Name: 调查轻度创伤性脑损伤海马电路功能的改变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习使用电生理技术、电压敏感染料和侧向液压冲击损伤模型研究轻度创伤性脑损伤后海马环路功能的变化。该方法结合行为学评估揭示突触效能改变的区域特异性机制。

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作者谨此感谢 Elliot Bourgeois 提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R01HD059288 和 R01NS069629。

1. 侧向液体脉冲损伤
<ol>
 <li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。然后使用碘伏擦拭小鼠头部，为切口做准备。</li>
 <li>使用外径为 3 mm 的环钻在右侧顶骨区域进行颅骨切除术。</li>
 <li>使用氰基丙烯酸酯和牙科丙烯酸树脂将鲁尔锁针座（内径 3 mm）固定在颅骨缺损处。</li>
 <li>24 小时后，通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
 <li>待呼吸恢复正常后，但在小鼠尚未对刺激产生反应之前，通过液体冲击损伤装置向颅内注入持续 20 毫秒的生理盐水脉冲。</li>
 <li>损伤后立即移除针座，使用异氟烷再次麻醉小鼠，并缝合头皮。 
 假手术对照组将接受与上述相同的操作，但省略第 1.5 步。</li>
</ol>
2. 行为分析 - 条件性恐惧反应
<ol>
 <li>在进行条件性恐惧反应（CFR）训练前的连续两天内对小鼠进行抓握适应。</li>
 <li>将小鼠放入条件化室中适应3分钟，随后给予1.5 mA的足底电击，持续2秒。电击后让小鼠在室内再停留30秒。</li>
 <li>经过一段延迟期（通常为24小时）后，将小鼠重新放回条件化室中，持续5分钟。每5秒记录一次小鼠的僵直（freezing）行为。 
 分析内容包括比较两组小鼠在僵直行为上所花费时间的相对比例，在本实验中为脑损伤小鼠与假手术对照组。与对照组相比，僵直率降低表明小鼠无法维持环境与足底电击之间的关联记忆，提示存在记忆障碍和认知功能障碍。</li>
</ol>
3. 制备急性海马脑片
*注意：使用麻醉罐进行麻醉仅可用于终末性操作（例如本文所述的脑组织解剖）。
<ol>
 <li>损伤后7天，配制1 L人工脑脊液（aCSF）和250 ml蔗糖切片液。</li>
 <li>大量使用冰块，确保脑片制备过程中所用的所有仪器和溶液均保持冰冻状态。</li>
 <li>使用异氟烷麻醉小鼠，迅速而轻柔地取出小鼠脑组织并置于蔗糖溶液中。</li>
 <li>修剪脑组织，将其放置在琼脂块前方一滴超级胶水的切片表面上。</li>
 <li>切割350 μm厚的冠状切片，应可获得4至5片包含完整海马回路的脑片。</li>
 <li>将脑片在37 °C下孵育至少1小时。</li>
</ol>
4. 细胞外场电位记录
<ol>
 <li>使用垂直拉制仪将硼硅酸盐玻璃电极拉至 2-5 MΩ。</li>
 <li>将脑片放入记录 chamber，并将电极安装到电极夹持器上。</li>
 <li>将刺激电极插入脑片中的轴突通路（如穿通通路或 Schaffer 侧支），同时将记录电极缓慢下降至适当位置，并实时监测输出信号，以确保两根电极处于相同的 z 轴水平（深度）。当获得最大反应且刺激电流保持恒定时，表明两电极已处于同一深度。</li>
 <li>所得记录信号包含三个组分：突触前纤维群峰电位（fiber volley）、场兴奋性突触后电位（fEPSP）以及突触后群体峰电位（population spike）。在某些制备条件下，这些组分在时间上可能重叠，增加分析难度。若难以区分反应属于突触前还是突触后来源，可向灌流液中加入 APV 和 CNQX 以阻断兴奋性突触传递，此时剩余的所有信号均来源于突触前成分。</li>
 <li>通过不同的刺激方案可实现三种不同的实验类型：输入/输出曲线、双脉冲记录以及长时程可塑性实验。 
 分析通常包括比较脑损伤小鼠与假手术对照组之间 fEPSP 斜率的差异，同时通过测量纤维群峰电位来校正输入强度。</li>
</ol>
5. 可视化膜片钳记录
<ol>
 <li>制备脑片、电极和记录装置，进行记录，具体步骤如上文第4.2步之前所述。</li>
 <li>仅选择位于组织深度超过80 μm的细胞，因为靠近表面的细胞可能已死亡或连接性降低。使用正压推进电极接近细胞，以确保电极在穿过组织时不会堵塞。当电极轻轻接触细胞时，施加负压，以在电极与细胞膜之间形成“吉欧封接”（gigaseal）。</li>
 <li>施加短暂的负压脉冲，以破裂电极下方的细胞膜，实现全细胞记录构型。</li>
 <li>使用放大器消除电容瞬变，并对串联电阻进行补偿。对细胞的串联电阻进行补偿对于确保测量结果的准确性至关重要。</li>
 <li>可进行两种模式的单细胞记录：电流钳（测量膜电位）和电压钳（测量通过膜上离子通道的电流）。 
 分析方法多种多样，但在本实验中，主要为生物物理分析，定量测定脑损伤小鼠和假手术对照小鼠中自发性突触电流的发生速率和幅度。</li>
</ol>
6. 电压敏感性染料成像（VSD）
<ol>
 <li>制备脑片并搭建记录系统，步骤同上文所述至第4.2步。</li>
 <li>通过将1 mg di-3-ANEPPDHQ溶解于50 μl乙醇中配制染料储备液；分装为每管2 μl，铝箔包裹后于-20 °C保存。实验当天用aCSF按1:200稀释制备工作液。</li>
 <li>将脑片置于经aCSF润湿的滤纸上孵育，并加入90 μl染料染色16分钟；随后用aCSF冲洗，放入界面式记录室中。</li>
 <li>调节光刺激强度，使反应信号位于相机检测范围的中间区域。图像采集速率通常为每秒500–1,000帧。</li>
 <li>在电刺激开始前200毫秒触发光刺激快门，以使初始快速光漂白效应趋于稳定。交替进行电刺激与非电刺激的采集试验，以便后续减去无刺激背景信号。在打开快门前记录闭合快门状态下的静息光强（即荧光本底读数）。每次电压敏感染料（VSD）试验将获得一个由x像素×y像素×时间构成的荧光读数“动态图像”。在每种测试条件下记录10–12次VSD试验。</li>
 <li>所有测量均基于像素内电刺激前归一化的荧光变化量dF/F进行计算，具体方法如下： 
 从VSD原始采集数据中减去静息光强。对每次试验中的每个像素，以其电刺激前的平均值进行归一化，再减去1。对电刺激和非电刺激试验均执行此操作。利用非电刺激试验生成一个平均“背景荧光”试验数据，再从电刺激试验中减去该背景信号。后续分析通常基于10–12次此类试验的平均结果进行，且一般会对数据在空间和时间维度上进行滤波处理，以提高信噪比。</li>
</ol>
7. 用于生化分析的区域解剖
<ol>
 <li>按照先前所述方法从小鼠中取出脑组织。</li>
 <li>使用组织切片机制备脑片。</li>
 <li>将切片平铺，显微解剖分离CA1区和DG区。</li>
 <li>立即浸入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，液氮速冻后于-80 °C保存。</li>
</ol>
8. 代表性结果
我们的实验通常从行为学数据开始，以确认脑损伤小鼠中存在的预期认知缺陷。我们采用情境性条件恐惧反应测试，因为这是一种依赖于海马的功能性行为，具有可靠性，且仅需一次训练和一次测试。图 2 所示数据代表用于测量顺行性记忆的行为学测试；然而，如果在损伤前进行训练，则该测试也可用于测量逆行性记忆。
通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSPs）来评估大量细胞的总体突触效能（图3A）。我们通常采用三种不同的刺激模式，每种模式可获得特定的结果并得出相应的结论。首先，通过逐步增加刺激强度，绘制出输入/输出曲线（图3B/C）。
接下来，通过以短暂间隔（通常为50毫秒）递送两次相同强度的刺激，我们可研究突触囊泡释放概率的潜在变化；此外，我们还常进行长时程增强（LTP）实验。在建立基础反应后，以相同强度施加短暂的高频刺激（通常为100 Hz），从而引发细胞内级联反应，当恢复常规刺激时，突触反应将被增强。
通过全细胞膜片钳技术，可以以两种模式记录细胞的电活动。在电压钳模式下，实验人员通过与放大器相连的计算机软件控制膜片钳细胞相对于浴液的膜电位。在此模式下记录的是介导突触后事件的电流，可提供关于突触前递质释放频率、被激活的突触后受体数量以及囊泡内神经递质浓度的信息（图4A）。在电流钳模式下，实验人员操控注入电流并测量电压反应，可用于确定动作电位的特性，例如动作电位阈值和半宽。这些特性可根据神经元的动作电位发放模式，对其功能进行分类，判断其为兴奋性或抑制性神经元（图4B）。为验证细胞身份，我们建议在记录后向细胞内灌注荧光黄（Lucifer Yellow），并通过观察树突棘的存在与否来直观确认细胞类型（图4C, D）。
使用电压敏感性染料测量膜电位变化的实验结果示例如图5所示。在本例中，刺激电极被放置于Schaffer侧支通路，进而分析CA1区的神经元活动。电压敏感性染料并不报告膜电位的绝对值，而是报告相对于无刺激时基础状态的电压变化。然而，通过比较两种条件（例如 脑损伤组与假手术组）的分析，可确定无法通过fEPSPs或全细胞膜片钳记录测量的生理改变的空间-时间参数。
<img alt="海马体回路示意图，展示神经通路及区域：CA1、CA2、CA3、DG、内嗅皮层。" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 海马体回路示意图。 海马体的水平切面。图中以黄色显示穿过海马体的主要通路。来自内嗅皮层神经元的轴突经穿通通路投射至齿状回，与齿状回颗粒细胞的树突形成突触。颗粒细胞的轴突经苔藓纤维通路投射至CA3区，与CA3神经元的树突形成突触。CA3神经元的轴突经Schaffer侧支通路投射至CA1锥体细胞的树突。CA1锥体细胞的轴突通过下托离开海马体。注：图中还显示了CA3锥体细胞的轴突侧支经穹窿投射至对侧海马体。（CA1：阿蒙角1，CA2：阿蒙角2，CA3：阿蒙角3，DG：齿状回，虚线表示细胞体层，实线表示结构边界。）
<img alt="Bar graph comparing freezing percentage; sham vs. FPI, indicating significant difference (**)." src="/files/ftp_upload/4411/4411fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 代表性行为学数据。 A：行为学数据，显示脑损伤小鼠（FPI）与假手术对照组小鼠（sham）在条件性恐惧反应范式中冻结率的差异。训练于第6天进行。th 损伤后第2天进行测试，测试时段在24小时后。(**表示p&lt;.01.)
<img alt="CA1和DG区域中fEPSP斜率及刺激强度分析的电生理学图示。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4411/4411fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 代表性细胞外记录数据。A：CA1区场兴奋性突触后电位（fEPSP）记录示例。第一个向下的偏转为刺激伪迹，随后是突触前纤维锋电位，最后是fEPSP。B：输入/输出曲线显示，在流体冲击损伤（FPI）后，CA1区的突触净效能下降。C：输入/输出曲线显示，在流体冲击损伤（FPI）后，齿状回（DG）区的突触净效能升高。（*表示 p&lt;.05。）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="神经活动图、电生理记录迹线、树突荧光显微成像结果。" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 全细胞膜片钳记录代表性数据。 A：来自CA1区锥体细胞的一个自发性兴奋性突触后电流（sEPSC）示例。B：CA1区锥体细胞（上迹线）和快速放电型CA1区中间神经元（下迹线）的动作电位序列示例。C： Lucifer Yellow标记的CA1区抑制性中间神经元示例。注意树突上无树突棘（上图）。D：Lucifer Yellow标记的CA1区锥体神经元示例。注意树突上存在树突棘（上图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="大脑活动图谱；电磁热图；灰色、橙色、蓝色区域；科学分析。" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 电压敏感性染料成像的代表性数据。A：显示解剖结构的小鼠冠状海马切片。（DG：齿状回，CA1：阿蒙角1区）B：在传入性Schaffer侧支刺激后14毫秒，CA1区呈现黄色至红色像素，代表兴奋性活动。红色表示更强的去极化，黄色表示较弱但仍显著的去极化。C：在同一传入性Schaffer侧支刺激后56毫秒，CA1区呈现蓝色像素，代表抑制性活动位点（如B所示）。深蓝色表示更强的超极化。

<ol><li>Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Brain+Injury+in+the+United+States%3A+Emergency+Department+Visits+Hospitalizations+and+Deaths+2002-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%2C+National+Center+for+Injury+Prevention+and+Control%22%5BJournal%5D)">Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006.</a> Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).</li>
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<li>Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+inability+to+induce+area+CA1+LTP+in+the+mouse+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury.</a> Hippocampus. 16, 541-550 (2006).</li>
<li>Cole, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+branched+chain+amino+acids+ameliorate+injury-induced+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

上述每种技术都有助于更深入地理解导致观察到的行为缺陷的潜在机制。通过整合每种方法所获得的独特信息，我们能够更精确地研究其生物学机制。
	测量fEPSP有助于量化大范围、空间定位明确的神经元区域的突触效能总和。它还可以提供有关细胞群发生突触可塑性的潜力信息，而突触可塑性是学习与记忆的神经基础。作为电生理分析的初步手段，该方法技术上较为简便，且能提供关于神经环路功能的总体指标信息。
	与fEPSPs相比，全细胞膜片钳记录技术能够提供单个细胞电生理参数的详细信息。该技术具有高度多样性，可根据不同的记录条件（如移液管或浴液中的药理学试剂、钳制电压、记录模式等），测量多种不同的参数和类型的突触输入。例如，全细胞膜片钳记录可用于区分兴奋性与抑制性突触传递在fEPSPs所描述的突触总效能差异中各自的相对贡献。
	电压敏感性染料成像实验通过提供有关神经环路变化时空动态的信息，补充了上述更传统电生理技术所获得的知识。这些改变的时空特征可用于提出关于可能参与环路功能障碍的细胞类型的假设，随后...

<table><tbody><tr><td>Axopatch 200B 放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>AXOPATCH 200B</td><td>膜片钳系统</td></tr><tr><td>Digidata 1322A 数字转换器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>膜片钳系统</td></tr><tr><td>MP-225 显微操作器</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td>膜片钳系统</td></tr><tr><td>DMLFSA 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>膜片钳系统</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>多功能（场电位）记录系统</td></tr><tr><td>Digidata 1440 数字转换器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>多功能（场电位）记录系统</td></tr><tr><td>MPC-200 显微操作器</td><td>Sutter</td><td>MPC-200</td><td>多功能（场电位）记录系统</td></tr><tr><td>BX51WI 显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>多功能（场电位）记录系统</td></tr><tr><td>Axoclamp 900A 放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>AXOCLAMP 900A</td><td>电压敏感染料记录系统</td></tr><tr><td>Digidata 1322 数字转换器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>电压敏感染料记录系统</td></tr><tr><td>Redshirt CCD-SMQ 相机</td><td>Redshirt</td><td>NCS01</td><td>电压敏感染料记录系统</td></tr><tr><td>VT 1200S 振动切片机</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>P-30 电极拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-30/P</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr></tbody></table>

轻度创伤性脑损伤后海马环路功能改变的研究

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

创伤性脑损伤（TBI）每年在美国影响超过170万人，即使是轻度TBI也可能导致持续性的神经功能障碍1。TBI幸存者常见的两种广泛存在且致残的症状——记忆缺陷和癫痫发作阈值降低——被认为是由TBI引起的海马功能障碍所介导的2,3。为了阐明海马神经回路功能改变如何在小鼠TBI后对行为产生不利影响，我们采用侧向液体冲击损伤模型，这是一种常用的TBI动物模型，可重现人类TBI的多种特征，包括神经元细胞丢失、胶质增生以及离子稳态紊乱4-6。
	本文展示了一种用于研究创伤性脑损伤（TBI）诱导的海马功能障碍的组合方法。该方法结合多种ex vivo生理学技术，并整合动物行为学与生物化学分析，以系统解析TBI后海马的病理变化。我们首先介绍实验性脑损伤模型及行为学分析，用于评估TBI后的认知功能障碍。随后，重点介绍三种不同的ex vivo电生理记录技术：细胞外场电位记录、可视化全细胞膜片钳记录以及电压敏感性染料记录。最后，我们演示一种可对海马不同亚区进行区域性分离的方法，该方法有助于深入分析TBI后神经化学与代谢的改变。
	这些方法已被用于研究创伤性脑损伤（TBI）后海马神经环路的改变，并探究海马齿状回和CA1亚区网络电路功能发生的相反变化（见图1）。能够分析TBI后各个亚区的变化，对于理解导致TBI诱发的行为和认知缺陷的潜在机制至关重要。
	本文所述的多层面系统可使研究人员超越对疾病状态（本例中为创伤性脑损伤，TBI）所引发现象的表征，进而确定与TBI相关病理变化的潜在机制。

本文阐述了一种多角度研究海马神经环路功能变化的方法。文中描述了电生理学技术、损伤造模方案、行为学测试以及脑区分离方法。这些技术的结合可类似地应用于其他脑区及科学问题的研究。

创伤性脑损伤（TBI）每年在美国影响超过170万人，即使是轻度TBI也可能导致持续性的神经功能障碍……

本实验的总体目标是探究轻度创伤性脑损伤实验模型所影响脑区的网络功能变化。实验首先对小鼠施加侧向液体打击损伤，以模拟人类轻度创伤性脑损伤的病理特征和临床表现。第二步，采用依赖于海马的功能行为学检测——情境性条件恐惧反应，评估脑损伤引起的认知功能障碍。随后，结合细胞外记录、细胞内记录以及电压敏感性染料技术，确定兴奋性与抑制性突触传递之间突触平衡的区域性特异性变化。在目标区域海马中，基于对照组与脑损伤小鼠在上述三种记录技术中所呈现的差异，结果显示海马不同亚区的净突触效能发生了特异性改变。该方法的主要优势在于能够区分病理状态及潜在治疗手段在多个生理尺度上的影响，从而更全面地揭示该神经环路功能缺陷的特征。该方法有助于解答有关创伤性脑损伤的关键问题，例如明确哪些神经元对损伤最为敏感，因而对损伤后海马功能障碍产生最大影响。本方法的应用前景延伸至创伤性脑损伤的治疗领域，因为它使我们能够首先阐明其潜在机制，进而开发潜在的治疗策略，以恢复因脑损伤而受损区域的正常生理功能。在此操作中，通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪混合物以麻醉小鼠。接着，使用外径为3毫米的齿状钻在右侧顶叶区域进行颅骨开窗。然后，使用氰基丙烯酸酯和牙科丙烯酸树脂将诱饵锁针座固定在颅骨开窗处。24小时后，通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。待呼吸恢复正常后，但在小鼠尚未对刺激产生敏感反应前，通过液体打击损伤装置向颅骨输送一次20毫秒的生理盐水脉冲。损伤后立即移除连接头。随后再次使用异氟烷麻醉小鼠，并缝合头皮。在进行条件性恐惧反应训练前的连续两天内，对小鼠进行抓握操作。训练当天，将小鼠放入条件化实验箱中适应3分钟，随后给予持续2秒、强度为1.5分钟amp的足底电击。之后让小鼠在箱内再停留30秒，然后取出。在延迟24小时后，将小鼠放回条件化室中持续5分钟，然后在损伤后第7天以每5秒为间隔评估其僵直行为。配制1升人工脑脊液和250毫升蔗糖切片液。确保脑片制备过程中使用的所有仪器和溶液均预先冰浴冷却。使用异氟烷快速且轻柔地麻醉小鼠。取出小鼠脑组织并置于蔗糖溶液中。随后修剪脑组织。将新鲜切割的脑组织切面置于Vibram切片台上琼脂块前方的一滴超级胶水上。切取350微米厚的冠状切片。应可获得四到五片包含完整海马回路的切片。随后，将脑片在 37 摄氏度下孵育至少一小时。现在准备一些电阻为 2 至 5 兆欧的硼硅酸盐玻璃电极。使用垂直拉制仪，将一片脑片转移至记录室，然后将电极安装到电极夹持器上，用于细胞外场电位记录。将刺激电极置于脑片上的轴突通路（如穿内侧嗅皮质通路或Shafer侧支）上方，然后继续将记录电极缓慢下移进入脑片。接着给予单个电脉冲刺激，以诱发出细胞外场兴奋性突触后电位。当达到最大反应时，继续刺激，并在每次刺激之间调整记录电极的深度。这表明电极处于相同的Z平面。Z平面分析通常包括测量比较脑损伤小鼠与假手术小鼠的纤维群体峰电位幅度，以评估突触前激活情况，同时比较场兴奋性突触后电位（F-E-P-S-P）的斜率，以评估突触后激活情况。对于膜片钳记录，再次将脑片转移至记录 chamber，并降低记录电极。将电极施加正压后接近细胞，以确保电极在穿过组织下行过程中不会堵塞。当电极轻轻接触细胞时，施加负压，以在电极与细胞质膜之间形成吉欧封接（giga seal）。随后，施加短暂的负压脉冲，以破裂细胞质膜，实现全细胞记录构型。使用放大器消除电容瞬变，并对串联电阻进行补偿，以确保测量的准确性。随后定量并比较脑损伤小鼠与假手术对照组中自发性突触电流的速率和幅度。在此步骤中，通过将1毫克染料三（onap DHQ）溶于50微升乙醇中来配制染料储备液。取两微升等分试样加入铝箔包裹的试管中，于负20摄氏度保存。每天用人工脑脊液按1:200稀释配制工作用染料溶液。将脑片置于人工脑脊液润湿的滤纸上，加入90微升染料染色16分钟。随后，用生理盐水冲洗，并将其放入界面记录室中。按照细胞外场电位记录所述方法放置刺激电极和记录电极。调节光刺激强度，直至反应位于相机视野中央。距离图像通常以每秒500至1000帧的速率采集。在电刺激开始前200毫秒触发光刺激快门，以使初始快速的光漂白过程趋于稳定。每次试验之间间隔 10 秒。交替进行电刺激与非电刺激的采集试验，以便后续扣除非电刺激背景信号。然后在打开快门之前记录静息状态下的光强度。每次VSD实验均可被分析为一段荧光读数的动态影像，即每次实验均为一个在时间维度上展开的三维数据矩阵，包含X和Y空间维度的数值。在每种测试条件下记录10至12次VSD实验，并根据随附的文稿计算像素内光照前归一化的荧光变化量。该图展示了海马 CA1 区 F-E-P-S-P 记录的一个示例。第一个向下的偏转是刺激伪迹，随后是突触前纤维放电，然后是 F-E-P-S-P。以下是描绘流体冲击损伤后 CA1 区突触总效能降低的输入-输出曲线。以下是FPI后齿状回中突触净效应增强的输入-输出曲线。图中显示了一个CA1区锥体细胞的自发性兴奋性突触后电流示例。此外，还展示了一个CA1区锥体细胞的动作电位串以及一个CA1区快速放电中间神经元的动作电位串示例。这是一个充满 Lucifer yellow 的海马 CA1 区无树突棘的抑制性中间神经元，而这里是一个充满 Lucifer yellow 的海马 CA1 区有树突棘的颗粒细胞邻近神经元。这些图像显示的是小鼠冠状 hippocampal 脑片。黄色至红色的像素代表在传入的 Schaffer 侧支刺激后 14 毫秒时 CA1 区的兴奋性活动。红色表示更强的去极化，而黄色表示较弱但仍显著的去极化。蓝色像素代表在相同传入沙弗侧支刺激后56毫秒时CA1区域抑制性活动的位点，其中深蓝色表示更强的超极化。观看本视频后，您应能充分理解如何结合多种离体记录技术，以研究涉及神经环路功能障碍的临床相关病理状态。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

调查轻度创伤性脑损伤海马电路功能的改变

来源：Macheda, T.，等。小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型。J. Vis. Exp.

小鼠模型中轻度创伤性脑损伤的诱导

来源： Braeckman, K., et. al. 轻度创伤性脑损伤大鼠海马区的高级扩散成像。 J. Vis. Exp.

轻度创伤性脑损伤大鼠海马的扩散加权成像

我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。...

小鼠海马区齿状回树突分支的评估

我们描述了使用激光捕获显微切割技术从大鼠脑部不同区域获取特定细胞群体样本，用于基因和微小RNA分析。该技术可用于研究创伤性脑损伤对大鼠脑内特定区域的差异性影响。...

立体定位图谱引导的激光显微切割技术用于分离受创伤性损伤影响的脑区

本文介绍了一种使用侧向液体打击装置诱导弥漫性创伤性脑损伤，并随后采集盲肠内容物进行肠道微生物组分析的实验方案。...

研究小鼠创伤性脑损伤后盲肠微生物群的变化

本实验的总体目标是获取轻度创伤性脑损伤大鼠海马体的定量微结构信息。该目标通过采用先进的扩散加权磁共振成像方案，并对参数化扩散图进行基于感兴趣区域的分析来实现。...

轻度创伤性脑损伤大鼠海马区的高级扩散成像

本文介绍了一种用于研究轻度至中度创伤性脑损伤神经生物学和病理生理学效应的啮齿类动物爆炸冲击波模型方案。我们建立了一种由气体驱动的台式装置，配备压力传感器，可稳定且可重复地产生爆炸所致的轻度至中度创伤性脑损伤。...

用于啮齿类动物闭合性轻度创伤性脑损伤临床前评估的低强度冲击波模型

本方案描述了小鼠模型中的轻度创伤性脑损伤。具体而言，详细阐述了一步一步诱导轻度中线闭合性头部损伤的方法以及该动物模型的表征。...

小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型

在此，展示了如何利用清醒状态下的闭合性头部损伤模型来研究重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）对海马突触可塑性的影响。该模型可复制r-mTBI患者的重要病理特征，并可与电生理记录、行为学检测及分子生物学分析等技术联合使用 体外...

利用清醒状态下闭合性头部损伤的轻度创伤性脑损伤模型评估突触可塑性的变化

本方案介绍了一种通过闭合性头部损伤（CHI）方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠改良模型。该方法采用颅骨变薄窗口结合液体打击技术，可减少因脑膜暴露所引起的常见炎症反应，同时提高了在啮齿类动物中建立rmTBI模型的可重复性和准确性。...

改良的小鼠重复性轻度创伤性脑损伤模型结合颅骨变薄窗与液体打击技术

本文介绍了一种建立闭合性头部损伤动物模型的方案，该模型可复制轻度非复杂性创伤性脑损伤的神经影像学特征，即在急性期保留脑结构完整性，并出现长期脑萎缩。纵向磁共振成像是获取证据的主要方法。...

采用落锤法改良并经磁共振成像验证的轻度单纯性创伤性脑损伤模型的建立

学习使用电生理技术、电压敏感染料和侧向液压冲击损伤模型研究轻度创伤性脑损伤后海马环路功能的变化。该方法结合行为学评估揭示突触效能改变的区域特异性机制。

轻度创伤性脑损伤后海马环路功能改变的研究

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