Name: 质量流式细胞术:协议，每日调整和执行细胞的样品上一个CyTOF的质量流式细胞仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习CyTOF质谱流式细胞仪的日常调试与样品分析流程，掌握仪器组装、参数优化、细胞数据采集及清洗关机步骤，确保信号强度与数据质量。

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我们感谢 Evan Newell 博士和 Sean Bendall 博士提供的反馈意见。我们还要感谢 DVS Sciences 公司以及 Sean Bendall 博士提供了含多种镧系元素的聚苯乙烯微球样品。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 2 U19 AI057229 的资助。

用于CyTOF的全部细胞样本必须进行固定和透化处理。这有助于含铱的DNA嵌入剂更好地进入细胞，同时可防止在注入质谱流式细胞仪前的MilliQ水洗涤及重悬步骤中发生细胞裂解。
1. 质谱流式细胞仪的启动
<ol>
 <li>打开 CyTOF 软件程序，选择仪器设置。在卡笼选项卡的右下角，点击加热器“开启”按钮。至少在预定使用时间前 15 分钟开启加热器，以确保喷雾室外套充分升温至 200 °C。</li>
 <li>将注射泵中的白色 Norm-Ject 3 ml 注射器更换为装有 MilliQ 水的新注射器。</li>
 <li>清洗雾化器。使用注射器和管路，通过较小的液体进样口和较大的气体进样口，反向冲洗 5% Citranox 溶液 2–3 次。随后用 MilliQ 水重复反向冲洗，以去除残留的 Citranox。</li>
 <li>检查 CyTOF 前面板上的指示灯是否如图 1所示点亮。</li>
</ol>
 <img alt="质谱流式细胞仪控制面板，用于细胞分析的CyTOF设置，等离子体关闭指示灯。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. CyTOF 启动前的面板指示灯状态。
 <ol start="5">
 <li>打开氩气罐阀门。此时前面板上的“ARGON”指示灯应亮起。</li>
 <li>将雾化器连接至载气入口。拧下载气管路接头，取下黑色橡胶O形圈和白色锥形塑料件。注意雾化器气体导入端接口杆上较宽的“凸缘”。将接头套在气体导入端口上，将黑色O形圈套在气口末端，并用力将O形圈推过接口杆较宽的部分。将白色锥形塑料件放在上方，窄端朝外，然后将其拧紧到载气管路上。</li>
 <li>将雾化器连接至液体进样管路。小心地将细管插入雾化器末端的开口中。插入时会有两个阻力点，类似于移液器的档位。首先轻压至遇到轻微阻力，此时细管末端应到达玻璃直管段的末端；其次用力继续压入，使玻璃直管段进一步插入接头中，然后拧紧螺帽接头以密封。将雾化器的末端插入加热套中的白色开口内。</li>
 <li>在仪器设置窗口的RFG控制器选项卡中，点击“Start Plasma”。由于雾化器已插入，点击“OK”。软件将启动冷却器、开启气体流动并点燃等离子体。检测器电压将逐步升高。完成后将弹出提示窗口，显示“Plasma start-up sequence has finished successfully”；点击“OK”。前面板上应有新的指示灯亮起（图2）。</li>
 </ol>
<img alt="质谱流式细胞仪控制面板，显示等离子体、冷却系统和氩气状态指示灯。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 质谱流式细胞仪在等离子体点燃并成功完成启动后的面板指示灯状态。
 <ol start="9">
 <li>开启注射泵。在屏幕右上角，按下绿色的“播放”按钮以启动注射泵，使液体流经管路并从雾化器喷出。默认的注射器设置为 3 ml 水。为了确保样品持续流经样品环，当注射泵中的水耗尽时，必须定期更换。屏幕顶部有一个计数器，用于显示已从注射泵流出的液体体积。当该计数器达到“3.000”或推杆到达注射器末端时，注射泵将自动停止。重新填充注射器时，必须点击“停止”按钮，而不是蓝色的“暂停”按钮，以重置计数器。</li>
</ol>
2. 质谱流式细胞仪的每日校准
<ol>
 <li>质谱流式细胞仪需要大约 20 分钟以建立稳定高温的等离子体，然后才能进行校准。调谐步骤的目的是在将“Gd155”（氧化物；La139+O16）信号控制在较高值的 3% 以下的同时，最大化 Tm169 或 Tb159 的目标信号。点击“采集设置”按钮以打开数据采集设置窗口。在“分析物”选项卡中，点击元素周期表以打开同位素选择面板。选择手册中列出的 DVS Sciences 调谐溶液中的同位素，然后点击“保存”。</li>
 <li>点击“每次读数的同位素”按钮以打开“每次读数的质量”窗口。选择“脉冲计数”，并通过输入新数值后按“回车”键来重新调整 y 轴刻度。</li>
 <li>用调谐溶液填充一支绿色的 1 ml Norm-Ject 注射器。将样品端口选择器转至“LOAD”位置，注入 450 μl 调谐溶液，然后将选择器转至“INJECT”位置。在数据采集设置窗口的“质量校准”选项卡中，点击“运行”以监测流经的各个质量峰。窗口左侧对应较低质量，右侧对应较高质量。注意：由于氩气中存在氙同位素，在 TOF 9400-9800 区域已有信号出现（图 3）。请等待调谐溶液的同位素在此显示中以条带形式开始出现（图 4）。</li>
</ol>
 <img alt="飞行时间质谱图；数据采集设置；质谱校准；飞行时间分析。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 质谱校准选项卡窗口，显示清洗液和水冲洗后各同位素的背景水平。飞行时间9400–9800区域对应氩气中的氙同位素，应始终存在。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="飞行时间质谱图；显示离子分离的光谱数据分析。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 质量校准选项卡窗口，显示 DVS 调谐溶液中各种同位素的垂直条纹。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 <ol start="4">
 <li>返回“每次读数的质量”窗口，然后按下左上角的绿色“播放”按钮。第 2.1 步中选择的每种同位素均由一条不同颜色的线表示。默认的 x 轴为“时间”，单位为秒。监测不同同位素的信号水平，直至其达到稳定状态。</li>
 <li>电流的调谐。在“数据采集设置”窗口的“参数”选项卡中，从下拉菜单中选择“电流”。设置起始值=0，终止值=10，步长=0.5，稳定时间=200，然后点击“保存”。返回“每次读数的质量”窗口并点击播放。此时 x 轴为“电流”。记录各同位素信号达到峰值的位置（图 5），并做好记录。在“仪器设置”窗口的“DAC 通道设置”选项卡中，向下滚动至“电流”项，并输入该新数值。点击“设置实际电流值”，然后点击“保存”。</li>
 </ol>
 <img alt="质谱图，强度与质量的关系，显示脉冲计数分析中的同位素（Xe、Cs、La）" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
 图 5. 当前调谐曲线。
 <ol start="6">
 <li>调节辅助气体。将下拉菜单更改为“辅助气体”。设置起始值=0.55，终止值=0.95，步长=0.05，稳定时间=200。点击保存。返回“每次读数的质量”窗口并点击运行。此时横轴为“辅助气体”流速。记录各同位素信号峰值对应的位置。观察“Gd155”信号在接近末端时的快速上升（图6）。返回DAC通道设置选项卡，向下滚动至“辅助气体”，输入此新数值。点击“设置当前实际值”，然后点击“保存”。</li>
</ol>
<img alt="元素从 Xe 到 Ir 的质谱脉冲计数图，显示光谱强度变化。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
 图 6. 补充气体调谐曲线。
 <ol start="7">
 <li>记录目标同位素与氧化物的比值。进行第二次测量 450 μl 注射调谐液。在参数选项卡中，从下拉菜单选择“时间”，设置起始值=0，结束值=10，步长=1，平衡时间=200。点击“保存”。在每次读数的质量窗口中点击“运行”。待曲线稳定后（图7），使用光标读取左上角方框中 Tm169 或 Tb159（较高值）的数值，以及“Gd155”的数值（&lt;较高值的3%）。这些数值也可保存在调谐文件中，以供日后参考。</li>
 </ol>
 <img alt="质谱图显示了随时间变化的Xe和Gd等元素的同位素脉冲计数。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
 图7. 优化电流和辅助气体后对调谐溶液信号强度的测量结果。
 <ol start="8">
 <li>清洗样品环。通过样品环注入 3 ml 的 MilliQ 水，随后注入 500 μl 的 DVS Wash Solution。在“质谱校准”选项卡中点击“运行”以监测清洗进程。持续清洗至条带信号强度（图 4）开始下降，接着再注入 3 ml 的 MilliQ 水，并持续监测直至信号降至背景水平（图 3）。</li>
</ol>
3. 运行样品
<ol>
 <li>打开采集窗口。默认设置为：实时分析（Do Analysis）= 开启，待分析信号（Signal to Analyze）= 双信号，双计数校准（Dual Count Calibration）= 数据模式，并已选择噪声抑制。如有需要，可修改上述任意设置。输入文件名。所有文件必须保存至E://驱动器。</li>
 <li>设置采集延迟。由于样品环与雾化器之间的管路长度，细胞事件的记录会存在约30秒的轻微延迟。因此，“采集延迟”与“检测器稳定延迟”的总和应至少为30秒，其中检测器稳定延迟应至少为20秒。</li>
 <li>设置数据采集时间。“采集时间”指您希望运行样品的秒数。填满整个450 μl样品环需要600秒才能完成。建议在运行时间结束后额外增加50-100秒，以尽量减少样品残留。</li>
 <li>样品重悬。为尽量减少仪器中盐分的积累，建议在细胞染色结束后至少用MilliQ水洗涤两次，最后用MilliQ水重悬细胞。用于重悬细胞沉淀的MilliQ水体积取决于起始细胞数量以及整个染色程序后的细胞回收率。一个合适的起始浓度为每毫升含106个（起始）细胞。重悬后，需通过细胞滤网过滤以去除聚集体。</li>
 <li>开始样品运行。为当前样品输入新的文件名。将样品环阀门切换至“LOAD”位置，注入样品，再将阀门切换回“INJECT”位置，然后点击采集窗口中的“Run”按钮。</li>
 <li>记录细胞事件。在快照窗口中，每个垂直的同位素/标记通道中的细胞将以水平排列的标记形式显示（图8）。虽然质谱流式细胞仪每秒可记录1,000个细胞，但通常在每秒300-500个细胞时能获得更佳的细胞事件分辨效果。这相当于每次屏幕刷新平均约1个细胞。细胞事件计数器可能需要长达30秒才开始上升，这是由于采用“实时”数据处理所致；所有细胞事件信息均不会丢失。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术数据分析、荧光强度图、细胞群体定量系统。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
 图8. 样本运行期间的采集窗口，显示与三个独立细胞事件相关的元素对应的水平排布的斑点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
 <ol start="7">
 <li>细胞事件的质量。注意每个同位素通道是否存在背景拖尾现象，以及细胞事件速率。质谱流式细胞仪将“细胞事件”识别为信号相对于背景的特定升高，因此游离金属或未结合抗体产生的背景信号可能影响“细胞事件”的计数。此外，细胞浓度过高可能导致双联体事件数量增加。通过增加洗涤次数或进一步稀释细胞可降低背景信号；通过更高程度的细胞稀释可减少双联体事件，但会延长运行时间。</li>
 <li>完成样本数据采集。当达到设定的采集时间后，数据采集将结束。随后会稍有延迟，才会弹出带有“OK”按钮的窗口；这同样是由于“实时”数据处理所致。也可通过点击“Stop”按钮提前终止样本采集。在此情况下，所有已记录的细胞事件仍将被计入并处理生成输出文件。</li>
 <li>在每个样本之间注入至少 500 μl 的 MilliQ 水，也有助于最大限度减少样本间的交叉污染。</li>
</ol>
4. 使用后清洁仪器
<ol>
 <li>清洗液。在运行完最后一个样品并用水冲洗样品环后，向样品环中注入 450 μl 清洗液。在数据采集设置窗口的质量校准选项卡中监测游离金属的释放情况，操作同步骤 2.8（图 9）。当游离金属信号开始下降时，用 3 ml MilliQ 水冲洗，并持续监测直至达到背景水平。</li>
</ol>
<img alt="质谱数据采集界面、飞行时间图、质量校准结果、离子检测。" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 9"> 
 图 9. 使用 DVS Wash 溶液进行运行后清洗时的质量校准选项卡窗口。飞行时间（TOF）区域 9800–11000 中的垂直条纹为正在从仪器中清除的抗体标记同位素。TOF 约 11500 处的垂直条纹对应两种铱嵌入剂同位素。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
5. 关闭仪器
<ol>
 <li>在仪器设置窗口的 RFG 控制器选项卡中，选择“停止等离子体”。当程序完成后，将弹出一个窗口提示您移除雾化器。点击“确定”。在卡笼选项卡中，关闭加热器。关闭氩气供应管路上的阀门。</li>
 <li>移除雾化器。通过小心向后拉的方式将雾化器从喷雾室中取出。拆下步骤 1.6 中的样品引入管路并放置一旁。松开辅助气体引入接口，稍微拧松后即可将雾化器拔出。保持接头部分连接在一起，可降低黑色橡胶 O 形圈和白色锥形塑料件丢失的风险。</li>
 <li>清洗雾化器。使用注射器和管路（如步骤 1.3 所述），用 5% Citranox 溶液对雾化器的两个端口进行反向冲洗。之后将其覆盖保存在 5% Citranox 溶液中，以备下次使用。</li>
</ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

两位作者均就职于斯坦福大学的人类免疫监测中心，该中心是一个服务性机构，仅收取用户费用以弥补检测成本，包括质谱流式细胞术的费用。

几十年来，荧光流式细胞术一直是分析单个细胞（包括表面表达和功能检测）的常用方法。然而，荧光染料的光谱重叠问题限制了可同时检测的标记物数量。尽管已有使用超过12种同时标记的实验报道，但所需的补偿量使得该技术操作上极为困难。
与荧光染料不同，DVS Sciences 公司开创的质量流式细胞术使用带有金属螯合位点的聚合物作为抗体的标记物。1-3 由于所用金属纯度高，且电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）具有优异的质量分辨率，因此几乎不存在“光谱重叠”现象。由于大多数所用元素在生物学上无相关性，因此也几乎不会产生导致“自发荧光”的背景信号。这些优势使得在单次实验中可同时检测超过 30 种标记物。6,7 此外，ICP-MS 的信号动态范围也比典型的荧光实验更宽。
然而，质谱流式细胞术存在一些局限性。它是一种破坏性技术：细胞无法回收用于分选或进一步实验。质谱流式细胞仪对金属元素的存在有严格要求：如果某种金属不存在，则细胞将无法被检测到。这是使用金属螯合DNA嵌入染料的主要原因，以确保准确的“亲代...

<table><tbody><tr><td>CyTOF 质谱流式细胞仪</td><td>DVS Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>清洗液</td><td>DVS Sciences</td><td>201071</td><td>含 0.05% 氢氟酸的水溶液</td></tr><tr><td>调谐液</td><td>DVS Sciences</td><td>201072</td><td>含 0.5 ppm 镧、铯、铽、铥、铱及痕量硝酸</td></tr><tr><td>含铕的聚苯乙烯微球</td><td>DVS Sciences</td><td>201073</td><td>含有天然丰度的铕同位素；微球供应浓度约为 100 万个/毫升</td></tr><tr><td>多镧系元素（镧/镨/铽/铥/镥）聚苯乙烯微球</td><td>DVS Sciences</td><td>尚未商业化供应</td><td>含有所列镧系元素的天然丰度同位素</td></tr><tr><td>硝酸（浓）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A467-500</td><td>Optima 痕量金属纯级，适用于 ICP-MS</td></tr><tr><td>带细胞滤网盖的聚苯乙烯圆底管（5 ml）</td><td>BD</td><td>352235</td><td>用于样品进样前过滤细胞</td></tr><tr><td>Norm-Ject 结核菌素注射器（1 ml）</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>无硅油、无乳胶</td></tr><tr><td>Norm-Ject 注射器（3 ml）</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.000V0</td><td>无硅油、无乳胶</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td>18 M&amp;#937; 纯水；不得储存在用市售洗涤剂清洗过的玻璃或塑料瓶中（因其中含有高浓度的钡）。</td></tr><tr><td>Citranox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273236</td><td>酸性洗涤剂</td></tr><tr><td>氩气</td><td>Praxair</td><td>AR 5.0UH-T</td><td>99.999% 超高纯度</td></tr></tbody></table>

质谱流式细胞术：在cytof质谱流式细胞仪上进行日常校准与细胞样本检测的操作方案

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

近年来，单细胞的快速分析通常采用流式细胞术和荧光标记抗体来实现。然而，荧光团发射光谱的重叠问题限制了可同时使用的探针数量。相比之下，DVS Sciences 公司推出的新型 CyTOF 质谱流式细胞仪将液体单细胞进样系统与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）相结合。1 该技术不使用荧光团，而是将含有高纯度金属同位素的螯合聚合物连接到抗体或其他特异性探针上。2-5 由于质谱流式细胞仪所用金属的纯度高且具有优异的质量分辨率，相邻同位素之间不存在“光谱重叠”，因此无需进行补偿矩阵校正。此外，由于使用了镧系金属，样品无生物背景信号，也就不存在类似自发荧光的干扰。在原子质量数 103–203 的检测范围内，理论上可同时区分多达 100 种标签。目前，利用 DVS Sciences 提供的螯合试剂，已有超过 35 个检测通道可用，使得对样本免疫学特征的解析达到前所未有的深度。6-7
质谱流式细胞术的缺点包括每个探针必须使用独立的金属同位素（无前向或侧向散射的等效信号），以及该技术具有破坏性（无法进行分选回收）。目前质谱流式细胞仪的配置细胞传输率仅为约25%，因此需要输入更多的细胞数量。
质谱流式细胞仪每日最佳性能的实现需要多个步骤。优化的基本目标是在最大化目标金属同位素（M）信号强度的同时，尽量减少氧化物（M+16）的形成，因为氧化物会降低M处的信号强度，并干扰在M+16处任何期望的信号。第一步是预热仪器，以建立一个高温且稳定的电感耦合等离子体（ICP）源。第二步是每日优化电流和载气流速的设置。在样本采集过程中，细胞事件的最大速率受限于检测器效率和处理速度，为1000个细胞/秒。然而，根据样本质量，通常更理想的是采用较慢的细胞事件速率（300–500个细胞/秒），以便更好地分辨细胞事件，从而最大限度地获得完整单细胞，减少双联体和碎片。最后，每天实验结束后对仪器进行充分清洗，有助于最大限度地减少游离金属引起的背景信号。

遵循上述方案应实现以下四个目标。第一，为质谱流式细胞仪提供充足的预热时间，可产生高温且稳定的等离子体，这对于获得最佳信号以及最大限度减少氧化物形成至关重要。第二，使用 MilliQ 水和 DVS Wash 溶液对质谱流式细胞仪进行充分清洗（图9），有助于降低金属在管路及其他部件上的吸附水平，从而减少样本采集过程中的背景信号（图8）。此外，还可清除可能卡在仪器中的细胞，进而最大限度减少样本之间的交叉残留。第三，尽管无法完全避免氧化物的形成，但对质谱流式细胞仪进行适当的调谐（图5-7），可在目标质量数 M 处优化总信号强度，同时最小化质量数 M+16 处的氧化物背景信号。如图10所示，调谐不当（品红色）与正确调谐的样本（深蓝色）相比，显著增加了 M+16 处的氧化物形成。这会导致目标质量数 M 处的信号略有下降，而在 M+16 处产生显著增强的非特异性背景干扰。
最后，使用缓冲液充分洗涤样本，并最终用 MilliQ 水洗涤，可将金属/抗体背景信号降低...

本文描述了对CyTOF质谱流式细胞仪进行日常校准和性能优化所必需的步骤，并讨论了样品制备和流速优化的相关建议。

质谱流式细胞术：在CyTOF质谱流式细胞仪上进行日常校准与细胞样本检测的操作方案

近年来，单细胞的快速分析通常采用流式细胞术和荧光标记抗体进行。然而，……

本实验流程的主要目标是演示如何在CyTOF仪器上进行正确的日常校准及样品分析。首先，组装仪器并开机。随后，优化仪器参数设置，使调谐信号达到最大值。此时，仪器已准备就绪，可开始运行样品。最后一步是清洁仪器并关闭电源。最终，可根据特定的时间要求获取最佳的细胞数据。该技术的可视化演示至关重要。日常的设置、调试和清洁程序难以仅通过手册学习，因为涉及多个同时进行的软件操作步骤。您需要积累经验，以掌握适当的背景水平和信号强度。在开始实验前至少15分钟，打开CyTOF软件程序并选择仪器设置。然后在卡笼选项卡中，单击加热器开启按钮，使喷雾室外套温度升至200摄氏度。将注射泵中的注射器更换为装有超纯水的新注射器。然后通过每个端口用5%柠檬酸反向冲洗雾化器两次，以清洗雾化器。为去除残留的柠檬酸，再用超纯水重复反向冲洗。接下来，打开氩气瓶阀门，使仪器前面的氩气指示灯亮起。然后将雾化器连接至载气入口，并将雾化器连接至液体进样管路。将雾化器末端插入仪器设置窗口中RFG控制器标签页上加热套上的白色开口处。单击“启动等离子体”，然后单击“确定”。启动完成后，在弹出窗口中再次单击“确定”。现在打开注射泵。重新填充注射器时，应按下停止按钮而非暂停按钮，以重置体积计数器。在校准质谱流式细胞仪之前，确保仪器已预热20分钟。待仪器稳定后，单击采集设置按钮，打开数据采集设置窗口。在分析物选项卡中。单击元素周期表以打开同位素选择面板。然后在手册列出的 DVS Sciences 调谐溶液中选择相应的同位素，然后单击保存。接着，单击每次读数的同位素按钮，以打开每次读数的质量窗口。选择脉冲次数，并通过输入新数值后按回车键重新调整 y 轴刻度。现在，用一毫升绿色标准注射器吸取调谐溶液。将样品进样口选择阀转至“加载”位置。注入450微升调谐溶液，然后将选择器转至注入位置。等待调谐溶液的同位素在此显示中开始以条带形式出现。飞行时间9,400至9,800区域内的信号来源于氩气中的氙同位素。现在返回到每次读数的质量窗口，然后点击绿色播放按钮。每条彩色线条代表来自分析物选项卡中选定的同位素。当同位素信号水平稳定后，在数据采集设置窗口的参数选项卡中，从下拉菜单选择当前调谐电流。在起始窗口中，将“结束”设为0，输入10；步长值输入0.5，稳定时间输入200。然后点击保存。然后返回“每次读数的质量”窗口并点击播放。记录下同位素信号峰值位置后，进入仪器设置窗口的 DAC 通道设置选项卡。向下滚动至电流项，并输入同位素峰值数值。单击设置实际电流值，然后保存。接下来，更改下拉菜单为配气模式。在起始窗口中输入 0.55，在结束窗口中输入 0.95，在步长值窗口中输入 0.05，在稳定时间窗口中输入 200。单击保存。返回“每次读数的质量”窗口并再次单击播放后，x 轴将显示载气流速。注意同位素信号达到峰值时的数值，并观察 GD 1 55 信号在末段附近的快速上升。然后返回到 DAC 通道设置选项卡。向下滚动至补妆气（makeup gas）部分，输入新的同位素峰数值，然后点击“设置实际当前值”。然后再次点击保存，以记录目标同位素与氧化物的比值。首先，进行第二次450微升调谐溶液进样。接着，在参数选项卡中，从下拉菜单选择“时间”，在起始窗口输入0，在结束窗口输入10，在步长值窗口输入1，在稳定时间窗口输入200。在质量读数窗口中点击播放后，使用光标读取 TM 1 69 或 TB 1 59 的较高值，同时读取 GD 1 55 的数值。随后，通过样品环注入三毫升 Milli Q 水，接着注入 500 微升 DVS 清洗液。在质量校准选项卡中，点击运行以监测清洗过程的进展，直至条带强度开始下降。然后加入三毫升的milliQ水，并监测直至条带降至背景水平。首先输入刚刚针对调谐溶液同位素所演示的样品同位素，然后点击保存。接下来，打开采集窗口，并根据样品体积的需要调整采集参数。例如，450 微升的样本将充满样本环路，运行需要 600 秒，以允许细胞数据采集过程中的延迟。运行前，将采集延迟设置为至少 30 秒，检测器稳定延迟设置为至少 20 秒。使用 Milli-Q 水将细胞样本清洗至少两次，然后将样本重悬于最大浓度为每毫升 10 的 6 次方个细胞的溶液中，并通过 35 微米细胞筛过滤所得细胞悬液。为去除任何聚集体。现在为当前样品输入新的文件名。请注意，所有文件必须保存到 E 盘。然后将样品环阀门切换至加载位置，注入样品，再将样品环阀门切换回注入位置，随后点击运行。在采集窗口中，细胞将以每个垂直同位素通道中水平排列的信号标记形式显示，并在每秒300至500个细胞的范围内表现出最佳分辨率，如此处所示。当样品的数据采集完成后，将弹出一个窗口。单击“确定”以确认样品运行结束，随后在每个样品之间注入至少 500 µL 的超纯水，以尽量减少样品间的残留，清洁仪器。使用后，向样品环中注入 450 µL 的清洗液。监测游离金属的释放情况，然后用 3 mL 的超纯水冲洗样品环，并持续监测清洗过程，直至达到背景本底水平。然后关闭仪器，选择仪器设置窗口中的 RFG 控制器选项卡，点击停止等离子体。当程序完成后，在弹出窗口中点击“确定”，建议在卡笼选项卡下移除雾化器。关闭加热器，关闭氩气供应管路上的阀门，然后小心地向后拉动雾化器，将其从喷雾室中取出。接下来，拧下样品引入管路并将其放置一旁。拧松辅助气体引入接口直至略微松动，然后取下雾化器。最后，使用之前演示过的同一支注射器和管路，用5% Citron溶液清洗雾化器的两个端口，并将雾化器浸泡在5% Citron溶液中保存，直至下次使用。使用超纯水（UE water）和 DVS 清洗液对质谱流式细胞仪进行充分清洗，可降低金属在管路及其他部件上的吸附，从而减少如图中所示的背景信号。如品红色线所示，调谐不当会显著增加质荷比 m+16 处的氧化物形成，与深蓝色线代表的正确调谐样本相比，这会导致目标信号 m 处的强度轻微下降，同时在 m+16 处显著增加非特异性背景干扰。使用超纯水对样本进行充分清洗和适当稀释，可在保证实验速度的同时，最大限度地降低背景信号并获得最佳的细胞分辨率。在本实验中，与此处所示代表性实验数据类似，采用细胞采集模式检测了含有天然丰度的镧-139、钠-140、铽-159、镝-169和镥-175的聚苯乙烯微球。数据使用FlowJo软件进行分析，并设门排除破碎微球产生的碎片干扰。经正确调谐的样品确定在 0.74 升/分钟的流速下，如深蓝色线所示。在此流速下观察到的信号强度高于较低流速下的信号强度，并且与未正确调谐的信号相比，该正确调谐的样品在 M 金属质量处的信号更高，而在 m+16 氧化物质量处的信号更低。此处展示了镧 139 和铥 169 处信号的放大图。请注意，载气流速对镧 139 信号强度的影响大于对铥 169 信号强度的影响。这些图显示了 m+16 氧化物质量数 155 和 180.5 处的信号，分别对应于镧 139 加 OH 16 和铥 169 加 OH 16 的氧化物。请注意，随着载气流速的增加，质量数 155 的信号增强程度明显高于质量数 180.5 的信号，因为镧 139 比铥 169 更容易被氧化。此处展示了信号强度 m 及 m+16 随载气流速变化的关系。实心图标代表质量为 M 的信号，空心图标代表质量为 M+16 的信号，线条颜色对应相应的质量 M。请注意，镧-139 和镨-141 的信号强度受载气流速影响显著，甚至在某些条件下，M+16 氧化物的信号强度超过质量为 M 的信号强度。观看本视频后，您应能够充分掌握 CyTOF 仪器的正确启动、优化调谐、样本运行，以及每日实验结束后的彻底清洗与关机操作。

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