F₁F_O ATP酶囊泡制备及线粒体亚微囊泡膜膜片钳记录技术

本实验的总体目标是从大鼠脑组织中分离出F1 F零APAs囊泡，以进行膜片钳记录。该过程首先从大鼠体内取出脑组织并进行匀浆处理；第二步是通过施加压力破坏突触区域。

接下来，将突触体分层加样至离心管梯度中。最后一步是用洋地黄皂苷和 L 孵育，以获得用于膜片钳记录的终末囊泡。线粒体的一个重要功能是通过氧化磷酸化产生 ATP。

负责 TP 生成的酶是位于线粒体内膜上的 ATP 合酶。为了深入研究 ATP 合酶的功能，我们分离出一种特殊的亚线粒体囊泡，称为 SMV。这些囊泡中的 ATP 合酶呈内外翻转的构型。

随后，我们使用膜片钳电极记录这些线粒体膜电位（SMVs），并测定其膜的通透性。这可以反映线粒体产生TP的效率。今天演示该实验步骤的是耶鲁大学我实验室的博士后研究员 Sylvia ti。

在此操作中，通过断头法获取大鼠头部后，切开皮肤以暴露颅骨，然后用剪刀或Rons轻轻切割颅骨并打开。随后取出脑组织，剔除小脑后将脑组织切碎并置于缓冲液中，再将其轻柔转移至5毫升玻璃聚四氟乙烯匀浆器中，匀浆10次，总时间约5分钟。之后，在台式离心机中，于4°C下以1,500 × g离心10分钟。

保留含有线粒体和突触体的上清液，弃去沉淀。然后在台式离心机中以16,000 × g、4°C离心10分钟。接着弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL分离缓冲液中，使用细胞破碎装置施加1,200 PSI压力处理10分钟以破坏突触体，随后迅速减压，将破碎后的突触组分分层加样至含有两种不同浓度Fial的离心管中，形成两层。

接下来将离心管放入SW 50.1转子中，在4°C条件下以126,500 ×g离心20分钟。在超速离心机中，沉淀部分为纯化的线粒体。菲亚尔（fial）不同密度之间的层为未破裂的突触体。

随后，将沉淀物在分离缓冲液中以16,000 × g离心10分钟，温度为4°C，使用台式离心机。然后，将线粒体重悬于200微升分离缓冲液中，并加入等体积的1%十二烷基肌氨酸钠。

置于冰上15分钟。接着，加入更多裂解缓冲液，在4℃条件下于16,000 × g离心10分钟。重复此步骤两次，然后将沉淀重悬于200 µL裂解缓冲液中，加入2 µL 10% Lu bra, PX，混匀后置于冰上15分钟。

随后，将混合物分层加入离心管中的分离缓冲液内。将离心管放入 SSW 50.1 转子中，在 4°C 条件下以 182,000 × g 离心一小时。一小时后。

将最终的样品在4°C条件下，用隔离缓冲液以16,000 × g离心10分钟进行洗涤。典型的电生理装置包括一个放大器、一台配备DigiData 1,440的PC计算机、一个与P-Clamp 10.0软件配合使用的模数转换器接口、操纵器、显微镜、隔振台和法拉第屏蔽笼。首先，使用拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制出玻璃微电极。

移液管的最佳电阻应在80至100兆欧之间。将亚线粒体囊泡加入生理细胞内溶液中，然后用相同的溶液填充膜片钳移液管。

在相差显微镜下观察囊泡。在室温下对SMVs进行膜片钳记录后进行显微观察。当膜电位分别维持在从负100毫伏到正100毫伏的电压范围内时，每段时间持续10秒，记录其电活动。

使用放大器电路对记录的数据进行5 kHz滤波，并用ClampFit 10.0软件进行分析。该图显示了由细胞质和线粒体制备的裂解液的印迹结果。上图显示了使用针对细胞质蛋白GAPDH的抗体进行的免疫印迹。

底部图示显示了使用针对线粒体内膜蛋白 Cox4 的抗体进行的印迹实验。此处展示了在添加 1 毫摩尔 ATP 前后两个具有代表性的膜片钳记录。钳制电位为 +70 毫伏。虚线代表零皮安电流线。

每条迹线记录时长为10秒，迹线之间间隔10秒并依次显示。以下是CMA指示剂在存在SMV的情况下以及在有或无ATP时荧光强度随时间变化的示例迹线。观看本视频后，您应充分掌握如何分离线粒体及含有F₁F₀-ATP合酶的亚线粒体囊泡。此外，您还应掌握如何在囊泡膜上使用电极形成高阻封接，以分析ATP合酶复合体的通道活性。