质谱流式细胞术：在CyTOF质谱流式细胞仪上进行日常校准与细胞样本检测的操作方案

本实验流程的主要目标是演示如何在 CyTOF 仪器上进行正确的日常校准及样品分析。首先，组装仪器并开机。接着，优化仪器设置，使调谐达到最大信号强度。

此时，仪器已准备就绪，可开始运行样品。最后一步是清洁仪器并关闭电源。最终，可根据特定的时间要求获取最佳的细胞数据。

该技术的可视化演示至关重要。日常的设置、调谐和清洁程序难以仅通过手册学习掌握，因为涉及多个同时进行的软件操作步骤。

您需要积累一定经验，才能掌握适当的背景水平和信号强度。在开始实验前至少15分钟，打开CyTOF软件程序并选择仪器设置。然后在卡笼选项卡中，点击加热器开启按钮，使喷雾室外套温度升至200摄氏度。

将注射泵中的注射器更换为装有超纯水的新注射器。然后通过每个端口用5%柠檬酸反向冲洗雾化器两次，以清洗雾化器。为去除残留的柠檬酸，再用超纯水重复反向冲洗。

接下来，打开氩气瓶阀门，使仪器前面的氩气指示灯亮起。然后将雾化器连接至辅助气体进气口，并将雾化器连接至液体引入管路。将雾化器末端插入仪器设置窗口中RFG控制器标签页上加热套的白色开口处。

单击“启动等离子体”，然后单击“确定”。启动完成后，在弹出窗口中再次单击“确定”。现在打开注射泵。

重新填充注射器时，应按下停止按钮而非暂停按钮，以重置体积计数器。在校准质谱流式细胞仪之前，务必确保仪器已预热20分钟。待仪器稳定后，单击采集设置按钮以打开数据采集设置窗口。在分析物选项卡中。

单击元素周期表以打开同位素选择面板。然后在手册列出的 DVS Sciences 调谐溶液中选择相应的同位素，然后单击保存。接下来，单击每次读数的同位素按钮，以打开每次读数的质量窗口。

选择脉冲次数，并通过输入新数值后按回车键重新调整 y 轴刻度。现在，用调谐液填充一支绿色的一毫升标准注射器。将样品进样口选择阀转至“加载”位置。

注入450微升调谐液，然后将选择器转至注入位置。等待调谐液同位素在此显示界面中以条带形式出现。飞行时间9,400至9,800区域内的信号来源于氩气中的氙同位素。

现在返回到每次读数的质量窗口，然后点击绿色播放按钮。每条彩色线条代表来自分析物选项卡中选定的同位素。当同位素信号水平稳定后，在数据采集设置窗口的参数选项卡中，从下拉菜单选择当前调谐电流。

在起始窗口中，将“结束”设为0，输入10；步长值输入0.5，稳定时间输入200，然后点击保存。

然后返回“每次读数的质量”窗口并点击播放。记录同位素信号峰的位置后，进入仪器设置窗口的DAC通道设置选项卡。向下滚动至“电流”项，并输入同位素峰的值。

单击设置实际电流值，然后保存。接下来，更改下拉菜单以配置混合气体。在起始窗口中输入0.55，在结束窗口中输入0.95，在步长值窗口中输入0.05，在稳定时间窗口中输入200。

点击保存。返回“每次读数的质量”窗口并再次点击播放后，x 轴将显示载气流速。记录同位素信号达到峰值时的数值，并观察接近结束时 GD 1 55 信号的迅速上升。

然后返回到 DAC 通道设置选项卡。向下滚动至增益、气体部分，并输入新的同位素峰值得。点击设置实际电流值。

然后再次点击保存，以记录目标同位素与氧化物的比值。首先，进行第二次450 µL调谐溶液进样。接着，在参数选项卡中，从下拉菜单选择“时间”，在起始窗口输入0，在结束窗口输入10，在步长值窗口输入1，在稳定时间窗口输入200。

在质量读数窗口中点击播放后，使用光标读取 TM 1 69 或 TB 1 59 的较高值，同时读取 GD 1 55 的数值。随后，通过样品环注入 3 毫升 Milli Q 水，接着注入 500 微升 DVS 清洗液。在质量校准选项卡中，单击运行以监测清洗过程的进展，直至条纹强度开始下降。

然后加入三毫升的 Milli-Q 水冲洗，并持续监测直至条带降至背景水平。首先输入刚刚针对调谐溶液同位素所演示的样品同位素信息，然后点击保存。接下来，打开采集窗口，并根据样品体积的需要调整采集参数。

例如，450 微升的样本将充满样本环路，运行需要 600 秒，以允许细胞数据采集过程中的延迟。运行前，将采集延迟设置为至少 30 秒，检测器稳定延迟设置为至少 20 秒。使用超纯水将细胞样本清洗至少两次，然后将样本重悬于最大浓度为每毫升 10 的 6 次方个细胞的溶液中，并通过 35 微米细胞滤网过滤所得细胞悬液。

为去除任何聚集体。现在为当前样品输入新的文件名。请注意，所有文件必须保存到 E 盘。

然后将样品环阀切换至加载位置，注入样品，再将样品环阀切换回注入位置，接着在采集窗口中点击运行。细胞将在快照窗口中以每个垂直同位素通道内的水平标记集合形式显示，并在每秒300至500个细胞范围内表现出最佳分辨率，如此处所示。

当样品的数据采集完成后，将弹出一个窗口。单击“确定”以确认样品运行结束，然后在每个样品之间注入至少500微升的MQ水，以尽量减少样品残留，清洁仪器。使用后，向样品环中注入450微升清洗液。监测游离金属的释放情况，然后用3毫升的Milli-Q水冲洗样品环，并监测清洗过程，直至达到背景信号水平。

然后关闭仪器时，选择仪器设置窗口中的 RFG 控制器选项卡，点击停止等离子体。当程序完成后，在弹出窗口中点击“确定”，建议在卡笼选项卡下移除雾化器。关闭加热器，关闭氩气供应阀，然后小心地向后拉动雾化器，将其从喷雾室中取出。

接下来，拧下样品引入管并将其放置一旁。拧松载气引入接口直至略微松动，然后取下雾化器。最后，使用之前演示过的同一支注射器和管路，用5% Citron清洗雾化器的两个端口，并将雾化器浸泡在5% Citron溶液中保存，直至下次使用。

使用超纯水和DVS清洗液对质谱流式细胞仪进行充分清洗，可降低金属在管路及其他部件上的吸附水平，从而减少如图中所示的背景信号。由品红色线表示的不当调谐会显著增加m+16处的氧化物形成，与由深蓝色线所示的正确调谐样本相比，这会导致在m处的目标信号略有下降，同时在m+16处产生显著增强的非目标背景干扰。

使用超纯水对样本进行充分清洗和适当稀释，可在保证实验速度的同时，最大限度地降低背景信号并获得最佳的细胞分辨率。在本实验中，与此处所示代表性实验数据类似，采用细胞采集模式检测了含有天然丰度镧-139、钠-140、铽-159、镝-169和镥-175的聚苯乙烯微球。数据使用FlowJo软件进行分析，并设门排除了任何破碎微球产生的碎片信号。

经正确调谐的样品流速确定为 0.74 升/分钟，如深蓝色线所示。在此流速下观察到的信号强度高于较低流速下的信号强度，并且与未正确调谐的信号相比，该正确调谐的样品在 M 金属质量处具有更高的信号，而在 m 加 16 氧化物质量处的信号更少。此处展示了镧-139 和铥-169 在 M 质量处信号的放大图。

请注意，载气流速对镧-139（LANTHANUM 139）信号强度的影响大于对铥-169（thulium 169）信号强度的影响。这些图显示了质量数为155和180.5处的氧化物信号，分别对应于镧-139加羟基（LANTHANUM 139 plus OH 16）和铥-169加羟基（thulium 169 plus OH 16）的氧化物。由于镧-139比铥-169更容易被氧化，因此随着载气流速的增加，质量数155处的信号强度增长远大于质量数180.5处的信号强度。

此处展示了信号强度 m 及 m+16 随载气流速变化的关系。实心图标代表质量为 M 的信号，空心图标代表质量为 M+16 的信号，线条颜色对应各自的质量 M。请注意，镧-139（LANTHANUM 139）和镨-141（PRASEODYMIUM 141）的信号强度受载气流速影响显著，甚至在某些条件下，质量为 M+16 的氧化物信号强度超过了质量为 M 的信号。观看本视频后，您应能够充分掌握如何正确启动 CyTOF 仪器、对其进行调谐、运行样品，以及在每日实验结束时正确清洗并关闭仪器。