使用激光衍射自由游泳微生物的定量步态研究
2012年10月25日
像自由游动的线虫的微生物 C.线虫，生活和行为在一个复杂的三维环境。我们提供一个新的方法，分析报告 C.线虫用衍射图案。这种方法包括跟踪的时间周期的衍射图案所产生的激光通过试管指导。
该程序的总体目标是测量自由游泳的微生物的抖动频率。这是通过首先准备微小蠕虫样品来实现的。接下来，准备光学设置。
然后记录活生物体引入的衍射图。最后，分析记录的数据以确定游泳频率。最终，衍射分析用于显示不受约束的蠕虫的运动模式的变化。
与传统显微镜等现有方法相比，这种技术的主要优点是，当物种在三维空间中自由移动时，可以观察到游泳模式。虽然这种方法可以深入了解自由游泳的海洋优雅，但它也可以应用于暴露于不同条件下的其他透明、小型和微观生物。要设置用于视频分析的 C 优雅，首先使用扁平的铂丝镐将 10 至 20 GR 成虫移动到新鲜的 NGM 中。
琼脂填充的培养皿含有大肠杆菌的小圆形点。让线虫产卵 3 到 5 小时，然后取出成虫。从而建立一个 50 到 150 个线虫的小型发育同步培养物，使线虫生长到成年早期，在 20 摄氏度下孵育培养皿 4 到 5 天。
在视频分析当天，使用一毫升去离子蒸馏水冲洗一盘年轻成线虫，从而从同步培养物中收集 50 至 150 条蠕虫。使用微量离心机将蠕虫旋转到试管底部，或让它们在重力作用下沉降约 15 分钟。它从试管中去除大部分水，并用一毫升去离子蒸馏水代替，以清洗线虫上任何粘附的细菌。
使用微量移液器将水中的 5 到 10 个线虫转移到石英 vete 中。如图所示组装光学装置，使用 543 纳米氦氖激光器对两个前表面铝制镜子进行过采样，用于引导激光束穿过 vete、一个 vete 支架、一个投影屏幕和一个能够以大约每秒 240 帧的速度拍摄的高速相机。接下来，用一块副形式覆盖 vete 的顶部并将其倒置以将线虫混合到水柱中。
将 vete 放在 vete 支架中，使蠕虫最初靠近 vete 的顶部。使用镜子，引导激光束穿过 vete 的中心。因为线虫的密度比水大，所以它们在投影屏上的水柱内游泳时会慢慢落到网叶底部，将透射激光束对应的光斑涂成黑色，以减少透射光束遇到投影幕时的散射。
消除或减少透射光束的散射将使相机的 CCD 阵列不会因透射光束而饱和。要捕获衍射图案大小的测量值，请在投影屏幕上在透射激光束光斑旁边画一条约 5 厘米的线，而不会干扰衍射光图像。关闭室内灯，并在蠕虫穿过激光束时在屏幕上记录衍射图像。
要准备视频数据，请安装以下视频分析程序并将视频导入程序中。使用软件将原点设置为与透射的激光点重合。跟踪每个线虫形成的衍射图像的角位移。
将数据复制并粘贴到电子表格中，并为所有负角度添加 180 度或 PI。生成连续图。使用视频分析设置，通过 USB 端口将衍射图案中偏离中心的一小块光电二极管直接放置在投影屏幕的正前方。
将光电二极管连接到连接到计算机的数字示波器。观察计算机屏幕上的抖动模式。以 ASCI 或文本格式保存数据集以分析数据。
使用视频或照片将数据导入到能够拟合波形的数据分析程序中。使用 chiqua 最小化拟合正弦曲线以确定抖动频率。对各种样本的游泳频率进行平均，并确定方差。
对于这项研究，使用单因素 Inova 对数据进行统计分析，然后是 Bon Ferran。多重比较测试小于 0.05 的 A P 值被认为对模型衍射图具有统计学意义。首先使用显微镜拍摄图像以对图像进行成像。
将其拖到 Mathematica 中。使用 binary eyes 命令将其转换为黑白。或者，使用 edge detect 命令创建黑白图像，其中两个尾随数字控制结果边缘的粗糙度。
接下来，使用 image data 命令将图像转换为 0 和 1 的矩阵。使用 forer 命令对矩阵进行 forer，变换矩阵，然后将矩阵的绝对值平方，并查看生成的图像，即与原始图像对应的衍射图案。此外，使用 log 函数缩放图像的对比度。
最后，将模型衍射图与从自由游动的蠕虫获得的衍射图进行比较。在这个例子中，在宽 1 厘米、厚 5 毫米、高 4 厘米的石英 Q vet 中研究了海洋优雅。使用视频分析对单个蠕虫进行采样。
通过视频分析对 5 毫米厚的兽医进行视频分析获得的平均游泳频率约为 2.5 赫兹。同样，使用实时数据采集方法和数字示波器对单个蠕虫进行采样，产生的游泳频率约为 2.7 赫兹。对于许多蠕虫，可以重复此过程。
对自由游泳的蠕虫的详细研究表明，在 5 毫米的蠕虫中，平均游泳频率为 2.37 赫兹。正如预期的那样，游动的频率高于爬行蠕虫的频率。使用这种衍射方法，发现仅限于显微镜载玻片的 Sea Elegance 的平均游泳频率与之前公布的 2 赫兹值相匹配。
跟随视频。本视频中演示的衍射图谱的数据准备和建模允许对游泳衍射图谱进行建模。借助传统显微镜获得的蠕虫图像，建模的衍射图案用于模拟海洋优雅的游泳周期。
一个成功的模型包括游泳模式在物理上可行的成功，与游泳频率相匹配。蠕虫在游泳周期结束时的形状应与游泳周期开始时的形状相同。一旦掌握，这项技术就可以在不到一分钟的时间内为每条蠕虫使用快速照片饮食完成，同时在计算机屏幕上观察游泳周期。
看完这个视频，你应该对如何评估自由游泳的线虫有了很好的了解。
概述
本研究提出了一种新颖的方法，利用衍射图案分析秀丽隐杆线虫的游泳行为。通过追踪这些图案的时间周期性，研究人员可以获得对这些微观生物在三维环境中运动的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 行为分析
背景
- 秀丽隐杆线虫是研究运动的模式生物。
- 传统显微镜方法限制了对三维空间中生物的观察。
- 衍射图案可以提供一种分析运动的新方法。
- 这种技术可以应用于其他透明的微观生物。
研究目的
- 测量自由游泳的秀丽隐杆线虫的扭动频率。
- 使用衍射分析来分析运动模式。
- 改进现有的游泳行为观察方法。
使用的方法
- 准备同步培养的秀丽隐杆线虫。
- 使用氦氖激光器设置光学系统。
- 记录线虫穿过激光束时的衍射图案。
- 使用视频分析软件和统计方法进行数据分析。
主要结果
- 秀丽隐杆线虫的平均游泳频率测得约为2.37 Hz。
- 与爬行行为相比，观察到游泳频率的差异。
- 该技术允许实时观察三维中的运动。
- 统计分析证实了结果的显著性。
结论
- 这种衍射方法为研究秀丽隐杆线虫的游泳行为提供了一个有价值的工具。
- 该方法可以适用于其他微观生物。
- 未来的研究可以拓展各种条件下运动模式的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
