Name: 使用激光衍射自由游泳微生物的定量步态研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解利用激光衍射技术定量分析秀丽隐杆线虫自由游泳步态的方法。该技术通过记录衍射图案实时测量线虫在三维空间中的运动频率，平均游泳频率约为2.37赫兹，为神经科学和行为学研究提供了新工具。

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感谢 Tzlil Rozenblat、Alexandra Bello 和 Karl Spuhler 提供的技术支持。本研究由瓦萨学院本科生研究暑期研究所（URSI）、Lucy Maynard Salmon 研究基金以及 NASA 资助项目 #NX09AU90A、美国国家科学基金会科学与技术研究中心（NSF-CREST）资助项目 #0630388 和 NSF 资助项目 #1058385 资助。

1. 用于视频分析的 C. elegans 准备
<ol>
 <li>使用一根细而扁平的铂丝挑针，将10-20条 gravid 成年线虫转移至盛有新鲜NGM琼脂的培养皿中。这些含有NGM琼脂的培养皿中央接种有少量圆形的E. coli菌斑（使用生长受限菌株OP50效果最佳），供线虫取食。让线虫产卵3-5小时，随后移除成虫，从而建立一个包含50-150条线虫的小规模、发育同步的培养体系。将培养皿置于20 °C条件下孵育4-5天，使线虫生长至早期成虫阶段。这些培养方法基于已建立的标准操作流程（Stiernagle 2006）5。</li>
 <li>在进行视频分析当天，用1 ml去离子蒸馏水冲洗一皿年轻成虫线虫，从而从同步培养物中收集50-150条线虫。也可使用M9或PBS等缓冲液。使用微量离心机将线虫离心至管底，或静置约15分钟使其依靠重力沉降。吸除大部分上清液，并加入1 ml去离子蒸馏水以洗去线虫表面附着的细菌。</li>
 <li>使用微量移液器将线虫连同水或缓冲液转移至石英比色皿中。每次操作应使用少量线虫，总数约5-10条，甚至更少，以确保每次通常只有一条线虫被激光照射。若培养皿中线虫数量过多，可用去离子水或缓冲液稀释至所需密度。也可用挑针将单个线虫转移至新鲜琼脂平板上的水滴或缓冲液滴中进行清洗，再逐个转移至比色皿中。在本研究中，我们使用了1 mm、2 mm和5 mm的比色皿尺寸，以考察物理约束对游泳行为的影响。</li>
</ol>
2. 视频分析的光学装置
<ol>
 <li>按照图示进行设置 图1 使用543 nm（绿色）氦-氖（HeNe）激光器、两个前表面铝镜、比色皿架、投影屏和一台高速相机（Casio High Speed Exilim），该相机能够以约240 fps的速度进行拍摄。两个铝镜用于引导激光束穿过比色皿。可根据研究性质选用不同尺寸的比色皿。例如，我们使用厚度为5 mm的比色皿来展示空间限制对游动频率的影响。激光束必须满足过采样的要求； 即，生物体不应遮挡超过三分之一的激光束。对于 秀丽隐杆线虫激光束与线虫相互作用时，其直径应约为2 mm。激光束直径不应超过5 mm，否则衍射图样将难以定位。衍射生物体与屏幕之间的距离应远大于生物体本身的尺寸。</li>
 <li>将石蜡膜覆盖在比色皿顶部，倒置以使线虫充分混入水柱中。将比色皿放入比色皿架，使线虫初始位置位于比色皿上部。利用反射镜引导激光束穿过比色皿中心。由于线虫密度大于水，它们会缓慢沉降至比色皿底部，同时在水柱中持续游动。</li>
 <li>在投影屏幕上，将对应于透射激光束的光斑涂成黑色，以减少透射光束到达投影屏幕时产生的散射图2）. 或者在投影屏上开一个开口，使透射光束能够穿过屏幕。消除或减少透射光束的散射，可防止透射光束导致相机的CCD阵列饱和。</li>
 <li>为测量衍射图样的尺寸，在投影屏上紧邻透射激光光斑处画一条约5 cm长的线，注意不要干扰衍射光的图像。</li>
 <li>打开室内灯光，用相机开始录制，确保5 cm标线与衍射图像同时记录在同一段视频中。关闭室内灯光，当线虫穿过激光束时，用相机记录屏幕上的衍射图像。</li>
</ol>
3. 视频数据准备
<ol>
 <li>在计算机上安装视频分析软件（Logger Pro：<a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a>），并将视频导入该视频分析程序。</li>
 <li>将坐标原点设置为与透射激光光斑重合。使用投影屏上的5 cm标尺线设定比例尺。</li>
 <li>利用视频分析软件追踪每条线虫产生的衍射图像的角位移（图3）。</li>
 <li>通过计算 arctan (y/x) 求得角位移，将数据复制粘贴至电子表格（Excel）中，并对所有负角度值增加180度或π，以生成连续的角位移曲线（图4）。</li>
</ol>
4. 游动频率的实时数据采集以实现即时观察
<ol>
 <li>使用与视频分析相同的装置，将一个面积较小（约1 mm2）的光电二极管（ThorLabs公司的DET10A）放置在投影屏正前方的衍射图样偏离中心的位置。</li>
 <li>将光电二极管连接至通过USB接口与计算机相连的数字示波器（Pico Technology公司生产的PicoScope），在计算机屏幕上观察抖动的波形图样。</li>
 <li>以ASCII或文本格式保存采集到的数据集。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
 <li>将使用视频或光电二极管采集的数据导入能够通过卡方最小化拟合波形的数据分析程序中。本研究使用的程序为 Origin（<a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a>）。拟合正弦曲线以确定摆动频率（图 4 和图 5）。</li>
 <li>计算不同样本的平均游泳频率并确定方差。本研究采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行 Bonferroni 多重比较检验。以 p 值 &lt; 0.05 为具有统计学显著性。</li>
</ol>
6. 以 Mathematica 为例模拟衍射图样
注意：衍射图样可以使用多种不同的计算工具进行建模。该过程会因不同的计算工具（如 MatLab、Excel、Origin 等）而有所不同。
<ol>
 <li>创建图像：使用传统显微镜在显微镜载玻片上拍摄线虫的图像。</li>
 <li>图像二值化：通过将图像拖入 Mathematica 中导入线虫图像“Worm”。将图像转换为黑白图像（二值化）。这可以通过 Mathematica 中的“Binarize”命令实现：BlackandWhiteImage=Binarize[Worm]。随后可将图像显示为黑白图像。 
 或者，使用“EdgeDetect”命令生成 BlackandWhiteImage：EdgeDetect[Worm,6.0,0.035]，其中后两个数值控制生成边缘的粗细程度。</li>
 <li>将图像转换为由零和一组成的矩阵：可通过 Mathematica 中的“ImageData”命令实现：Matrix=ImageData[BlackandWhiteImage]。</li>
 <li>对矩阵进行傅里叶变换：在 Mathematica 中使用“Fourier”命令，并采用指定的 FourierParameters 对矩阵进行傅里叶变换：FTransform = Fourier[Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]。</li>
 <li>对矩阵取模的平方以获得衍射矩阵并增强图像对比度：对矩阵的绝对值进行平方，并查看所得图像，该图像即为对应原始图像的衍射图样。此外，使用“Log”函数对图像对比度进行缩放：ImageContrast = Image[Log[1 + (Abs[FTransform])^2]/0.5]。</li>
 <li>调整图像大小以便于观察：裁剪中心的衍射图样，并按需调整大小：ImageResize[ImageContrast [y, 100], 500]。</li>
 <li>将模拟的衍射图样与自由游动线虫获得的衍射图样进行比较。（图6）</li>
</ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们开发了一种无需使用显微镜即可实时测量线虫等微型生物运动及简单运动行为的新方法。8 该方法学也可用于研究多种其他微型生物，如原生生物。此方法的局限性仅在于所用光的波长：生物体尺寸不应小于光的波长。除设备成本低且便于携带外，该方法的一个关键优势在于能够实时、三维地测量行为，而不受显微镜下图像平面狭窄视野的限制。此外，利用该技术还可研究重力或其他多种条件对行为的影响，而这些因素在基于显微镜的方法中难以实现。9 因此，我们能够更深入地理解微生物在自然状态下的运动行为，摆脱显微镜载玻片液滴或专用微流控腔室的限制（Park et al, 2008）。10
衍射图样中相位信息的缺失使得无法直接重构出对应衍射物体的图像，因为远场衍射图样正比于傅里叶变换绝对值的平方。因此，我们通过蠕虫图像计算衍射图样，以便与自由游动线虫的衍射图样进行比对（图6）。
该方法已成功获得真正自由游动的 C. elegans 的实验结果，且可应用于任何在光学透明环境（如水或多类不同的离子溶液）中运动的微观物种。传统的显微镜仅能实现微米量级焦深的研究。11 这是由于聚焦光线时景深有限所致：
<img alt="用于统计分析的自由度方程，DoF ≈ 2Nc(m+1)/(m^2)。" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"> 
其中，f值 N 与弥散圆（c）呈倒数关系，因此短焦距对应较大的c12,13。尽管这种衍射方法显然不能取代传统显微镜，但它能够快速提供定量结果，从而实现在低成本条件下对物种进行实时操控。衍射图样可使用任意激光笔获得，并可通过普通数码相机以较低时间分辨率进行拍摄记录。即使使用者无法 readily 获得显微镜或光电二极管，本实验的关键步骤（如测量蠕动频率和评估衍射图样）仍能以极低的成本完成。

<table><tbody><tr><td>543 nm 氦氖激光器</td><td>Melles Griot</td><td>LGX1</td><td>任何可见光范围、输出功率低于 5 mW 的激光器均可使用。</td></tr><tr><td>2 个前表面铝镜</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>高速 Exilim 相机</td><td>Casio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro（软件）</td><td>Vernier</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.vernier.com/products/software/lp/&quot; target=&quot;_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wolfram.com/&quot; target=&quot;_blank">http://www.wolfram.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用激光衍射对自由游动的微生物进行定量运动研究

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

土壤和水生微生物生活在复杂的三维环境中。然而，目前大多数关于微生物行为的研究均采用基于显微镜的方法，这些方法将微生物的运动和行为限制在狭窄且近乎二维的焦平面内。1 我们提出一种新颖的分析方法，可在比色皿中对自由游动的 C. elegans 进行实时分析，且无需依赖基于显微镜的设备。该方法通过将激光照射穿过比色皿，追踪由此产生的衍射图样的时间周期性变化来实现。我们测量了自由游动线虫的振荡频率。
远场衍射图样的分析揭示了线虫波形的线索。衍射是光在物体周围发生弯曲的过程。在此情况下，光被生物体衍射。光波相互干涉，可形成衍射图样。当屏幕与物体之间的距离远大于衍射物体的尺寸时，便形成远场（即夫琅禾费）衍射图样。此时，衍射图样可通过傅里叶变换进行计算（建模）。2
C. elegans 是一种自由生活的土壤线虫，能够在三维空间中移动。它们既可以在土壤或琼脂等固体基质上以正弦波状的运动模式爬行，也可以在液体中以另一种不同的模式游泳。3 目前，调控运动模式可塑性变化及模式转换的机械感受、化学感受和温度感受细胞所提供的感觉信息所起的作用才刚刚开始被阐明。4 我们描述了一种无需显微镜即可测量线虫三维运动的光学方法，该方法将使我们能够开始探索在不同条件下线虫运动的复杂性。

例如，我们研究了在石英比色皿中运动的C. elegans，该比色皿宽1 cm、厚5 mm、高4 cm。通过视频分析选取单条线虫，在5 mm厚的比色皿中测得其平均游泳频率约为2.5 Hz（图4）。同样地，采用实时数据采集方法对单条线虫进行采样，使用数字示波器（PicoScope）测得其游泳频率约为2.7 Hz（图5）。该实验过程可重复应用于多条线虫。对自由游泳线虫的详细研究表明，在5 mm比色皿中的平均游泳频率为2.37 Hz6。与预期一致，该游泳频率高于爬行线虫的频率（约0.8 Hz）3。利用这种衍射方法，已发现被限制在显微镜载玻片上的C. elegans的平均游泳频率与先前发表的2 Hz数值相符1,7。
按照步骤 3.) 然后 6.) 可借助普通显微镜获得的蠕虫图像对游泳过程中的衍射图样进行建模。所建立的衍射图样模型用于模拟 C. elegans 的游泳周期（图 6）。一个成功的模型应包含物理上合理的连续游泳形态，并与游泳频率相匹配。在游泳周期结束时，蠕虫的形态应与其在游泳周期开始时相同。
<img alt="使用光学比色皿对秀丽隐杆线虫进行激光衍射示意图；显示光路和光的衍射。" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 采用绿色HeNe激光器对活体C. elegans产生动态衍射图样。该衍射图样以240帧/秒的速度进行拍摄。
<img alt="衍射图样，光学实验装置中的激光干涉，展示波的叠加。" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 绘制一个黑点可增强对透射光束的吸收。由于散射光导致的相机饱和现象得以减弱，衍射图样因而变得可见。
<img alt="Laser diffraction experiment; data analysis graph; optical setup; interference pattern." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 视频分析软件（Logger Pro）的截图，显示正在追踪的蠕虫衍射图样。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="线虫在比色皿中的游泳周期图；视频数据及频率拟合，2.47 Hz；角度随时间变化。" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 对应于线虫在 5 mm 比色皿中游泳周期的视频数据。曲线拟合显示游泳频率约为 2.5 Hz。
<img alt="游泳周期分析，C. elegans，频率拟合图，5 mm 比色皿，随时间变化的强度。" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 对应于线虫在 5 mm 比色皿中游泳周期的实时数据。曲线拟合显示游泳频率约为 2.7 Hz。
<img alt="秀丽隐杆线虫显微镜观察、衍射图样；光学分析、生物物理研究示意图。" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 顶行显示实际的衍射图样，与底行的模拟衍射图样相对应。模拟衍射图样是通过显微镜载玻片上的线虫生成的（中行）。

像自由游动的线虫 C. elegans 这样的微观生物，生活在复杂且具有三维特性的环境中，并在此环境中表现出特定行为。我们报道了一种利用衍射图样分析 C. elegans 的新方法。该方法通过将激光照射穿过比色皿，记录其所产生衍射图样的时间周期性变化，从而实现对线虫运动的追踪分析。

土壤和水生微生物在复杂的三维环境中生存与活动。目前大多数关于微生物行为的研究……

本实验的总体目标是测量自由游动的微观生物的摆动频率。首先准备微观蠕虫样本，然后设置光学系统。然后记录活体生物引入的衍射图样。最后，分析所记录的数据以确定游泳频率。最终，通过衍射分析揭示无约束线虫运动模式的变化。与传统显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够观察物种在三维空间中自由移动时的游动模式。尽管该方法可为自由游动的秀丽隐杆线虫提供深入见解，也可应用于其他透明、微小且处于不同条件下的微观生物。为进行视频分析，首先使用压平的铂金丝挑取工具将10至20条GR成年线虫转移至新鲜的NGM培养基上。含有大肠杆菌小圆形菌落的琼脂培养皿。让线虫产卵三至五小时，然后移除成虫。由此建立一个包含50至150条线虫的小规模发育同步培养体系，将培养皿置于20摄氏度下孵育四至五天，使线虫生长至早期成虫阶段。在进行视频分析的当天，使用一毫升去离子蒸馏水冲洗一板同步化培养的年轻成年线虫，从而收集50至150条蠕虫。使用微量离心机将线虫离心至离心管底部，或静置约15分钟使其依靠重力沉降。吸除管中大部分上清液，再加入一毫升去离子蒸馏水，以洗涤线虫表面附着的细菌。使用微量移液器将五到十条线虫转移至盛有水的石英小室中。按照图示组装光学系统：采用波长为543纳米的氦氖激光器，通过两片前表面铝镜引导激光束穿过石英小室，系统还包括小室支架、投影屏，以及一台每秒可拍摄约240帧的高速相机。随后，用一块聚甲醛块覆盖石英小室顶部，并将其倒置，使线虫充分混入水柱中。将毛细管置于毛细管架中，使线虫初始时位于毛细管顶部。利用反射镜引导激光束穿过毛细管中心。由于线虫密度大于水，它们将在水柱中缓慢下沉至毛细管底部，同时在投影屏上观察其运动；当透射激光束到达投影屏时，将对应光斑区域涂成黑色，以减少光散射。消除或减少透射光束的散射可防止透射光束使相机的CCD阵列饱和。为了获取衍射图样的尺寸信息，在投影屏上紧邻透射激光光斑处画一条长约五厘米的线，注意不要干扰衍射光的图像。关闭室内光源，并在蠕虫通过激光束时记录屏幕上出现的衍射图像。为准备视频数据，请安装以下视频分析程序，并将视频导入该程序。使用软件将坐标原点设置为与透射激光光斑重合的位置。追踪每条线虫产生的衍射图像的角度位移。将数据复制并粘贴到电子表格中，并对所有负角度加上180度或π，以生成连续的曲线图。使用视频分析装置，通过USB端口将一个面积较小的光电二极管放置在投影屏正前方的衍射图样中，且偏离中心位置。将光电二极管连接到与计算机相连的数字示波器。在计算机屏幕上观察抽搐模式。将数据集保存为 ASCI 或文本格式，以便分析数据。使用视频或照片将数据导入能够拟合波形的数据分析程序中。通过卡方最小化法对正弦曲线进行拟合，以确定摆动频率。对来自不同样本的游泳频率取平均值，并计算其方差。本研究采用单因素方差分析（Inova）对数据进行统计学分析，随后进行Bon Ferran多重比较检验。以P值小于0.05为具有统计学显著性，用于分析衍射图样。首先使用显微镜拍摄图像以进行图像表征。将其拖入 Mathematica 中。使用二值化命令将其转换为黑白图像。或者，使用边缘检测命令生成黑白图像，其中末尾的两个数值用于控制所生成边缘的粗细程度。接下来，使用图像数据命令将图像转换为由零和一组成的矩阵。利用 forer 命令对矩阵进行 forer 变换，然后对矩阵取绝对值的平方，并查看所得图像，即对应于原始图像的衍射图样。此外，使用对数函数对图像的对比度进行缩放。最后，将模型衍射图样与自由游动的蠕虫获得的衍射图样进行比较。在此示例中，使用一厘米宽、五毫米厚、四厘米高的石英Q槽对海优雅蠕虫（sea elegance）进行研究，并通过视频分析对单个蠕虫进行采样。通过视频分析获得的在5毫米厚培养皿中的平均游泳频率约为2.5赫兹。类似地，使用实时数据采集方法和数字示波器对单条蠕虫进行采样，得到的游泳频率约为2.7赫兹。该步骤可对多条蠕虫重复进行。对自由游动的蠕虫进行的详细研究显示，其在五毫米水体中的平均游泳频率为 2.37 赫兹。正如预期，该游泳频率高于爬行蠕虫的频率。利用这种衍射方法，已发现被限制在显微镜载玻片上的海生秀丽隐杆线虫的平均游泳频率与先前发表的 2 赫兹数值相符。观看视频后。本视频中展示的衍射图样数据准备与建模方法可用于模拟运动中的衍射图样。结合使用常规显微镜获取的蠕虫图像，通过建模的衍射图样可模拟海蛇尾的游动周期。一个成功的模型应包含物理上合理的游泳模式，且与游泳频率相匹配。线虫在一个游泳周期结束时的形态应与其在周期开始时相同。一旦掌握，利用快速光控饮食法并在计算机屏幕上观察游泳周期，即可在不到一分钟内完成每条线虫的实验操作。观看本视频后，您应能充分理解如何评估自由游动的线虫。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用激光衍射自由游泳微生物的定量步态研究

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海洋微生物对微尺度营养层的趋化响应

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C. elegans 追踪与行为学测量

来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp.

利用微流控装置评估细菌运动性

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本文描述了如何利用远场衍射特征来区分不同种类的线虫。我们比较了139种野生型和108种 "滚轴" 秀丽隐杆线虫...

基于傅里叶的活体衍射分析 秀丽隐杆线虫

三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。...

单分子追踪显微技术——用于确定细胞质分子扩散状态的工具

本文介绍了一种在微流控和毫流控装置内通过光解反应生成动态化学梯度环境的实验方案。该方法适用于研究多种生物学过程，包括微生物在单细胞水平和群体水平上的运动行为、营养摄取以及对化学物质的适应性。...

生成可控的动态化学环境以研究微生物行为

本实验方案描述了如何对Acanthamoeba...

棘阿米巴 spp. 运动性的定量分析

本研究探讨年龄对运动功能的影响 秀丽隐杆线虫 通过测量最大李雅普诺夫指数（LLE）。随着它们老化， 秀丽隐杆线虫...

年龄依赖性运动行为动态变化 秀丽隐杆线虫李雅普诺夫指数分析

了解利用激光衍射技术定量分析秀丽隐杆线虫自由游泳步态的方法。该技术通过记录衍射图案实时测量线虫在三维空间中的运动频率，平均游泳频率约为2.37赫兹，为神经科学和行为学研究提供了新工具。

利用激光衍射对自由游动的微生物进行定量运动研究

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