Name: 双突触诱发的星形胶质细胞和神经元的反应，在急性海马脑片电生理记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: 学习在急性海马脑片中进行星形胶质细胞与神经元的双突触电生理记录技术。该方法可同时监测神经元场电位和星形胶质细胞电流响应，揭示神经胶质相互作用在突触传递中的动态调控机制。

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作者谨此感谢Dana Kamalidenova、Morgan Autexier和Roch Chopier在视频与动画制作方面的贡献，以及Florian Beck提供的照片和视频配音的后期制作。本研究工作由Olympus资助，并获得HFSPO（职业发展奖）、ANR（青年研究人员项目和神经科学 blanc 项目）、FRC（脑科学研究联合会）、INSERM和巴黎皮提耶-萨勒佩特里医院（转化研究合同）向N.R.提供的资助，法国科研部和德国研究基金会向U.P.提供的博士后奖学金，以及“生命科学前沿”博士研究生院、巴黎狄德罗大学、贝当古舒勒基金会和FRM（医学研究基金会）向J.S.提供的博士研究生奖学金支持。

1. 人工脑脊液和细胞内溶液的配制
<ol>
 <li>在开始实验之前，需要配制用于膜片钳记录的细胞内液，以及用于海马组织制备的人工脑脊液（ACSF）。此外还需要一套解剖工具，包括手术剪、精细虹膜剪、两把刮匙和镊子（Fine science tools）；一个玻璃气体交换装置（微滤蜡烛，ROBU 德国）、组织网格（蚊帐或尼龙网），以及医用强力胶（Uhu Dent）。电生理脑片膜片钳系统的配置已在 Finkel 与 Bookman 于 2001 年的研究中描述1。</li>
 <li>配制细胞内液时，将以下成分（单位：mM）溶解于去离子水中（最终体积的 70–80%）：105 K-葡萄糖酸盐、30 KCl、10 HEPES 和 0.3 EGTA。将溶液冷却至 4 °C，然后加入（单位：mM）：4 ATP-Mg、0.3 GTP-Tris 和 10 磷酸肌酸。用 KOH 调节 pH 至 7.4，并用去离子水定容至最终体积（渗透压：约 280 mOsm）。用孔径为 0.2 μm 的滤器过滤该溶液。分装后可在 -20 °C 下稳定保存 3–4 周。每次实验日约需 1 ml 细胞内液。</li>
 <li>除非另有说明，用于海马组织制备及 CA1 区细胞记录的 ACSF 含有以下成分（单位：mM）：119 NaCl、2.5 KCl、2.5 CaCl2、1.3 MgSO4、1 NaH2PO4、26.2 NaHCO3 和 11 葡萄糖。将这些盐类溶解于去离子水中（渗透压约 320 mOsm），并用碳合气（95% O2 和 5% CO2）充氧至少 10 分钟（pH 约 7.3–7.4）。每次实验至少准备 1 升溶液。对于将用于海马 CA3 区实验的组织制备需特别注意。该区域容易产生癫痫样活动并导致继发性神经元死亡。因此，在脑片制备过程中应显著降低突触活动，这可通过在冰冻的蔗糖溶液中进行海马解剖来实现，该溶液含有（单位：mM）：87 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl2、7 MgCl2、1 NaH2PO4、25 NaHCO3、10 葡萄糖和 75 蔗糖。在此溶液中，低钠、低钙和高镁浓度的组合可大幅降低突触前放电和递质释放概率，以及突触后 NMDA 受体活性，从而最大限度地减少自发活动和细胞死亡。制备完成后，用于 CA3 区细胞记录的海马脑片应使用改良 ACSF 灌流，其中含有 4 mM CaCl2 和 4 mM MgSO4，以最小化多突触活动。</li>
</ol>
2. 急性海马脑片制备
<ol>
 <li>在持续用碳氧混合气体（carbogen）供氧的同时，将约 300 ml 的 ACSF 冷却至 4 °C，用于切片室及实验前的准备。另准备一个盛有室温（RT）ACSF 的小烧杯用于切片储存，并同样用碳氧混合气体供氧（见图 1）。 </li>
 <li>在通风橱内，将浸有 1 ml 异氟烷（isoflurane）的小纸巾放入小鼠笼中，对小鼠进行麻醉。 </li>
 <li>待小鼠深度麻醉后，迅速断头并立即放入盛有冰冻且经氧合的 ACSF 小培养皿中。用小剪刀去除头皮，然后将头部转移至组织纸上进行后续操作。按照图 1所示及描述的方法开始解剖海马体。 </li>
 <li>在冰冻且经氧合的 ACSF 中，以低速（3 μm/sec）和 70 Hz 的振动频率切割 300–400 μm 厚的横切片，并将切片转移至储存容器中。记录前，让切片在室温（RT）下静置至少 1 小时。用于 CA3 区实验的切片需先在 34 °C 下孵育 25 分钟，再于室温下至少恢复 30 分钟，以从切片过程中恢复。 </li>
</ol>
3. 诱发星形胶质细胞电流与神经元场电位的双通道记录
本文介绍如何记录突触诱发的星形胶质细胞和神经元反应，i.e. 通过细胞外电极刺激传入纤维激活突触所诱导的反应。
<ol>
 <li>持续用含氧的人工脑脊液（ACSF，1.5–2 ml/min，室温）灌注记录室，其中含100 μM 荷包牡丹碱（picrotoxin，GABAA受体拮抗剂），以分离兴奋性反应。将脑片转移至经多聚赖氨酸（1.5 至 3 mg/ml）包被的盖玻片上，吸去多余液体以确保脑片良好贴附，并在脑片上方滴加一滴ACSF。将盖玻片放入记录室中。荷包牡丹碱对抑制性传递的阻断可能导致癫痫样活动，即神经元群体的自发性同步放电，这会干扰诱发电事件的测量。因此，为防止癫痫样活动，应在CA1与CA3区域之间进行一次浅表的平面切割（仅切表面），以阻断通过Schaffer侧支的信号传播（如图2a所示）。</li>
 <li>辐射层（stratum radiatum）星形胶质细胞可通过其较小的胞体（约10 μm）和星状突起结构进行识别。选择一个位于脑片表面下至少20–30 μm的细胞。将玻璃刺激电极（尖端电阻约1 MΩ）安装在连接至刺激隔离器并接地（浴液接地点，可通过将第二根银丝缠绕在玻璃微电极上实现）的银丝上。将刺激电极置于Schaffer侧支区域，如图2A所示，距离所选星形胶质细胞200–300 μm处。将场电位记录电极（约2–5 MΩ）安装在连接至放大器前置放大器的氯化银丝上。两根电极均预先用ACSF填充。在多钳制模式（multiclamp）中选择I=0模式，该模式禁用外部指令输入，并将记录电极置于距星形胶质细胞约50 μm的辐射层区域（图2A）。以增益2至10进行记录，并使用2 kHz贝塞尔滤波器进行滤波。向脑片注入电刺激电流可触发周围Schaffer侧支轴突的动作电位，进而引起投射至CA1区锥体神经元突触后膜的突触前末梢释放神经递质。释放的递质将通过突触后离子型受体引发正电荷内流，该过程可在细胞外记录为微小的负电位。这种场兴奋性突触后电位（fEPSP）整合了同时激活的一组神经元的活动，而抑制性传递则已被药物阻断。施加若干测试脉冲（持续时间0.1 msec）以诱发出fEPSP；适当调整刺激电极位置可能有助于增强fEPSP。典型的CA1区辐射层fEPSP如图2B所示。有关电极定位与反应波形的更多细节可参见Yuan 等 20032。在健康海马脑片中，fEPSP的幅度通常应超过纤维放电（fiber volley）幅度的两倍以上。为准确量化fEPSP的幅度或斜率，所诱发出的反应应为单突触性；多突触活动（表现为多峰反应）表明存在独立于电刺激的突触活动，可能是神经元高兴奋性的标志。对于在海马CA3区进行的实验，刺激与记录电极的位置如图3C所示。为明确识别具有强易化特性的苔藓纤维输入，应施加成对脉冲刺激（脉冲间隔50 msec）以及持续数秒的1 Hz刺激，以显著增强初始幅度较低的fEPSP反应。实验结束时，可灌注mGluR2/3受体拮抗剂DCGIV，以进一步验证是否确实激活了苔藓纤维输入。由于苔藓纤维末梢高表达mGluR2/3受体，该拮抗剂的应用应使fEPSP幅度降低约90%，从而抑制突触前递质释放。</li>
 <li>用过滤后的细胞内液填充膜片钳电极（约2–5 MΩ），并将其安装在连接至第二个前置放大器的氯化银丝上，通过连接至电极夹持器的注射器施加正压。持续施加20 msec、10 mV的测试脉冲，并将电极移入组织，直至到达细胞表面并观察到膜电位偏转。将电极偏移量调零，撤去正压，并将膜电位钳制在–80 mV。等待吉欧封接（gigaseal，至少1 GΩ）形成（通常不应超过数秒）。轻柔施加负压可能有助于形成吉欧封接。通过短暂施加负压或使用多钳制模式中的“zap”功能进入细胞内。开始同步记录Schaffer侧支诱发出的fEPSP及星形胶质细胞反应（电压钳模式，Vhold –80 mV；刺激频率0.1 Hz；贝塞尔滤波器2 kHz；增益10）。星形胶质细胞的电流反应呈双相性：首先出现快速瞬时的外向电流，反映邻近锥体细胞产生的fEPSP；随后出现缓慢上升并缓慢衰减的内向电流（在神经元反应终止后仍可持续数秒（&gt; 10 sec））。该电流主要由周围去极化的突触后末梢释放钾离子后进入星形胶质细胞所致。由突触前释放谷氨酸触发的快速瞬时谷氨酸转运体电流（GLT）被钾电流所掩盖。在整个实验过程中应持续监测星形胶质细胞的钳制电位及膜片钳的串联电阻，其变化不应超过约20%，以避免因记录条件改变而导致对星形胶质细胞反应的误判。仅应选择初始钳制电位&gt; –70 mV的星形胶质细胞进行研究，以确保细胞处于健康状态。</li>
 <li>切换至电流钳模式，以记录诱发出的星形胶质细胞膜去极化。通过灌注离子型谷氨酸受体阻断剂犬尿烯酸（kynurenic acid，5 mM）来分离胶质细胞谷氨酸转运体（GLT）电流，直至fEPSP完全被阻断且GLT电流幅度达到平台期。为明确识别GLT电流，可施加特异性拮抗剂DL-threo-β-苯甲氧基天冬氨酸（DL-TBOA，200 μM）。将刺激强度提高2至5倍，以在不同突触强度下记录神经元与星形胶质细胞的反应，并施加两个间隔较近的刺激（间隔50 msec）以研究成对脉冲刺激下的反应。在整个记录过程中应持续监测胶质细胞的串联电阻与膜电位的稳定性。</li>
 <li>为可视化缝隙连接介导的星形胶质细胞网络的范围，应在电流钳模式下进行染料偶联实验，且不施加任何电流注入，以允许低分子量染料（&lt; 1.5 kDa），如磺酰罗丹明B（sulforhodamine-B），通过缝隙连接通道被动扩散。为尽量减少染料向周围组织的溢出，在电极进入组织时应通过膜片钳电极短暂施加正压，并尽快形成封接。</li>
</ol>

<ol><li>Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinkel%2C+A+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. Crawley, J. N., et al. , (2001).</li>
<li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+release+monitored+with+astrocyte+transporter+currents+during+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP.</a> Neuron. 21, 425-433 (1998).</li>
<li>Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+glutamate+release+during+LTP+with+glial+transporter+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents.</a> Neuron. 21, 435-441 (1998).</li>
<li>Pannasch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+networks+scale+synaptic+activity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).</li>
<li>Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-evoked+increases+in+extracellular+potassium+modulate+presynaptic+excitability+in+the+CA1+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus.</a> J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+buffering+during+slow+and+paroxysmal+sleep+oscillations+in+cortical+networks+of+glial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transporters+buffer+synaptically+released+glutamate+on+a+submillisecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).</li>
<li>Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+clearance+and+synaptic+efficacy+by+glial+coverage+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons.</a> Science. 292, 923-926 (2001).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+contribution+to+glutamate+uptake+at+Schaffer+collateral-commissural+synapses+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporter+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature. 1, 1235-1247 (2006).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Castro, M. A. D. i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nature. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature. 13, 759-766 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

同时记录突触诱导的神经元和胶质细胞反应是研究与星形胶质细胞特性变化相关的突触前和突触后活动实时改变的有用方法。突触诱发的胶质细胞膜去极化是细胞外钾离子升高的直接测量指标8，部分原因在于突触前动作电位的发放，但主要归因于突触后去极化 7因此，胶质细胞膜电位动态的记录可用于研究突触前兴奋性、突触后活性、细胞外空间体积以及钾离子缓冲能力的改变。6, 8星形胶质细胞谷氨酸转运体电流是突触前谷氨酸释放的敏感指标，能够监测释放概率的短期变化3, 5, 9此外，还可用于表征不同突触或不同发育阶段的功能性突触-胶质细胞相互作用10需要强调的是，GLTs 对温度高度敏感。11 并由Na的电化学梯度驱动+，K+ 和 H+12因此，GLT电流的幅度和动力学特性在很大程度上取决于所选择的实验条件。此外，已知从记录的GLT电流推导出的星形胶质细胞谷氨酸清除的实际时间进程部分受到掩盖。这是由于GLT电流会受到星形胶质细胞的电紧张特性或递质释放的非同步性等因素的滤过作用，从而导致其动力学特征发生畸变。13提取滤波机制时间特征的方法已经得到开发，可用于推导生理或病理情况下谷氨酸清除的实际时间过程，正如近期研究所实现的那样6,13,14此外，在电流钳模式下同时记录星形胶质细胞膜去极化，可为细胞外钾离子瞬变的可能改变提供线索。单个星形胶质细胞可接触约100个不同神经元的多达100,000个突触，因而能够整合并调节局部神经元网络的活动。 
使用此处介绍的技术时， 即 记录星形胶质细胞的电生理全细胞反应以研究基础突触活动时，应注意：对星形胶质细胞胞体进行膜片钳记录所检测到的电流主要来源于细胞胞体或近端突起。实际上，仅当多个细小远端突起中受体和通道强烈激活并产生可传播至胞体的电流时，胞体处才能部分检测到来自这些细小远端突起的电流。因此，覆盖突触区域的单个微小星形胶质细胞突起中基础的受体和通道活动极难被检测到。这在一定程度上是由于全细胞膜片钳记录对星形胶质细胞膜电流和膜电位的空间与时间控制能力有限所致 原位然而，需要注意的是，大量微小星形胶质细胞突起的表面积远远超过胞体和主要突起的膜面积。此外，这些突触周围星形胶质细胞微区含有功能相关的受体和通道，可能在神经-胶质细胞通讯及突触调节中发挥重要作用。因此，本文所介绍的技术主要用于研究星形胶质细胞对神经元集群同步活动的整合，尤其是在传入刺激期间发生的此类活动。该技术不适用于研究在基础自发活动中单个突触与邻近细小星形胶质细胞突起之间的相互作用。若要研究由基础突触活动诱导的局部星形胶质细胞反应，一种替代方法是对细小突起进行膜片钳记录，类似于在树突中所开展的操作。15尽管由于这些精细的星形胶质细胞突起体积微小，对其进行膜片钳记录可能具有较大挑战性，但这一方向值得探索，以揭示星形胶质微区与单个突触之间更为密切的相互作用。然而，源自单个精细星形胶质突起的电生理学反应可能非常微弱，其信号幅度或低于检测阈值，因为在膜片钳记录中电噪声平均水平可达3–5 pA。研究星形胶质细胞对突触活动反应的另一种方法是钙成像，因为神经活性物质激活星形胶质细胞膜受体或转运体后可引发细胞内钙瞬变。然而，通过整体负载钙指示剂的方式标记星形胶质细胞，可能主要反映的是胞体部位的钙活动16电生理学与钙成像相结合，还能检测到来自星形胶质细胞精细突起的微小钙信号，这些信号可自发产生，也可由微弱的突触刺激诱发。17, 18然而，需要注意的是，高亲和力的钙指示剂可能起到类似钙缓冲剂的作用，从而抑制重要的钙信号通路；而低亲和力指示剂则可能因信号低于检测限而无法有效工作。最后，一种优雅且非侵入性的技术可用于研究星形胶质细胞细小突起中的钙事件，该方法还能避免全细胞膜片钳记录过程中细胞内信号分子的流失，即使用可靶向细胞膜表达的钙传感器，并在星形胶质细胞中表达该传感器。 原位以及 体内19然而，钙成像只能提供关于一种信号分子的信息，该分子参与许多但并非所有的细胞活动；而全细胞膜片钳技术则能够提供有关通道和受体激活后所引发的各种离子电流的定量信息。因此，对神经元和星形胶质细胞进行同步的电生理记录，是实时解析神经-胶质离子信号动态变化及其在脑信息处理中作用的独特而强大的方法。

<table><tbody><tr><td>苦味毒</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>犬尿烯酸</td><td>Tocris</td><td>0223</td><td>在 34 &amp;deg;C 搅拌或超声溶解</td></tr><tr><td>DL-TBOA</td><td>Tocris</td><td>1223</td><td>DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

星形胶质细胞与神经元共同形成三联突触，在其中整合并调节神经元活动。实际上，星形胶质细胞通过其离子通道和神经递质受体的激活来感知神经元输入，并部分通过活动依赖性的胶质递质释放来处理信息。此外，星形胶质细胞构成了谷氨酸的主要摄取系统，参与钾离子的空间缓冲以及GABA的清除。因此，这些细胞持续监测突触活动，可作为突触释放的谷氨酸、GABA和细胞外钾离子水平变化的敏感指标。此外，星形胶质细胞摄取功能或缓冲能力的改变可能对神经元功能产生严重影响，在研究病理生理状态或基因敲除小鼠时可能被忽视。因此，同时记录神经元和星形胶质细胞活动是一种重要的方法，可用于研究突触强度的变化及其与星形胶质细胞摄取和缓冲能力同步改变之间的关联。本文中，我们描述了如何制备海马脑片，如何鉴定stratum radiatum区的星形胶质细胞，以及如何同时记录神经元和星形胶质细胞的电生理反应。此外，我们还介绍了如何通过药理学手段分离突触激活诱发的星形胶质细胞电流。

海马CA1区突触诱发的星形胶质细胞和神经元反应（fEPSPs）的代表性同步记录如图所示 图2 A-B诱发的星形胶质细胞电流呈双相性，即包含一个瞬时外向电流和一个缓慢衰减的内向电流（&gt; 10 秒）（图2B）。外向电流反映了诱发的fEPSP，且在通过犬尿酸（kynurenic acid）抑制离子型谷氨酸受体后被阻断（深灰色迹线， 图2B)3. 大部分慢内向电流反映了突触后去极化后钾离子进入星形胶质细胞的过程，因为该电流也可被犬尿酸阻断，而犬尿酸可抑制突触后离子型谷氨酸受体的活性（图2B 和 图2C1)3-6，已知是钾释放的主要来源（80%）7. 剩余快速上升和衰减的内向电流被GLT拮抗剂DL-TBOA抑制（浅灰色迹线， 图2B 和 图2C2）。通过事后从犬尿酸（深灰色迹线）中的电流减去TBOA中的残余慢电流（浅灰色迹线），可分离出纯星形胶质细胞谷氨酸转运体电流（黑色迹线），如图所示 图2C2在犬尿酸和TBOA中的持续缓慢衰减电流（浅灰色迹线， 图2B 和 图2C2) 可被TTX阻断（数据未显示），最可能反映了细胞外K⁺的积聚+ 在突触前传入神经元放电期间释放3. 对Schaffer侧支进行中等强度的单次刺激，与在同一细胞中记录到的微弱诱发电位去极化相比，可诱导出相对较大的突触诱发性星形胶质细胞电流图 2D）。这是由于星形胶质细胞的膜电阻较低。所记录的突触刺激诱发的星形胶质细胞膜电位动态变化，如图所示 图 2D是局部细胞外钾离子水平的直接测量指标8将诱发的星形胶质细胞反应归一化至基础神经元活动，可实现不同实验间的直接比较，正如近期研究所示。6星形胶质细胞电流还能非常可靠地监测兴奋性传递的变化，因为突触诱发的星形胶质细胞总电流随fEPSP的增加呈线性变化图2E）。星形胶质细胞电流也反映短时程突触可塑性，因为它们与神经元类似，表现出成对脉冲易化（图2F). CA1锥体细胞与星形胶质细胞的成对全细胞记录揭示了两种细胞类型截然不同的电生理行为：神经元在去极化脉冲刺激下产生动作电位，而邻近的星形胶质细胞则无反应图3A-B）。然而，对Schaffer侧支进行适度刺激时，可同时在CA1锥体细胞中诱发快速兴奋性突触后电位，并在邻近的星形胶质细胞中诱发快速外向电流和慢速内向电流图3B2）。海马CA3区的突触诱发神经元和星形胶质细胞反应的双记录也可被记录，如图所示 图3C事实上，在基础条件下，单次刺激CA3苔藓纤维仅能引发微弱的神经元反应，记录为局部fEPSPs，同时伴随星形胶质细胞产生微弱的快速外向电流和缓慢内向电流。图3D1）。相比之下，以1 Hz刺激CA3苔藓纤维数秒钟，可显著增强fEPSP，而对星形胶质细胞反应的增强作用则较弱（图3D2). 
<img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig1.jpg" alt="牙齿修复过程；多个步骤，系列照片，实验装置，窝洞充填。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 海马体分离以制备横切脑片。解剖脑组织时，沿颅骨中线切开（a）。在嗅球水平进行冠状切面（b），随后在小脑水平再次进行冠状切面（c）。借助镊子小心移除颅骨（d），用刀片将两个半球分开（e），并将半球转移至小勺中，放入冷的含氧人工脑脊液（ACSF）中（f）。经过约5分钟平衡后，将一个半球置于干燥滤纸上，内侧面向上（g）。借助两个小勺，移除间脑组织（h-j）。此时海马体已清晰可见，如虚线所示（k）。从可见的白色结构——穹窿处开始，用小勺将海马体完整剥离（l-m）。将分离出的海马体重新放回冷的ACSF中。制备一小块琼脂糖凝胶，将两个海马体腹侧朝上，海马体腹侧朝向琼脂块边缘放置，并小心吸去所有液体，使其牢固附着于琼脂块上（n）。将附着于琼脂块上的海马体黏附至切片机的腹侧部分（o）。
<img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="星形胶质细胞电流分析；电生理迹线示意图；fEPSP，膜电位。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 海马CA1区突触诱发的神经元与星形胶质细胞的同步反应。A) 海马脑片示意图，展示刺激电极的位置（用于激活Schaffer侧支，SC）、记录星形胶质细胞电流的膜片钳电极，以及记录fEPSP的细胞外电极，fEPSP由海马CA1区SC刺激诱发。B) 在药物存在条件下，SC刺激诱发的fEPSP（上图）和星形胶质细胞电流（下图）的代表性同步记录迹线。首先在GABAA受体阻断剂（毕可毒素，100 μM，黑色迹线）存在下记录反应，以分离兴奋性反应。随后施加离子型谷氨酸受体阻断剂（犬尿酸，5 mM，深灰色迹线），可抑制fEPSP及大部分持久性星形胶质细胞电流，从而揭示出一个微小而快速的瞬时组分，该组分对谷氨酸转运体阻断剂（TBOA，200 μM，浅灰色迹线）敏感。标尺：fEPSP 0.1 mV，星形胶质细胞电流 15 pA，10 毫秒。C1) 星形胶质细胞钾电流（1-2）的示例迹线，该电流可通过从总电流（1）中减去犬尿酸存在下的残余电流组分（2）而从诱发反应中分离得到（见B图下图黑色迹线）。标尺：20 pA，1 秒。C2) 谷氨酸转运体电流（2-3）的示例迹线，通过从犬尿酸中的电流（2）减去TBOA不敏感的慢组分（3）获得。标尺：2.5 pA，25 毫秒。D) SC刺激诱导的星形胶质细胞内向电流在电压钳模式下的记录迹线（下图）及其在电流钳模式下对应的膜去极化（上图）。标尺：电流钳 1.5 mV，电压钳 5 pA，1 秒。E) 输入-输出曲线，显示突触前纤维锋电位（输入）与同时记录的总星形胶质细胞电流（输出）之间的关系（n = 6）。星形胶质细胞电流随纤维锋电位增强呈线性增加，与神经元fEPSP类似。F) 在40毫秒刺激间隔的双脉冲刺激下，神经元反应（fEPSP）与星形胶质细胞电流的示例迹线。突触诱发的星形胶质细胞电流与神经元一样，表现出双脉冲易化现象。标尺：0.1 mV，5 pA，20 毫秒。
<img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="神经元和星形胶质细胞电流、fEPSP、电生理装置、海马切片示意图。" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 海马CA1和CA3区域突触诱导的神经元与星形胶质细胞反应的双通道记录。A) 利用全细胞膜片钳技术，向CA1锥体细胞注入磺酰罗丹明B（红色，0.1%）并用荧光素葡聚糖（绿色，0.1%）填充星形胶质细胞后的细胞重建图。比例尺，10 μm。B1) 在电流钳模式下同时记录CA1锥体细胞和邻近星形胶质细胞膜电位的代表性轨迹。通过注入20 pA去极化电流脉冲诱发的神经元动作电位（黑色轨迹）在邻近星形胶质细胞中未引起任何反应（灰色轨迹）。比例尺，20 mV、10 pA、100 msec。B2) 在夹竹桃麻素（100 μM）存在条件下，对CA1锥体细胞进行电流钳记录、邻近星形胶质细胞进行电压钳记录，并在刺激斜角线（SC）后获得的典型双通道全细胞记录轨迹。SC刺激诱发兴奋性突触后电位（EPSP，黑色轨迹），同时伴随微弱而持久的星形胶质细胞电流（灰色轨迹）。比例尺，5 mV、10 pA、100 msec。C) 海马切片示意图，显示在齿状回（DG）和CA3区域中，刺激电极用于激活苔状纤维，记录星形胶质细胞电流的膜片钳电极（灰色），以及记录由CA3苔状纤维刺激诱发的fEPSP的细胞外电极的布置方式。D, E) 对CA3苔状纤维以0.02 Hz（插图中放大显示）（D1）或1 Hz刺激频率（D2）进行单次刺激时，成对记录的CA3 fEPSPs（上图，D1和D2中的黑色轨迹）和星形胶质细胞全细胞反应（下图，D1和D2中的灰色轨迹）的代表性轨迹。D1和D2的比例尺：0.2 mV、15 pA；时间：D1为1秒；D2为100 msec。插图比例尺：0.1 mV、100 msec。

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。

星形胶质细胞与神经元共同形成三联突触，在其中整合并调节神经元活动。实际上，星形胶质细胞能够感知神经元输入……

经典的观点认为，突触前与突触后结构之间的通讯涉及动作电位到达突触前末梢，通过钙离子浓度升高触发谷氨酸释放，从而激活突触后受体。然而，由于发现星形胶质细胞与突触结构紧密接触并表达神经递质受体，这一观点已转变为“三联突触”的概念。因此，持续的谷氨酸能传递也会激活星形胶质细胞，并引发其胞内钙离子浓度升高。胶质递质的释放可与突触外或突触内的受体结合，从而调节突触前和突触后的活动。此外，星形胶质细胞表达主要的谷氨酸摄取系统，用于清除突触释放的谷氨酸。同时，它们通过自身的钾离子通道清除动作电位发放及随后突触后激活过程中从突触前和突触后末端释放的钾离子。这种钾离子随后在细胞内被转运至细胞外钾离子浓度较低的区域，并通过缝隙连接释放或扩散到邻近的星形胶质细胞。因此，星形胶质细胞通过调控细胞外神经活性物质的浓度以及释放神经递质，在决定突触活动强度方面发挥着重要作用。我的实验室致力于研究神经胶质相互作用在脑部生理病理过程中的作用。因此，我们已广泛使用并不断完善这一技术，以揭示星形胶质细胞在突触传递瞬时过程中的作用机制。事实上，该技术非常强大，因为它能够在线同时监测神经元的动态电生理反应。今天，在Osteocytes Evap诊所，实验室成员Ash和Jeremy Siebel将向您演示如何实施该技术，并为您解释它如何帮助我们揭示神经元与星形胶质细胞之间密切而深入的对话。我通过同时记录神经元活动以及星形胶质细胞的钾离子和谷氨酸转运事件，研究了星形胶质细胞网络对神经元、突触传递和可塑性的影响，发现星形胶质细胞网络有助于在神经活动期间促进细胞外钾离子和谷氨酸的清除。我研究了星形胶质细胞活动的固有特性及其可塑性，并探讨其与神经生理学的关系。在记录星形胶质细胞和神经元诱发活动的过程中，我得以确定星形胶质细胞对神经元激活的响应主要通过钾离子电流介导。这些电流具有自身的电生理可塑性，但并不调控神经元的兴奋性与可塑性。换句话说，即星形胶质细胞的计时活动，尤其是高度兴奋的状态。神经元。本文将介绍一种重要的方法，通过在急性海马脑片中同时记录星形胶质细胞膜电流和由突触前纤维刺激诱发的尿路场电位，以同步研究尿路系统与星形胶质细胞的活动。此外，我们将对单个神经元及其邻近的星形胶质细胞进行配对记录，以研究神经元活动期间星形胶质细胞的糖反应。我们选择海马体，因为该区域具有显著的解剖和功能区室化特征，并且在神经环路、突触活动及可塑性方面已有充分表征。实验开始时，先准备海马脑切片，首先制备冰冻的含氧人工脑脊液。人工脑脊液，深度麻醉小鼠后迅速断头并转移至A CSF中。用三处切口打开颅骨，分离两个半球。最后，将它们转移至充氧的A CSF中。均匀地静置约五分钟。现在从一个半球开始。海马体的解剖首先需去除中脑。本图展示了详细的海马体解剖过程。首先将分离出的大脑半球置于其皮层位置，以暴露中脑。借助两把勺子，去除中脑。此时海马将如虚线所示可见。从可见的宽大结构——峡部开始，用勺子将海马分离出来。将勺子插入海马下方，并用第二把勺子辅助，切下与海马相邻的皮层。将海马体转移至含有充氧人工脑脊液（A CSF）的小型培养皿中，并继续处理第二个半球。将两个海马体置于一小块琼脂（AGA）块上，腹面朝上。现在吸除人工脑脊液（DS A CSF）。将海马体粘附到切片室装置上。将海马体转移至切片室，切成300或400微米厚的切片。将切片收集到充氧的储存室中，在室温下静置至少一小时，以进行单个星形胶质细胞的全细胞记录。将海马体切片转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上。吸去多余的 aCSF，使海马脑片能够贴附于多聚物包被的盖玻片上，随后重新在脑片上添加 aCSF。将脑片转移至记录舱中，持续以含氧 aCSF 灌流，灌流速度为每分钟 1 至 2 毫升。为识别星形胶质细胞，可使用在星形胶质细胞特异性 GFAP 启动子驱动下表达 EGFP 的小鼠进行膜片钳记录。使用含有罗丹明染料的过滤冷细胞内液填充电阻为四到六兆欧姆的玻璃电极，可使贴附的星形胶质细胞呈现红色，而绿色荧光蛋白（EGFP）标记的邻近星形胶质细胞则显示为绿色。在GFAP启动子驱动下，星形胶质细胞可通过其约10微米的小胞体尺寸以及主要突起的分支结构进行识别，通常包括三至四个分支。通过管路将注射器连接至移液管，可在命令窗口中下降进入组织时施加正压，触发一个10毫伏的测试脉冲并重置保持电流。然后借助显微操作器将移液管移入组织，以接近细胞。当到达细胞表面时，继续推进，直到观察到表面出现凹陷，表现为光线偏转，表明细胞表面已发生轻微形变。由于施加正压，星形胶质细胞的细胞膜将紧密贴附在玻璃移液管尖端开口处，当达到吉欧密封时，可通过电阻增加来观察到这一现象。通过在命令窗口中观察测试部分，同时轻柔施加负压，进入整体配置模式进行电容补偿。当电流穿过细胞膜时，可观察到细胞膜破裂进入细胞内部。施加一系列超极化和去极化电压阶跃，可表征星形胶质细胞正常的细胞膜特性。星形胶质细胞通常仅表现出被动电流反应。在电流钳模式下注入电流不会引发动作电位，进一步证实所记录的细胞确为星形胶质细胞。在记录电极内液中加入示踪剂（如硫黄素或 Alexa Fluor B），可实现对所记录星形胶质细胞的可视化。此外，在电流钳模式下，示踪剂被动扩散20分钟，可显示通过缝隙连接相互连接的邻近星形胶质细胞，从而实现对神经元兴奋性传递以及随后诱发的星形胶质细胞电流的双记录。我们首先使用普鲁卡因阻断抑制性传递，以防止在缺乏GABA能传递时出现的过度兴奋性。随后，使用小型虹膜刀切断介导CS3与C1之间侧支的连接。然后，我们放置一个脑脊液（CSF）场刺激电极、一个场记录电极以及星形胶质细胞的膜片钳电极。在海马脑片中，我们选择一个星形胶质细胞，并将场电极置于距离该细胞 5、200 微米的位置，以确保星形胶质细胞能够整合到场电极刺激Schaffer侧支所记录到的活动，该刺激将诱发兴奋性场电位。该场电位包括反映被刺激轴突数量的纤维斜坡（fiber volley），以及随后的突触后去极化，从而实现神经元场电位与星形胶质细胞全细胞电流反应的双通道记录。首先，将场电位记录电极放置在距离所选星形胶质细胞约 50 微米的位置。然后将膜片钳电极移至星形胶质细胞的胞体并进行膜片钳记录，通过其被动性膜特性确认该细胞确为星形胶质细胞。现在，通过刺激 Shaer Cs，我们可以同时记录神经元活动以及随之产生的星形胶质细胞电流，该电流表现为持续时间较长的 50 皮安反应，这是由于星形胶质细胞之间存在网络连接，且单个星形胶质细胞可接触多达 100 个神经元的突触所致。这些细胞整合大量同时激活的突触活动，通过双全细胞记录技术对单个神经元及其邻近的星形胶质细胞进行记录，将两个膜片电极插入海马脑片的辐射层区域。在C一区确定一个感兴趣的神经元，并在其相同深度、约20至60微米远处定位一个星形胶质细胞，然后将两个移液管置于各自细胞上方约10微米处，同时施加正压。星形胶质细胞记录用移液管应尽可能靠近目标星形胶质细胞，以避免进一步的机械移动。首先，在神经元上形成gga封接。接着进行星形胶质细胞的膜片钳制，后者通常比神经元封接速度更慢。为总结进行双全细胞记录的关键步骤：首先将两个记录电极管下降至脑片中。接近星形胶质细胞的胞体，然后在神经元上形成giga封接，再对星形胶质细胞进行giga封接以完成操作。神经元的膜电阻通常远高于星形胶质细胞，其中锥体神经元的膜电阻约为200至500兆欧。当两个细胞均建立封接后，将系统切换至电压钳模式，并施加超极化脉冲，此时神经元中会激活瞬时钠电流，而星形胶质细胞中则产生被动性钾离子反应。本文结果显示，通过刺激shaa侧支诱导快速兴奋性突触后场电位，可引发随后持续较长时间的电流反应。在邻近的星形胶质细胞中，使用雷米酸抑制离子型谷氨酸受体表明，大部分星形胶质细胞电流源于兴奋性突触后激活。剩余的B AIC反应包括对TBOA敏感的快速瞬时谷氨酸转运事件以及微弱的持久性电流，后者很可能源于动作电位期间突触前钾离子的释放。由于突触后电流与突触前活动增强呈线性关系，因此该电流能够非常可靠地监测突触后活动。此外，星形胶质细胞的电流表现出类似于神经元反应的成对脉冲易化现象。对沙尔侧支进行中等强度的单次刺激，会诱导产生相对较大的突触诱发星形胶质细胞电流，相比之下，在相同细胞中采用电流钳模式记录到的诱发去极化则较小。这归因于星形胶质细胞较低的膜电阻。通过成对记录神经元及其邻近星形胶质细胞的突触诱发全细胞膜电位动态，可直接反映局部细胞外钾离子水平。我们观察到，当神经元产生动作电位时，星形胶质细胞并未出现电流反应，表明二者之间不存在电耦合；而在齿状回CA3区诱发的兴奋性突触后电位却可引发星形胶质细胞的电流反应。此外，单次刺激在CA3区显著增强了神经元的反应，但仅中度增加了星形胶质细胞的电流反应。观看本视频后，我们应该能够更好地理解如何建立并成功实施神经元与胶质细胞的双电生理记录。利用该技术，您可以研究神经元与星形胶质细胞之间与特定电生理反应相关的实时动态信号传递。特别是，您可以探究涉及铁离子通道功能与调控的新型胶质-神经元相互作用是否有助于界定生理或病理状态。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

双突触诱发的星形胶质细胞和神经元的反应，在急性海马脑片电生理记录

本视频演示了在浸没式记录舱中放置脑切片以记录突触活动的操作流程。该过程包括将切片固定在镜片纸上，持续灌注人工脑脊液（aCSF）以维持神经元的活性，以及将刺激电极和记录电极准确地定位在特定的目标脑区附近。该装置可实现对基础突触活动以及电刺激效应的精确监测。...

记录急性海马脑片中的神经元场兴奋性突触后电位

本视频演示了一种在大鼠海马脑片上记录CA3-CA1突触反应的方法。该方法概述了将刺激电极和记录电极放置于海马脑片上的步骤，并通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSP）来评估突触反应强度。...

记录大鼠海马脑片中CA3-CA1突触反应

我们提供了一种详细的方案，用于在海马CA1区诱导长时程增强效应，并随后从已强化的脑片区域分离出核富集组分。该方法可用于在学习与记忆的细胞模型中确定活动依赖性的核蛋白入核过程。...

从海马脑片中分离CA1区核富集组分以研究突触-核信使蛋白的活性依赖性核转运

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

通过调控神经元放电频率诱导星形胶质细胞受体的可塑性

配对记录是指对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，从而能够精确地表征单个神经元之间突触的电生理学和药理学特性。本文详细描述了在具备电生理学实验条件的任何实验室中，于海马脑片组织培养上建立该技术的具体方法和所需条件。...

器官型海马切片中的成对全细胞记录

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利用啮齿类动物急性海马脑片研究突触标记/捕获及交叉捕获

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我们在海马脑片中使用记录和刺激电极，并在活体背侧海马中纵向放置记录和刺激电极，以诱发细胞外突触后电位，并证明沿纵向跨层CA1区的长时程突触可塑性。...

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