声眼底成像与谱域光学相干断层扫描技术的结合，以实现对小动物视网膜进行活体同步成像。首先通过散瞳并麻痹瞳孔括约肌来准备麻醉后的动物，随后利用实时谱域光学相干断层扫描（S-D-O-C-T）的横断面成像定位感兴趣的视网膜区域，并优化光学参数。将针式超声换能器接触动物的眼睑，以检测激光诱导的光声信号，并优化超声换能器的位置以获得最大信号幅度。最后的步骤是设定扫描参数，同时获取S-D-O-C-T和PAOM图像。最终，所采集图像中的光吸收对比度和光散射对比度可揭示视网膜循环和色素上皮中的微小功能变化，同时提供详细的视网膜解剖结构信息。检眼镜的增强技术是一种新近开发的眼科成像现代技术。该技术能够揭示视网膜的光学吸收对比度，因此在成像方面相较于现有模式具有潜在优势。视网膜脉络膜肌样网络以及视网膜色素上皮层的成像中，谱域光学相干断层扫描（Spectral domain optical coherence tomography, S-D-O-C-T）依赖于后向反射的光子来构建视网膜的三维图像，并已在临床中广泛应用。将PAOM与S-D-O-A-T结合，使我们能够获取更全面的视网膜解剖与功能信息。光声显微成像子系统包含一台N-D-Y-A-G激光器作为照明光源。输出的激光波长设为1064纳米，通过β硼酸钡晶体倍频至532纳米。八个晶体。激光谱线镜将此光束分开。然后，532 纳米的光通过单模光纤传输，而 1064 纳米的激光由光电二极管记录，用于触发光声信号的采集。来自单模光纤的激光通过振镜和望远镜结构传递至视网膜。将一个未聚焦的针式换能器与眼睑接触，用于检测视网膜产生的光声信号。在换能器尖端与动物眼睑之间涂抹超声耦合凝胶，以确保良好的声学耦合。光声信号由两个放大器放大，然后由数据采集板进行数字化。谱域光学相干断层扫描子系统（SD OCT）采用低相干光源，即宽带超辐射发光二极管，其决定了轴向分辨率为六微米。近红外光由一个50比50的商用单模光纤耦合器分束，将光传输至样品臂和参考臂。输送至OCT样品臂的光束通过一个热反射镜与PAOM的照明光合并。样品臂与PAOM共用相同的扫描和投送光学元件。最后，采用一台自制的光谱仪来记录S-D-O-C-T干涉信号，其中线阵CCD相机可实现每秒24千行的A扫描速率。为了对准这两个子系统，需要完成几个步骤。首先，最大化BBO晶体的频率倍增效率。其次，将PAOM的光纤输出激光准直至2.0毫米直径。第三，调整PAOM和S-D-O-C-T的组合照明光源，使其同轴。最后，将PAOM的激发光设置为约40纳焦耳每脉冲，将S-D-O-C-T的探测光设置为约0.8毫瓦。据报道，麻醉大鼠后，这两种设置均对眼睛安全。采用标准的异氟烷麻醉方案，将大鼠固定在自制的五轴可调固定装置中。为维持大鼠体温接近37°C，使用加热垫维持麻醉状态。在整个实验过程中，以每

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