肽:MHC四聚体为基础的抗原表位特异性的T细胞的富集
October 22nd, 2012
此协议描述了使用的肽:MHC四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性的T细胞群体，并通过流式细胞术分析它们。这种方法能够直接研究内源性T细胞群的兴趣
以下实验的总体目标是从小鼠的内源性 T 细胞库中鉴定罕见的表位特异性 T 细胞。这是通过首先用肽 MHC 四聚体试剂对收获的淋巴细胞进行染色来实现的，该试剂将荧光标记相关的表位特异性 T 细胞。然后用与四聚体上荧光标签特异性抗体偶联的磁性微珠对这些四聚体标记的细胞进行染色。
接下来，磁性标记的细胞通过磁化柱，以富集样品中的四聚体结合表位特异性 T 细胞。最后，对细胞进行所需的实验细胞标志物染色，并进行多参数流式细胞术以检测和定量稀有的富含四聚体的特异性表位 T 细胞群。与 TCR 转基因 T 细胞过继转移系统等其他现有方法相比，使用该技术的主要优点是，研究是在免疫系统内自然发育的表位特异性 T 细胞的真实多克隆群上进行的。
此外，该技术提供的高检测灵敏度使得当这些种群以极低的频率存在时，可以对其进行研究。这种方法可以帮助回答免疫学领域的许多关键问题，例如有多少幼稚 T 细胞可以从病原微生物中识别给定抗原，以及表位特异性 T 细胞群的克隆组成在整个免疫反应过程中如何变化。在开始解剖之前，将 1 毫升完整的 EHAA 培养基加入含有一小块 100 微米尼龙网的 60 毫米培养皿中，然后将培养皿置于冰上。
然后从安乐死的小鼠中取出脾脏和尽可能多的易于接近的淋巴结。将纸巾放在培养皿中的尼龙网顶部。使用封闭的 1.5 毫米微型离心管的平顶轻轻捣碎尼龙网上的淋巴组织。
为了释放淋巴细胞，向培养皿中加入另一毫升培养基，然后上下移液以将细胞制成悬浮液。现在，将新的尼龙网片放在新的 15 ml 聚丙烯离心管上，然后通过新网片转移细胞。冲洗培养皿并用另一毫升冷介质网孔，然后将体积通过新网片拉入 15 毫升试管中。
再重复一次冲洗。加入冷分选缓冲液至最终体积为 15 毫升后，将试管在 300 倍 G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后小心地抽吸 snat resus。
将细胞沉淀悬浮在 FC 块中，使其最终体积等于沉淀本身的大约两倍。如果发生了大程度的细胞聚集。用移液器吸头小心地去除细胞团块，以染色抗原特异性 T 细胞。
将荧光标记的肽 MHC 四聚体以最佳浓度添加到重悬的细胞沉淀中。然后混合细胞悬液，并在最佳时间和温度下孵育以进行四聚体结合。接下来，加入冷分选缓冲液，使体积达到 15 mL，并离心，将细胞保持在 4 摄氏度。
从现在开始，小心吸出上清液。然后将细胞沉淀重悬于分选仪缓冲液中，至最终体积为 200 μL。现在加入 50 μL mil tenny 抗体偶联的微珠，这些微珠将特异性结合到四聚体混合物的荧光标签上，然后在 4 摄氏度下孵育四聚体结合的细胞和微珠。
20 分钟后，当细胞在离心机中时，用分选缓冲液洗涤细胞。将 milani LS 磁柱放在 quadro max 磁力架上，并放置新的 15 ml 聚丙烯离心管。在色谱柱正下方，在色谱柱顶部添加 3 mL 分选缓冲液，使其排入 15 mL 试管中。
然后在柱子顶部放置一个 100 微米的尼龙网块。当细胞完成旋转后，小心吸出上清液并将沉淀重悬于 3 mL 分选缓冲液中，通过尼龙网将细胞悬液转移到柱顶部。当细胞悬液完全排入色谱柱时，用另外 3 mL 分选缓冲液冲洗原管，然后通过网孔转移到色谱柱上。
将洗涤液汇集在收集管中，丢弃尼龙网。然后，当缓冲液完全排空到试管中时，用每次 3 mL 分选缓冲液再洗涤色谱柱两次。然后从磁力架上取下色谱柱，并将色谱柱放在新的 15 mL 聚丙烯离心管上。
现在向色谱柱中再添加 5 mL 分选缓冲液。立即将柱塞插入柱顶部，并以一个连续的动作将柱塞完全向下推，迫使缓冲液从柱中流出进入管中。在离心含有逃避的结合级分的试管和含有流过的未结合级分的试管后，小心地从结合级分中吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于分选缓冲液中至最终体积正好为 95 微升，吸出并重悬未结合级分至终体积为 2 毫升，然后进一步染色细胞级分， 将 200 μL 计数珠加入 5 mL 传真管中，并将 5 μL 细胞转移到该管中。
将这些试管放在 4 摄氏度下进行分析。稍后，根据表格混合抗体预混液对细胞表面标志物进行染色。对于结合组分，将一定剂量的抗体混合物直接添加到未结合组分的细胞中。
将 90 μL 细胞转移到 5 mL 传真管中，并在转移的样品中加入一定剂量的抗体混合物，以用于要使用的每种荧光染料。将 50 μL 剩余的未结合细胞组分放入 5 mL 传真管中，与 1 μL 偶联到适当荧光染料的抗 CD 4 抗体混合。下次涡旋时，也放置一个未染色的对照，然后将所有样品在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。
然后，在 5 mL 分选缓冲液中洗涤每管后，小心地从结合的馏分样品中吸出上清液，并将细胞重悬于 200 μL 分选缓冲液中。将细胞转移至 1.2 mL 中，传真至微管中，然后用另外 200 μL 分选缓冲液冲洗其先前的试管，将冲洗液汇集到相应的微管中。如果明显结块，则让细胞通过 50 微米过滤器以获得未结合的部分和补偿对照，倒出上清液并将沉淀重悬于 1 毫升分选缓冲液中。
使用一系列连续的包涵体门分析染色的样品，以识别 CD 4 阳性或 CD 8 阳性 T 细胞，如此处所示的结合级分样品。收集尽可能多的细胞，对于未结合的组分样品，最多收集 200 万个事件。总共收集 100 万个事件。
最后，使用相同的机器设置，从计数珠样本中收集 10， 000 个事件。第一个图描述了来自幼稚小鼠的肽 MHC、两种四聚体富集的脾脏和淋巴结样品的代表性流式细胞术图，用于结合和未结合的细胞组分。设置一系列门来选择淋巴散布阳性侧向散射与低 dump 阴性 CD，这些 CD 的 3 个阳性事件，4 个阳性或 CD 8 个阳性事件被设门，用于表位特异性 T 细胞或背景染色的分析。
将来自结合和未结合组分的未染色细胞的等分试样与荧光计数珠混合，并分别分析。这些密度图描述了先前使用相关肽加完全佐剂免疫的小鼠的代表性数据。使用与之前实验相同的序列门控策略来去除任何自发荧光和其他不需要的事件。
从 CD 4 阳性 T 细胞群的分析来看，CD 8 阳性 T 细胞群是 CD 4 阳性 T 细胞肽 MHC 2 四聚体染色的有用内部阴性对照。样品中表位特异性 T 细胞的绝对数量是通过将富集样品的结合部分中的所有细胞总数（从珠子计数分析确定）乘以这些细胞中四聚体阳性的比例（从细胞染色分析确定）来计算的，对于第一系列密度图中显示的代表性幼稚小鼠数据， 总细胞计数为 4， 411，珠子计数为 5， 589。珠浆浓度为每毫升 10 倍至 5 倍的 2 倍。
微珠体积为 0.2 mL，细胞体积为 0.005 mL。因此，这些数据用于生成每毫升 6.31 乘以 10 到 6 的细胞浓度。然后将细胞浓度乘以总样品体积，得出总细胞数。
该数据反过来乘以细胞分析中四聚体阳性事件的百分比，以确定来自这只幼稚小鼠的表位特异性 CD 4 阳性 T 细胞的数量为 98。对于第二系列密度图中具有代表性的免疫小鼠数据，表位特异性 CD 4 阳性 T 细胞的总数为 1.53 乘以 10 到第 4 组。富集效率随着表位特异性 T 细胞数量的增加而降低。
因此，在含有非常高频率的表位特异性 T 细胞的样品的未结合部分可以看到四聚体阳性细胞。在这种情况下，可以单独计算未结合组分中存在的表位特异性 T 细胞的数量，并将其添加到结合组分中发现的数量中。例如，在代表性免疫的小鼠未结合细胞组分中，表位特异性 CD 的 4 个阳性 T 细胞总数为 8.97 乘以 10 到 3。
因此，通过将结合和未结合级分中的数字相加，整个免疫小鼠样品中第四个总表位特异性 CD 的 4 个阳性 T 细胞有 2.43 乘以 10。事实上，如果表位特异性细胞扩增足够稳健，则可以跳过富集过程。富集程序之后，可以执行自固定和渗透步骤，以便对细胞内蛋白质（如细胞因子和转录因子）进行染色。
虽然这种方法最初是为研究来自脾脏和淋巴结的 T 细胞而设计的，但它也可以应用于胸腺和肠道等其他组织。该技术还可用于研究人类血液和组织样本中的表型特异性 T 细胞。
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概览
本协议描述了一种使用肽：MHC四聚体和磁性微珠来分离低频率表位特异性T细胞群的方法。该技术允许直接研究体内系统中的内源性T细胞群。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 流式细胞术
背景
- 识别罕见的表位特异性T细胞对于理解免疫反应至关重要。
- 肽：MHC四聚体可以荧光标记特定的T细胞。
- 磁性微珠增强了这些标记细胞的分离。
- 该方法提供了对自然多克隆T细胞群的洞察。
研究目的
- 分离和分析来自小鼠淋巴细胞的罕见表位特异性T细胞。
- 改善对自然发育的T细胞群的理解。
- 利用流式细胞术来量化富集的T细胞群。
使用的方法
- 从小鼠中收集淋巴细胞。
- 用肽：MHC四聚体试剂对细胞进行染色。
- 使用磁性微珠来标记与四聚体结合的细胞。
- 通过磁化柱富集样品。
主要结果
- 成功分离了与四聚体结合的表位特异性T细胞。
- 流式细胞术分析揭示了罕见T细胞群的存在。
- 该方法相比传统的TCR转基因系统具有优势。
- 获得了对T细胞反应自然发展的洞察。
结论
- 该协议有效地分离了罕见的T细胞群以供研究。
- 它增强了对内源性T细胞反应的理解。
- 该方法是免疫学研究的宝贵工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct detection of rare epitope-specific T cells from endogenous repertoires enables mechanistic de-risking in immunology target validation. This approach supports predictive confidence by quantifying naive precursor frequencies and tracking clonal dynamics throughout immune responses. It addresses a key discovery-stage challenge: distinguishing true antigen-specific signals from background in polyclonal systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring endogenous TCR specificity without transgenic artifacts.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of epitope-specific T cells at physiologically relevant frequencies.
- Strategic Value: Supports target triage by revealing the natural precursor frequency of T cells recognizing pathogen-derived antigens.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible enrichment of tetramer-bound T cells for downstream functional analysis.
- Operational Value: Combines magnetic separation with flow cytometry to achieve high sensitivity and scalability.
- Strategic Value: Creates a reusable platform for screening antigen libraries or vaccine candidates against native T cell repertoires.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks epitope-specific T cell clonal composition from naive state through expansion and contraction phases.
- Operational Value: Enables longitudinal sampling from lymphoid tissues to model immune kinetics in preclinical studies.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking antigen exposure to measurable T cell response metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating antigen-specific T cells based on TCR-pMHC binding affinity.
- Screening: Delivers assay-ready, enriched populations for evaluating ligand reactivity or inhibitory potential.
- Analytics: Enables quantification of rare cell populations via bead-based normalization and flow cytometric detection.
- Translational Research: Connects early immune events to preclinical outcomes by monitoring antigen-specific T cell frequencies over time.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow applicable across antigen targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking TCR specificity to antigen recognition in polyclonal contexts.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized enrichment and defined gating strategies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant immune response data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunogens based on native T cell precursor frequencies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody staining, and magnetic cell separation techniques.
- Depends on access to peptide:MHC tetramer reagents and magnetic microbead conjugation systems.
- Necessitates standardization of staining protocols and instrument settings across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different tissue sources (e.g., spleen, lymph nodes, blood) and species.
- Limited by the availability of MHC-matched tetramers for specific epitopes and alleles.
