Name: 高效率，站点特定的贴壁细胞转染siRNA的微电极阵列（MEA） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习使用微电极阵列电穿孔技术对贴壁细胞进行位点特异性转染的方法。该技术可高效递送siRNA并实现精确的空间控制，适用于神经科学和细胞生物学研究中的高通量分子筛选。

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1. 多电极阵列准备
<ol>
	<li>用于电穿孔实验的微电极阵列（MEA）可采用先前所述的标准光刻技术自行制备18，也可直接从MEA制造商供应商处购买，例如Multi Channel Systems <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> 和 Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">(http://www.MED64.com)</a>。本实验所用的MEA是在中国台湾亚利桑那州立大学的洁净室设施内自行制备的，该设施由固体态电子研究中⼼（CSSER）管理。实验中使用的MEA在一个内径为1 cm的玻璃小室中包含32个氧化铟锡电极，呈8行×4列排列，电极直径范围为50–200 μm。玻璃小室通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）键合在MEA上。</li>
	<li>在接种细胞前，将MEA置于高压灭菌器中进行灭菌。其他灭菌方法，如70%乙醇浸泡、紫外线处理和热水处理，只要不破坏MEA的完整性，也可使用。</li>
	<li>将高压灭菌后的MEA转移至超净工作台，并放入标准无菌聚苯乙烯培养皿中。在向MEA接种细胞前，开启紫外线灯照射20分钟以对超净工作台进行灭菌。若MEA对紫外线敏感，在超净工作台进行紫外线照射期间，需用无菌铝箔覆盖装有MEA的培养皿。</li>
</ol>
2. 在MEA上接种细胞
<ol>
	<li>使用胰蛋白酶/EDTA从贴壁的哺乳动物细胞系中收获细胞，并将细胞重悬于1 ml培养基中，调整细胞浓度至100–200个细胞/μl，用于接种。在我们的实验中，NIH 3T3成纤维细胞系、HeLa细胞系以及原代皮层和海马神经元均能在MEA上成功培养。</li>
	<li>在MEA上放置含有细胞的20–30 μl细胞悬液液滴。将装有MEA的培养皿转移至培养箱中。需确保细胞液滴足够大，以覆盖MEA上的所有电极。</li>
	<li>接种细胞2小时后，将装有MEA的培养皿从培养箱转移至超净工作台，轻柔地向MEA孔中加入400–500 μl预热的培养基（37 °C）。在显微镜下检查，确保细胞仍附着在MEA表面且分布均匀。随后将MEA放回培养箱。接种后等待2小时再添加培养基，可确保细胞有足够时间贴附于MEA表面。若过早添加培养基，可能导致细胞被冲走。若细胞在MEA上贴附不佳，可使用多聚赖氨酸、纤连蛋白或层粘连蛋白等细胞贴附因子对MEA表面进行预处理，以增强细胞贴附。在我们的HeLa细胞实验中，通常使用10 μg/ml纤连蛋白处理MEA表面1–2小时。</li>
	<li>接种细胞后8–12小时，用PBS洗涤1–2次，以去除死亡细胞。根据需要每24–48小时更换一次培养基。在典型实验中，细胞通常在接种后24–48小时即可进行转染。为保持电穿孔效率的一致性，建议等到细胞培养密度至少达到80%融合后再进行电穿孔。</li>
</ol>
3. siRNA 的位点特异性转染
<ol>
	<li>准备核酸溶液。进行 siRNA 转染时，将 siRNA 用冰冻电穿孔缓冲液配制成终浓度为 1–2 μM 的溶液，总体积为 200–400 μl。在本视频文章中，我们展示了将 Alexa 488 标记的乱序 siRNA 序列转染至 HeLa 细胞的操作。</li>
	<li>将带有细胞的 MEA 从培养箱转移至无菌超净工作台。吸除细胞培养基，并用 PBS 洗涤一次。随后，向孔中加入 200–400 μl 冰冻的 1 μM siRNA 电穿孔溶液。</li>
	<li>对 MEA 上的目标电极施加阳极方波电脉冲（电脉冲的最佳参数设定参见步骤 4）。在本实验中，我们使用 Pragmatic Instruments 2414A 波形发生器产生电脉冲，并通过双列直插封装（DIP）16 针夹与 MEA 的焊盘接触。可通过解复用印刷电路板将波形发生器连接至 DIP 夹，以实现对单个电极的选择性控制。作为参比电极，将钢制阴极置于细胞培养基中。在将钢制参比电极插入培养基时，必须确保其不与 MEA 表面接触，否则可能损伤细胞或 MEA。建议将参比电极置于细胞上方约 1 mm 处。可在孔内放置一个高度为 1 mm 的间隔器，以辅助准确定位参比电极。另一种替代方法是不使用外部参比电极，而是利用相邻电极构成阴极-阳极配对。</li>
	<li>在对 MEA 上的目标电极施加电脉冲后，立即将 MEA 放回培养箱。孵育 5 分钟后，轻柔地更换 75% 的电穿孔缓冲液，替换为预热至 37 °C 的细胞培养基。之后可通过荧光成像确认荧光标记的 siRNA 是否成功递送至细胞内。</li>
</ol>
4. 电穿孔参数优化
<ol>
	<li>为确定电穿孔的最佳电脉冲参数，需设计一系列实验，系统性地改变脉冲幅度、脉冲持续时间和脉冲次数。根据我们对HeLa细胞的实验经验，当电极尺寸为100 μm时，施加单次电压脉冲，幅度在3 V至9 V之间，持续时间在1 msec至10 msec之间，可实现有效的电穿孔，同时细胞死亡率最低。建议每次仅改变一个参数，其余参数保持恒定。为定量评估每种脉冲参数下的电穿孔效率，我们采用碘化丙啶（PI）染色法——PI是一种不能穿透完整细胞膜的核酸染料，并结合活细胞检测方法，具体操作见步骤4.2–4.5。</li>
	<li>按照步骤1和2所述方法，在微电极阵列（MEA）上建立细胞培养。</li>
	<li>电穿孔前，准备300–500 μl含30 μg/ml PI的冰冻电穿孔缓冲液，以及400 μl用PBS配制的4 μM钙黄绿素AM（Calcein AM）溶液。</li>
	<li>将MEA从培养箱转移至超净工作台，吸除MEA中的细胞培养基，并用PBS洗涤一次。随后，向MEA中加入300–500 μl含PI的冰冻电穿孔缓冲液。</li>
	<li>对目标电极施加所需幅度和持续时间的电脉冲（用于在MEA上产生和施加电脉冲的设备详见步骤3.3）。参考电极可采用以下两种方式之一：将钢电极浸入MEA孔中的电穿孔缓冲液中，或使用相邻电极作为参考电极。通过选择性地在不同电极上施加不同幅度或持续时间的脉冲，可在同一器件上进行多个实验。例如，在一个32通道MEA上，可将32个电极分为8组，每组4个电极，从而进行8组实验。每组电极可施加一次持续时间为5 msec的单矩形电压脉冲，幅度以0.5 V为间隔在3 V至6 V范围内变化，其中一组作为对照组。</li>
	<li>施加电压脉冲后，立即将MEA转移回培养箱孵育5分钟。随后，轻柔吸除MEA孔中75%的电穿孔缓冲液，并替换为预温的细胞培养基，再将MEA放回培养箱。</li>
	<li>经过2–4小时的孵育后，将MEA孔中的细胞培养基替换为300–500 μl含4 μM Calcein AM的PBS溶液，并将MEA再次放回培养箱继续孵育30分钟。</li>
	<li>细胞与Calcein AM孵育结束后，用PBS洗涤两次，去除MEA孔中的Calcein AM溶液，再用PBS替换。使用配备PI（激发/发射波长：535 nm/617 nm）和Calcein AM（激发/发射波长：490 nm/520 nm）滤光片的光学显微镜获取细胞的荧光图像。由于电穿孔导致PI进入细胞，使细胞呈现红色荧光；而Calcein AM则使存活细胞呈现绿色荧光。可观察到三种情况：1）细胞被电穿孔且存活（同时发出红绿荧光）；2）细胞存活但未被电穿孔（仅发出绿色荧光）；3）细胞因电穿孔而死亡（仅发出红色荧光）。细胞存活率定义为电极上存活细胞数占总细胞数的百分比，电穿孔效率定义为摄入PI/siRNA的细胞数占总细胞数的百分比。</li>
</ol>
5. 代表性结果
图1 显示了在特定位置对HeLa细胞进行PI加载。可以观察到，只有位于电极上的细胞才表现出PI的摄取（图1B电穿孔后通过活细胞检测评估细胞活力（图1A). 示例中所示的电穿孔效率和细胞活力 图1 分别为81.8%和96.1%。通过优化电穿孔脉冲参数，可实现较高的细胞存活率和电穿孔效率。图中显示了在优化的电穿孔条件（8 V，1毫秒）下，对HeLA细胞进行位点特异性转染荧光标记的siRNA的结果。 图2在8 V、1毫秒条件下的siRNA电穿孔效率为74.4 ± 16.0%，细胞活力为87.9 ± 8.4%（所有数据均表示为均值±标准差，N=5）。
<img alt="显示细胞染色的荧光显微镜图像；用于分析的绿色和红色细胞检测。" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在 200 μm 电极（6 V，5 msec）上对 HeLa 细胞进行 PI 的定点递送。A）电穿孔后 2 小时进行的基于钙黄绿素的活细胞检测。活细胞由绿色荧光指示。B）红色荧光显示细胞在电极上摄取 PI。C）A 和 B 的叠加图像。白色箭头指示已发生电穿孔且仍存活的细胞。黑色箭头指示死亡细胞。A、B 和 C 中的白色圆圈表示电极的轮廓。
<img alt="荧光显微镜：绿色（A）和蓝色（B）中的蛋白质定位；细胞分析。" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用荧光标记的siRNA随机序列转染HeLa细胞。A）用Alexa 488标记的siRNA转染的HeLa细胞图像（100 μm电极，8 V，1 msec）。B）DAPI染色的细胞核图像。白色圆圈标记了电极的边缘。

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
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<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
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<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本视频文章中，我们展示了使用微电极阵列（MEA）对HeLa细胞进行位点特异性转染，所用siRNA为乱序序列。该技术的优势之一在于其适用于多种细胞系，包括原代细胞系。本实验室此前已证明该技术可用于对来自E18天大鼠的原代海马神经元培养物以及NIH-3T3细胞进行位点特异性转染，转染物为乱序siRNA序列和GFP质粒18, 19。我们还成功实现了将功能性siRNA递送至HeLa细胞以靶向内源性基因（未发表数据）。典型的商用MEA兼容光学成像（直立显微镜），可利用荧光免疫染色技术定量评估基因沉默的功能性影响。此外，MEA中的微电极可用于监测细胞（如原代神经元）在基因扰动后的电活动。MEA的独特性质使其能够在同一细胞培养物上同时开展多项实验，从而提高实验通量。目前基于MEA的系统主要局限在于转染所需siRNA量较大（400 μl的1 μM siRNA），相较于传统的化学转染方法用量较高，因而限制了系统的成本效益。这一问题可通过将微流控技术与基于MEA的系统结合来部分解决，从而将siRNA电穿孔溶液的总体积减少至几微升以下。此外，微流控技术还可实现不同siRNA分子的连续递送，从而显著提升基于MEA技术的通量。另一种方法是...

<table><tbody><tr><td>细胞培养基：&lt;br/&gt;Advanced MEM&lt;br/&gt;L-谷氨酰胺 200 mM&lt;br/&gt;青霉素/链霉素&lt;br/&gt;胎牛血清</td><td>Gibco/Invitrogen&lt;br/&gt;Himedia Laboratories/VWR&lt;br/&gt;Lonza group Ltd.&lt;br/&gt;Gibco/Invitrogen</td><td>12492-013&lt;br/&gt;95057-448&lt;br/&gt;09-757F&lt;br/&gt;16000-044</td><td>细胞培养基配制：&lt;br/&gt;在Advanced MEM中加入2% FBS、2% L-谷氨酰胺和2%青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488和罗丹明标记的乱序序列siRNA</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>1027292</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔缓冲液</td><td>Biorad Laboratories</td><td>165-2677</td><td></td></tr><tr><td>波形发生器</td><td>Pragmatic</td><td>2414A</td><td>任何能够提供所需脉冲的波形/脉冲发生器均可使用。</td></tr></tbody></table>

使用微电极阵列（mea）对贴壁细胞进行高效、位点特异性sirna转染

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

真核生物中RNAi通路的发现以及后续RNAi试剂（如siRNA和shRNA）的发展，为功能基因组学和治疗应用提供了沉默特定基因的有力方法1-8。基于RNAi的研究面临的主要挑战之一是将RNAi试剂递送至靶细胞。传统的非病毒递送技术，如大容量电穿孔和化学转染方法，通常缺乏对递送空间的精确控制，且转染效率较低9-12。近年来，阳离子脂质、阳离子聚合物和纳米颗粒等化学转染方法的进步显著提高了转染效率13。然而，这些技术仍然无法实现对递送过程的精确空间控制，而这种控制对于微型化高通量技术、单细胞研究以及细胞间相互作用的探究具有重要意义。
基因递送技术的最新进展使得贴壁细胞的高通量转染成为可能14-23，其中大多数方法采用微尺度电穿孔技术。微尺度电穿孔可实现对递送过程的精确时空控制（可达单细胞水平），并已被证明具有较高的转染效率19, 24-26。此外，基于电穿孔的方法无需像化学转染方法那样，将siRNA和DNA复合物与细胞孵育较长时间（通常为4小时），而是促使裸露的siRNA和DNA分子直接进入细胞质。因此，转染后最早可在6小时即实现基因表达27。本实验室先前已证实，可利用微电极阵列（MEA）在贴壁哺乳动物细胞培养中实现位点特异性的转染17-19。在基于MEA的方法中，遗传物质的递送是通过局部微尺度电穿孔实现的。对选定电极施加电脉冲，可在局部产生电场，从而使刺激电极区域内的细胞发生电穿孔。微电极的独立控制不仅提供了对转染过程的空间和时间调控能力，还可在同一细胞培养物上进行多次转染实验，提高实验通量，并减少不同培养物之间的变异性。
本文介绍了利用电穿孔技术将荧光标记的乱序序列siRNA靶向转染贴壁HeLa细胞的实验装置及操作步骤。该相同方案也可用于质粒载体的转染。此外，本方案经微小调整后可轻松拓展应用于多种哺乳动物细胞系。由于微电极阵列（MEA）具有预定义和定制电极图案的商业化产品，因此只要具备基本细胞培养设备的研究实验室均可采用该技术。

本文详细介绍了利用微电极阵列（MEA）在贴壁哺乳动物细胞培养物中进行siRNA随机序列位点特异性转染的实验方案。

使用微电极阵列（MEA）对贴壁细胞进行高效、位点特异性siRNA转染

真核生物中RNAi通路的发现以及随后RNAi试剂（如siRNA和shRNA）的发展，已为……提供了一种强有力的手段

以下实验的总体目标是在贴壁细胞中实现位点特异性的转染。首先，在微电极阵列上培养一层单层细胞。第二步，对选定的电极施加电脉冲，导致附着在电极表面的靶向细胞发生电穿孔。这会导致细胞膜上形成孔隙，使外源分子进入细胞。随后可利用适当的检测方法筛选靶细胞，以检测其产生的表型。本文所述的微尺度转染技术相较于传统的转染方法（如大量电穿孔或化学转染）具有多项关键优势。A，它使我们能够对转染过程本身实现精细的空间控制，即使在难以转染的细胞系中，也能高效地转染单个细胞或细胞簇。B，这是一种易于放大的方法，有助于实现高通量分子检测。使用微电极区域进行位点特异性转染的一个关键优势在于，它能够同时对靶向细胞进行功能性评估，例如定量电生理学检测和形态学变化分析。开始实验前，先将微电极阵列（MEA）放入高压灭菌器中进行灭菌，随后将灭菌后的MEA转移至超净工作台，并在接种细胞前将其置于标准的无菌聚苯乙烯培养皿中。在接种细胞前，打开超净工作台的紫外灯照射20分钟以进行消毒。如果MEA对紫外光敏感，在紫外照射期间需用无菌铝箔覆盖含有MEA的培养皿。接下来，用浓度为10微克/毫升的纤连蛋白处理MEA表面，处理时间为1至2小时，以促进细胞贴附。用去离子水清洗，并将MEA置于超净工作台中自然晾干。随后，使用胰蛋白酶-EDTA从正在培养的贴壁哺乳动物细胞系中消化收获细胞，并将细胞重悬于1毫升培养基中，调整细胞浓度至每微升100至200个细胞，用于接种。然后，在MEA上加入20至30微升含细胞的培养基液滴。确保其大小足以覆盖MEA上的所有电极。随后将含有MEA的培养皿转移至37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育2至4小时。接种细胞后，将含有MEA的培养皿从培养箱转移至超净台。随后，轻轻向MEA孔中加入400至500微升预热至37摄氏度的培养基，然后在显微镜下检查，确保细胞仍附着在MEA表面且分布均匀。接着将MEA放回培养箱。在细胞接种后8至12小时，用PBS洗涤1至2次，以去除任何死亡细胞。在典型的实验中，细胞通常在接种后24至48小时即可进行转染。为了保持电穿孔效率的一致性，建议等到细胞培养接近汇合状态时再进行电穿孔。为了实现高效的sarna转染，必须首先确定适用于特定MEA的最佳电穿孔电压脉冲参数。在此，我们描述一系列实验步骤，涉及使用碘化丙啶（propidium iodide）在电穿孔前确定最佳电穿孔参数。配制300至500微升浓度为30微克/毫升的PI冰上预冷电穿孔缓冲液，以及400微升浓度为4微摩尔的钙黄绿素AM（calcium AM）PBS溶液。随后将MEA从培养箱转移至超净工作台。从MEA中移除细胞培养基，并用PBS洗涤。然后加入300至500微升冰上预冷的含pi电穿孔缓冲液。接着在MEA中放置一个1毫米高的间隔垫。需要注意的是，必须确保其不接触MEA中心的细胞。随后，将MEA与电学接

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使用微电极阵列（MEA）对贴壁细胞进行高效、位点特异性siRNA转染

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