纳米颗粒的光镊捕获

本实验的总体目标是构建一个孔径光镊系统，用于捕获尺寸约为20纳米的颗粒。为此，需在现有的激光光镊系统上增加一个探测器，以实现测量功能。随后，将待测的纳米颗粒溶液注入带有双纳米孔陷阱的微流控腔室中，并将该腔室装载到光镊装置上。

当粒子进入被照明的孔径时，由于介电负载效应，光透射会显著增强。如果粒子试图离开孔径，透射光减少会导致动量向外发生变化，根据牛顿第三定律，这会产生一个将粒子拉回孔径内的力，从而使粒子被捕获。粒子会引起透射光谱曲线的红移，该现象可被监测。

因此，该捕获装置可成为一种传感器。最终可以获得显示纳米颗粒捕获事件的结果，包括被捕获蛋白质的解折叠过程，这些可通过双纳米孔中激光强度的变化来反映。与现有的梯度力光镊等方法相比，该技术的主要优势在于能够以更低的激光强度捕获更小的纳米颗粒。

该方法有助于回答生物化学领域的一些关键问题，例如单个蛋白质如何折叠和相互作用，以及病毒颗粒如何感染活细胞？通常，由于难以将双纳米孔整合到现有的激光捕获系统中，研究人员在应用该方法时会遇到困难。光学捕获装置基于 Thor Labs 公司的光镊套件，并配备力测量模块。

在力测量模块中，使用雪崩光电二极管替代四象限探测器。搭建光镊系统时，激光开启期间应佩戴护目镜。确保光束被限制在安全区域内，应在密闭房间内操作，并尽可能将光束限制在捕获装置内部，同时应避免佩戴反光的首饰。

佩戴乳胶手套。为确保光学系统的清洁，设置光镊装置和力测量模块。根据制造商的说明，组装好的光镊装置采用倒置光学显微镜设计，由以下部件组成：捕获激光器、100倍油浸物镜、三维样品定位平台和CCD相机。

请注意，在操作激光二极管时建议采取静电放电防护措施。力测量模块可通过检测聚光镜后焦平面的位置实现光镊的校准。可使用基于硅的雪崩光电 DDE 或 PD 代替力测量模块。

四象限位置探测器还需插入一个由200千欧电阻和100皮法电容组成的电阻-电容（RC）滤波器。该滤波器用于降低高频噪声，便于在示波器上观察捕获事件。使用同轴电缆将RC滤波器连接至APD之后，再通过同轴电缆和T型接头将示波器和数据采集模块连接到RC滤波器。

系统现已准备好进行样品加载。双纳米孔孔径由聚焦离子束在金膜上加工出的两个纳米孔构成。该金膜厚度为100纳米，由玻璃基底支撑。

纳米孔相互重叠形成两个尖锐的尖端。当激光照射到双纳米孔上时，纳米颗粒将被捕获在这些尖端之间的间隙中。

还应在金属膜上加工出较大的定位标记，以帮助在光学显微镜下识别双纳米孔的位置。这些标记应设置在距离双纳米孔约100微米处。将10克聚二甲基硅氧烷（PDMS）基体与1克固化剂倒入一次性杯子中，混合几分钟。

然后将混合物置于真空室中抽气，直至所有气泡完全消失。接着，将1.5克PDMS倒入直径为九厘米的培养皿中。按照旋转程序，在950 RPM转速下旋涂65秒，使PDMS均匀涂布于培养皿底部。

厚度只要不超过80微米即可，无需特别精确。将三到五片1.5号盖玻片轻轻放置在PDMS上，确保彼此不重叠，然后抽真空30分钟。

如果在抽真空过程中盖玻片发生移动并相互叠在一起，请轻轻将其分开。务必保持盖玻片下方的PDMS层薄且均匀。然后再次将培养皿抽真空30分钟。

将培养皿从真空室中取出，并在85摄氏度的加热板上加热20分钟，以固化PDMS。PDMS完全固化后，使用剃刀刀片沿其中一个盖玻片的边缘切割。然后用精细尖头镊子或刀片轻轻撬起盖玻片，一层薄薄的PDMS将粘附在盖玻片上。

将带有 PDMS 的盖玻片放入新的培养皿中。然后使用剃刀刀片在 PDMS 上切割出一个 3 毫米 × 3 毫米的窗口。该窗口将形成用于容纳纳米颗粒溶液的腔室。

使用激光切割机制作一个中心带有直径为 3/4 英寸圆孔的亚克力显微镜载物片支架。用双面胶带粘贴圆孔的边缘。使用剃刀刀片切除多余的胶带。

将制备好的显微镜载玻片放置在预先涂有聚二甲基硅氧烷（PDMS）的盖玻片上，使PDMS夹在玻璃与丙烯酸之间。使用微量移液器，向PDMS窗口加入数滴0.05%（质量/体积）的聚苯乙烯纳米微球溶液。

在纳米孔所在的金膜表面加入一滴液体。将带有纳米孔的金样品放置在盖玻片上，使纳米孔位于PDMS窗口内。确保腔室内无气泡存在。

然后将金样品压在盖玻片上。由于将使用油浸物镜，需擦去多余的溶液。在盖玻片另一侧的PDMS窗口上方滴加一滴油。

注意纳米孔的位置。插入显微镜，将载玻片放入载物台，油面向下，然后降低载物台，直至浸油与显微镜接触。

将载物台大致对准，使金膜上加工出的定位标记位于物镜正下方。使用图像采集软件（如 trapping kit 中包含的 Thor site）找到金膜上的定位标记，并沿着指示线找到纳米孔。

调整载玻片位置，使指示标记及其他透光区域远离屏幕中心。过强的透射光可能会损坏APD，因此请开启激光。由于二向色镜并非完全理想，激光束会在屏幕中心附近形成一个光斑。

使用压电平台控制软件，在所有三个轴向上进一步精细调整对准。当对准正确时，光电探测器电压将达到最大值，表明通过纳米孔径的透射率达到最高。

现在系统已设置完毕且样品已加载，可以开始采集光镊数据。借助指示标记，将光斑定位到已知的纳米孔附近位置。双纳米孔过小，无法在屏幕上清晰分辨，将仅显示为微小的点状结构。

样品的光透射率由示波器上的信号水平指示。进一步调整样品位置以最大化光透射率。注意指示标记以及可见和不可见的划痕，因为这些区域的光透射率会较高；纳米孔会导致光透射率突然跃升，而划痕则不同。

使用波片展示更平缓的变化。调节光的偏振方向，使双纳米孔结构在偏振光作用下实现最高的光透过率。为获取数据，使用数据采集模块对APD的电压进行所需时长的采样。

采集时间通常为数百秒。在此情况下，使用自定义软件进行数据采集，电压采样频率为每秒 2000 次。使用 MATLAB 对采集的数据应用 KY Gole 滤波器进行滤波，并将结果在图中以时间为横轴作图，显示对 20 纳米聚苯乙烯纳米颗粒的捕获过程；同时测量双纳米孔的透射率随时间的变化。

随后绘制了PD光透射率的变化。随着时间推移，捕获事件通常表现为突然发生，透射光功率在两个水平之间出现明显的阶跃式切换，如本示例所示；在捕获状态下，信号噪声常会增加。这种噪声的增加来源于被捕获粒子的布朗运动。

需要注意的是，如果没有捕获的颗粒，这种噪声源便不存在。结果中可能出现一些并非表明捕获事件的人为假象。如图所示，在数分钟内透射率出现缓慢变化的漂移现象，此类结果应予以舍弃。遵循此流程后，还可进行其他方法，如拉曼光谱和荧光光谱分析，以进一步探究被捕获纳米颗粒的性质。

该技术为研究人员在单分子水平上研究具有生物学意义的纳米颗粒开辟了道路。例如，在单分子水平上检测蛋白质结合和研究病毒感染。观看本视频后，您应能够充分理解如何将双光镊集成到倒置显微镜激光系统中，以捕获单个纳米颗粒。