Name: 纳米粒子的光学捕获 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: 学习使用双纳米孔金属薄膜光学捕获技术捕获约20纳米介电纳米粒子的方法。该技术以低激光强度实现高效捕获，为研究蛋白质折叠和病毒感染等生物物理过程提供新工具。

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感谢Thorlabs对本出版物的赞助以及加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现基金的资助。感谢Bryce Cyr和Douglas Rennehan在本视频文章制作过程中提供的协助。

SIBA 捕获技术的原理如图1所示。图2为实验装置的示意图。
1. 光学捕获装置
对于本操作步骤部分，请参考光镊套件使用手册9或光力测量模块使用手册10，以获取有关组装套件的详细说明。请注意，此处使用的是雪崩光电二极管（APD），而非四象限位置探测器。对于光镊套件中未包含的螺丝，请使用顶头螺钉及五金套件中的螺丝（Thorlabs, HW-KIT2）。激光开启时，必须始终佩戴护目镜。确保光束被限制在安全区域内，并避免佩戴戒指等反光饰品。此外，在操作激光二极管时，建议采取防静电措施。
<ol>
	<li>根据各自的使用手册安装光镊套件（Thorlabs, OTKB/M）和力测量模块（Thorlabs, OTKBFM）。使用基于硅的雪崩光电二极管（APD）（Thorlabs, APD110A）替代力测量模块（Thorlabs, OTKBFM）中的四象限位置探测器。</li>
	<li>通过同轴电缆将APD连接至示波器（Tektronics, TDS1012）。</li>
	<li>在扩束镜内部加入一个半波片（Thorlabs, AHWP05M-980）。半波片固定在两个透镜套管（Thorlabs, SM1L03）之间。</li>
</ol>
2. 纳米制造
<ol>
	<li>将镀金测试载玻片（EMF Corp，Cr/Au）切割成四个相同的片状。作为商用载玻片的替代方案，我们还使用了在1英寸方形玻璃载玻片上通过电子束沉积制备的100 nm厚金膜，其附着层为2 nm厚的钛层；沉积时基底温度升高至200 °C，并持续至少1小时。该方法可形成光滑的多晶薄膜。</li>
	<li>创建双纳米孔结构的位图图像，因为聚焦离子束（FIB）系统的输入为位图格式。该图像由两个实心圆组成，直径均为160 nm，圆心间距为190 nm。此模板可形成约15 nm的尖端间距。在两圆之间可选择性地添加一条细线，以去除尖端之间的残留金属。图3a展示了一个典型的位图示例。</li>
	<li>使用聚焦离子束（FIB）铣削系统（Hitachi，FB-2100）制备双纳米孔结构。将步骤2.2中的位图转换为FIB铣削图案（位图中的暗区将被FIB铣削）。采用40 kV的离子加速电压，在60 K倍放大倍数下使用直径为15 μm的束限光阑。每个双纳米孔进行80次扫描，每次扫描剂量时间为5 μsec。图3b显示了一个典型的制备结果结构。根据需要重复操作。应制备多个纳米孔，以便容许误差。</li>
	<li>添加定位标记，可通过FIB系统或手动方式标记双纳米孔的大致位置。</li>
	<li>可选步骤：拍摄纳米孔的扫描电子显微镜（SEM）图像，以准确评估结构质量和尖端间距。</li>
</ol>
3. 微流控室
用于制备微流控腔室的工艺流程图如图4所示。
<ol>
	<li>将 10 g 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂（Dow Corning Canada，Sylgard 184 Silicone Elastomer Base）和额外的 1 g 固化剂（Dow Corning Canada，Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent）倒入一次性杯子中。搅拌数分钟。</li>
	<li>将混合物置于真空腔中抽气，直至所有气泡消失。</li>
	<li>取 1.5 g PDMS 倒入直径为 9 cm 的培养皿中。以 950 rpm 的转速旋涂 65 秒，使 PDMS 均匀覆盖在培养皿底部。图 4b 显示了结果。只要厚度低于 80 μm 即可，无需精确控制；金膜需位于物镜的工作距离范围内。</li>
	<li>将 3–5 片 #1.5 盖玻片（Fisher Scientific，12-541-B）轻轻放置在 PDMS 表面，确保彼此不重叠，并按 图 4c 所示抽真空 30 分钟。</li>
	<li>若在抽真空过程中盖玻片发生移动并堆叠在一起，应小心将其分开。操作时需注意保持盖玻片下方的 PDMS 层薄而均匀。</li>
	<li>若对盖玻片进行了调整，需再次将培养皿抽真空 30 分钟。</li>
	<li>将培养皿从真空腔中取出，并在 85 °C 的加热板上烘烤 20 分钟。</li>
	<li>使用剃刀刀片切下其中一片盖玻片，然后用尖头镊子轻轻撬起。由于 PDMS 对玻璃盖玻片的粘附性高于对 PMMA 培养皿的粘附性，因此会有一层薄 PDMS 留在盖玻片上，如 图 4e 所示。</li>
	<li>用剃刀刀片在 PDMS 上切割出一个 3 × 3 mm 的窗口，如 图 4f 所示。该窗口将作为容纳纳米颗粒溶液的腔室。</li>
</ol>
4. 样品制备
<ol>
	<li>使用亚克力材料，通过激光切割机制作一个中心带有直径为¾英寸圆孔的显微镜载玻片。也可使用其他材料。金样品将放置于该孔中。</li>
	<li>用双面胶带围绕圆孔边缘粘贴，并用剃刀片切除多余的胶带。</li>
	<li>将显微镜载玻片放置在盖玻片上，确保PDMS面朝上。</li>
	<li>使用去离子水将聚苯乙烯纳米微球溶液（Thermo Scientific, 3020A）从1% w/v稀释至0.05% w/v，可使用微量移液器操作。</li>
	<li>在PDMS窗口内滴加数滴溶液，并在金样品上含有纳米孔的区域滴加一滴溶液。</li>
	<li>将金样品置于盖玻片上方，使纳米孔位于PDMS窗口内部。确保腔室内无气泡。将金样品压紧至盖玻片，并吸除多余溶液。</li>
	<li>若使用油浸物镜（本实验采用，但非必需），在盖玻片另一侧、PDMS窗口下方滴加一滴浸油。注意记录纳米孔的位置。</li>
	<li>将载玻片插入载物片夹持器中，油面朝下，然后缓慢下降夹持器，使浸油与显微镜物镜接触。</li>
	<li>粗略调节载物台，使指示标记位于物镜正下方。</li>
	<li>沿指示线逐步定位至纳米孔区域。调整载玻片位置，使指示标记及其他透光区域远离屏幕中心，避免过强的光透过损坏APD探测器。</li>
	<li>打开激光器。由于二向色镜并非完全理想，激光束会在屏幕中心附近形成一个可见光斑。</li>
	<li>使用压电载物台控制软件，在三个轴向上进一步精细调节对准。</li>
</ol>
5. 数据采集
<ol>
	<li>借助指示标记，将光斑定位在已知纳米孔位置附近。纳米孔尺寸过小，无法分辨，应仅显示为光斑。</li>
	<li>样品透射光强度由示波器上的信号水平指示。进一步调整样品位置以最大化透射光强。需注意指示标记以及可见和不可见的划痕，因为这些区域的透射光强度也会较高。纳米孔会表现出透射光强的突然跃变，而划痕则呈现较为平缓的变化。</li>
	<li>利用波片调节光的偏振方向，以获得最大透射光强，因为双纳米孔结构具有偏振特性。</li>
	<li>为降低噪声，使用面包板、200 KΩ电阻和100 pF电容构建RC滤波器，并通过同轴电缆将其连接在APD之后。可根据所需的数据采集带宽调整这些元件参数以获得最佳性能。</li>
	<li>使用同轴电缆和T型接头，将示波器和数据采集模块（Omega, USB-4711A）连接至RC滤波器。</li>
	<li>使用数据采集模块采集APD电压信号，持续所需时间。通常采集时间在数百秒量级。本实验中采用自定义软件包进行数据采集，采样频率为每秒2,000次。</li>
	<li>使用Matlab对采集的数据进行Savitzky-Golay滤波处理，并将滤波后的数据绘制成电压随时间变化的曲线图。</li>
</ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+localized+cell+heating+induced+by+infrared+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for localized cell heating induced by infrared optical tweezers.</a> Biophys. J. 68, 2137-2144 (1995).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li>
<li>Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-induced+back-action+optical+trapping+of+dielectric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Phys%22%5BJournal%5D)">Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles.</a> Nature Phys. 5, 915-919 (2009).</li>
<li>Jin, E. X., Xu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optical+near+field+from+a+bowtie+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Enhanced optical near field from a bowtie aperture.</a> Appl. Phys. Lett. 88, 153110(2006).</li>
<li>Onuta, T. -D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+field+enhancement+at+cusps+between+adjacent+nanoapertures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures.</a> Nano Lett. 7, 557-564 (2007).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+12+nm+dielectric+spheres+using+double-nanoholes+in+a+gold+film%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film.</a> Nano Lett. 11, 3763-3767 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+a+single+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of a single protein.</a> Nano Lett. 12, 402-406 (2012).</li>
<li>Optical trap kit - Manual[Internet]. , ThorLabs. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thorlabs.com/thorcat/19900/OTKB_M-Manual.pdf">http://www.thorlabs.com/thorcat/19900/OTKB_M-Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Optical trap kit - The force module [Internet]. , ThorLabs. Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.thorlabs.com/thorcat/19500/OTKBFM-Manual.pdf">http://www.thorlabs.com/thorcat/19500/OTKBFM-Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Righini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-optical+trapping+of+rayleigh+particles+and+escherichia+coli+bacteria+with+resonant+optical+antennas%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nano-optical trapping of rayleigh particles and escherichia coli bacteria with resonant optical antennas.</a> Nano Lett. 9, 3387-3391 (2009).</li>
<li>Arnold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering+gallery+mode+carousel+-+a+photonic+mechanism+for+enhanced+nanoparticle+detection+in+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Whispering gallery mode carousel - a photonic mechanism for enhanced nanoparticle detection in biosensing.</a> Opt. Express. 17, 6230-6238 (2009).</li>
<li>Lin, S., Schonbrun, E., Crozier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+manipulation+with+planar+silicon+microring+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical manipulation with planar silicon microring resonators.</a> Nano Lett. 10, 2408-2411 (2010).</li>
<li>Yang, A. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+manipulation+of+nanoparticles+and+biomolecules+in+sub-wavelength+slot+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical manipulation of nanoparticles and biomolecules in sub-wavelength slot waveguides.</a> Nature. 457, 71-75 (2009).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optical+trapping+and+arrangement+of+nano-objects+in+a+plasmonic+nanocavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Enhanced optical trapping and arrangement of nano-objects in a plasmonic nanocavity.</a> Nano Lett. 12, 125-132 (2012).</li>
<li>Lyer, S., Popov, S., Friberg, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+apexes+on+the+resonance+shift+in+double+hole+nanocavities%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of apexes on the resonance shift in double hole nanocavities.</a> Opt. Express. 18, 193-203 (2010).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+single+cells+using+infrared+laser+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of single cells using infrared laser beams.</a> Nature. 330, 769-771 (1987).</li>
<li>Liu, Y., Sonek, G. J., Berns, M. W., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+monitoring+of+optically+trapped+cells%3A+Assessing+the+effects+of+confinement+by+1%2C064%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%B0nm+laser+tweezers+using+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Physiological monitoring of optically trapped cells: Assessing the effects of confinement by 1,064â€‰nm laser tweezers using microfluorometry.</a> Biophys. J. 71, 2158-2167 (1996).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+dna+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stretching dna with optical tweezers.</a> Biophys. J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Operation manual-apd110x series-avalanche photodiodes [Internet]. , ThorLabs. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thorlabs.com/thorcat/19500/APD110A-Manual.pdf">http://www.thorlabs.com/thorcat/19500/APD110A-Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Yu, D., Blankert, B., Viré, J. C., Kauffmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+in+drug+discovery+and+drug+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biosensors in drug discovery and drug analysis.</a> Anal. Lett. 38, 1687-1701 (2005).</li>
<li>Luppa, P. B., Sokoll, L. J., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosensors-principles+and+application+to+clinical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Immunosensors-principles and application to clinical chemistry.</a> Clin. Chim. Acta. 314, 1-26 (2001).</li>
<li>Min, Q., Santos, M. J. L., Girotto, E. M., Brolo, A. G., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+raman+enhanced+from+a+double-hole+nanostructure+in+a+metal+film%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Localized raman enhanced from a double-hole nanostructure in a metal film.</a> J. Phys. Chem. C. 112, 15098-15101 (2008).</li>
<li>Weber-Bargioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+nanoscale+imaging+on+dielectric+substrates+with+coaxial+optical+antenna+scan+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral nanoscale imaging on dielectric substrates with coaxial optical antenna scan probes.</a> Nano Lett. 11, 1201-1207 (2011).</li>
</ol>

本文的制作与免费访问由 Thorlabs 赞助。

由于纳米孔的结构，当前的装置具有有效的捕获能力。该纳米孔能够在低光强下捕获约10 nm尺度的介电颗粒。其他新型光学捕获技术包括光偶极子天线11、回音壁模式光学谐振器12,13和波导14；然而，这些技术通常工作在微扰 regime，其所需光功率随颗粒尺寸的四次方反比关系而受限，这与SIBA和双纳米孔捕获器不同。此外，已有研究提出其他孔径形状用于捕获，例如矩形等离激元纳米孔15。双纳米孔捕获器还表现出其他有利特性，包括颗粒尺寸选择性行为7、单一捕获位置（以限制多颗粒捕获）以及易于制备16。作为聚焦离子束（FIB）的替代方法，双纳米孔可通过胶体光刻技术制备6。
对具有较大极化率和尺寸的生物材料的捕获已包括细菌3、活细胞17,2,18、烟草花叶病毒3，以及通过末端连接的高介电颗粒对DNA链进行操控和拉伸19；然而，直接捕获无需锚定的小型生物样本仍然具有挑战性。该捕获构型能够在比传统光镊和环形纳米孔更低的光强下捕获小型介电颗粒，从而使小型生物颗粒在无损伤且无需锚定的情况下被长时间稳定捕获。此外，捕获信号具有高信噪比，使该装置可作为高灵敏度传感器，检测病毒和蛋白质等最小的生物颗粒。事实上，直径为20 nm的聚苯乙烯小球的折射率为1.59，与病毒等最小生物颗粒相近。该方法有望成为固定和操控纳米颗粒（包括生物颗粒）的一种可靠且成熟的技术。
该技术的应用包括集成到微流控环境中。与单一的微流控腔室不同，可使用通道动态调控环境，适用于折射率传感。此类装置可集成于单一微流控芯片中，从而实现更稳定、更坚固的系统，并加快对溶质的分析速度。另一种选择是开发荧光检测方案，用于表征单个荧光标记的病毒、半导体量子点和绿色荧光蛋白。该装置还有潜力被改造为单病毒或单蛋白生物传感器，从而实现对极小样品的分析。单蛋白检测器将有助于药物发现21以及疾病与感染检测22。还可结合拉曼光谱技术，用于检测颗粒的拉曼信号及单个结合事件。双纳米孔结构可在尖端处产生强烈的局域场增强，适用于针尖增强拉曼光谱23。此外，利用拉曼光谱24还可实现一种高特异性的无标记材料表征方法。

<table><tbody><tr><td>浸油</td><td>Cargille Labs</td><td>16484</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning Canada</td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 包含 PDMS 基液和固化剂</td></tr><tr><td>镀金测试载玻片</td><td>EMF Corp</td><td>Cr/Au</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 也可使用钛粘附层</td></tr><tr><td>1.5 号盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>聚焦离子束系统</td><td>Hitachi</td><td>FB-2100</td><td></td></tr><tr><td>便携式数据采集模块</td><td>Omega Engineering</td><td>USB-4711A</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>线性位移台</td><td>Parker</td><td>4034M</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>激光二极管头及控制器</td><td>Sacher Lasertechnik Group</td><td>TEC 120</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 手动可调利特罗激光系统</td></tr><tr><td>数字示波器</td><td>Tektronics</td><td>TDS1012</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>20 nm 纳米球尺寸标准品</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>1 英寸透镜安装座</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>LMR1</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>0.3 英寸透镜管</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/thorProduct.cfm?partNumber=SM1L03" target="_blank"&gt;SM1L03&lt;/a&gt;</td><td>数量：2</td></tr><tr><td>吸收型中性密度 4.0 滤光片</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>NE40A</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>铝制光学平台板</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>MB1824</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>雪崩光电二极管</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>APD110A</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>数字式光功率计</td><td>Thorlabs</td><td>PM100</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 已停产，其他型号亦可</td></tr><tr><td>力测量模块</td><td>Thorlabs</td><td>OTKBFM</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>运动学镜架</td><td>Thorlabs</td><td>KM200-E03</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 配近红外激光质量反射镜</td></tr><tr><td>激光二极管恒流驱动器</td><td>Thorlabs</td><td>LD1255R</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>LD1255 光学平台安装板</td><td>Thorlabs</td><td>LD1255P</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>安装式消色差半波片</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-980</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 690 - 1200 nm</td></tr><tr><td>光镊套件</td><td>Thorlabs</td><td>OTKB/M</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 公制或英制</td></tr><tr><td>支架底座</td><td>Thorlabs</td><td>BA2</td><td>数量：2</td></tr><tr><td>电源</td><td>Thorlabs</td><td>PS-12DC-US</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>电源线缆</td><td>Thorlabs</td><td>LD1255-CAB</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>直角安装板</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>AP90</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>直角支架夹具</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>RA90</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>不锈钢光学支架杆</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>TR3</td><td>数量：1</td></tr><tr><td>平台夹具</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>CL1</td><td>数量：2&lt;br/&gt; 已停产，其他型号亦可</td></tr><tr><td>热传感器</td><td><a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thorlabs</a></td><td>PM210</td><td>数量：1&lt;br/&gt; 用于数字光功率计</td></tr><tr><td>100 pF 电容器</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>200 KOhm 电阻器</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>丙烯酸板</td><td></td><td></td><td>数量：3" x 1"&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>同轴电缆、导线和连接器套装</td><td></td><td></td><td>按需</td></tr><tr><td>面包板</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>凹透镜</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>金刚石切割刀</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td></td><td></td><td>任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>剃刀片</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，非关键</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td>数量：1&lt;br/&gt; 任意品牌，尖头型</td></tr></tbody></table>

纳米颗粒的光镊捕获

Optical Trapping of Nanoparticles

光镊技术是一种利用光对微小物体进行无损固定和操控的方法，已被广泛应用于捕获和操纵微小生物颗粒。Ashkin 及其同事首次通过单束聚焦光实现了光镊1。对于处于小粒子瑞利散射区间的颗粒，单光束捕获可准确地用微扰梯度力模型来描述1。在微扰 regime 下，捕获粒子所需的光功率与粒子尺寸的四次方成反比。过高的光功率可能损伤电介质颗粒并引起热效应。例如，直径为 109 nm 的乳胶微球在 15 mW 光束照射下 25 秒内即被破坏1，这对生物样品具有严重的 implications2,3。
提出了一种自感应反作用（SIBA）光 trapping 技术，用于在非微扰 regime4 下捕获 50 nm 的聚苯乙烯微球。在非微扰 regime 下，即使与背景介质介电常数差异很小的微小粒子，也能显著影响周围电磁场并产生较大的光力。当粒子进入被照明的孔径时，由于介电加载，光透射显著增强。如果粒子试图离开孔径，透射光减少会导致动量向外变化，根据牛顿第三定律，这将对粒子产生向内的力，从而将粒子捕获在孔内。光透射可以被监测，因此该捕获结构可成为一种传感器。通过使用双纳米孔结构，可进一步改进 SIBA 捕获技术。
双纳米孔结构已被证明能够产生强烈的局域场增强5,6。在双纳米孔的两个尖端之间，微小粒子可引起光学透射的显著变化，从而产生较大的光力。因此，可实现对更小纳米颗粒的捕获，例如12 nm的硅酸盐微球7以及流体动力学半径为3.4 nm的牛血清白蛋白分子8。本文概述了用于纳米颗粒捕获的实验装置。首先，我们详细介绍了基于Thorlabs光学镊子套件的捕获系统组装过程。接着，阐述了金属薄膜上双纳米孔的纳米加工工艺、微流体腔室的制备以及样品的准备方法。最后，我们详细说明了数据采集过程，并提供了捕获20 nm聚苯乙烯纳米微球的典型实验结果。

典型的采集轨迹如图5a所示。捕获事件具有明显的突发性，表现为陡峭的边缘，显示出在两个透射功率水平之间的清晰切换。由于粒子受到布朗运动的影响，捕获事件的发生是随机的。对于20 nm的粒子，捕获引起的透射变化通常约为5-10%，捕获时间约为10-300秒。在上述激光功率和粒子浓度条件下，发生一次捕获事件的典型时间约为1分钟。由于空间位阻效应，同时捕获多个粒子的情况较为罕见；但一旦粒子被释放，通常会紧接着发生下一次捕获事件。根据实验结果的质量不同，捕获状态下信号噪声可能会有所增加，这种噪声的增加来源于被捕获粒子的布朗运动。在没有被捕获粒子的情况下，该噪声源并不存在。
某些伪影可能出现在结果中，但并不表示捕获事件。如图5b所示，在数分钟内出现漂移或透射信号缓慢变化的结果应予以舍弃。其他可能存在的伪影包括不一致的透射变化、过度噪声或完全无捕获现象。例如，若未确保样品腔内无气泡，则气泡可能导致不连续的光强跃变。这些气泡在动态行为和光强变化方面对捕获事件的响应不同，因此易于识别。此类现象可能由纳米双孔结构不佳、污染物或机械振动引起。建议将该装置置于安静且低干扰的环境中。此外，在完成光路与样品台调节后，让激光器和样品台静置数分钟也有助于减少干扰。
<img alt="显示入射光、粒子相互作用和透射变化的光学激发示意图。" src="/files/ftp_upload/4424/4424fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 亚波长孔径光学透射：a) 无粒子时；b) 由于介电粒子导致透射增强；c) 若粒子试图离开孔径，光动量的减少（ΔT）将对粒子产生一个力（F），使其被拉回孔中；d) 粒子引起的透射曲线红移，导致透射变化 ΔT。
<img alt="光学激发显微镜装置；透镜、激光器、压电载物台；纳米颗粒分析。" src="/files/ftp_upload/4424/4424fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. a) 捕获装置的整体示意图，红色圆圈区域的放大图见 b)；b) 放大图显示双纳米孔结构以及位于 PDMS 腔室内的纳米球；c) 双纳米孔结构的扫描电子显微镜（SEM）图像。所用缩写：LD = 激光二极管；ODF = 光密度滤光片；HWP = 半波片；BE = 扩束镜；MR = 反射镜；MO = 显微镜物镜；OI MO = 浸油显微镜物镜；DH = 双纳米孔；APD = 雪崩光电探测器。
<img alt="纳米粒子排列，电子显微镜图像；比例尺 200 nm；光激发分析。" src="/files/ftp_upload/4424/4424fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. a) FIB 制备中使用的示例位图；b) 双纳米孔的扫描电镜图像。
<img alt="PDMS 铸造过程示意图：培养皿基底涂覆、显微镜盖玻片、PDMS 固化步骤。" src="/files/ftp_upload/4424/4424fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 微流控腔室的制备流程图。
<img alt="光镊捕获结果；图表；随时间变化的光透射率，良好捕获与不良漂移的对比。" src="/files/ftp_upload/4424/4424fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图 5. (a) 使用 20 nm 聚苯乙烯微球捕获事件的典型结果。(b) 显示明显漂移的不良捕获结果。

以下实验方案详细介绍了利用金属薄膜中的双纳米孔实现介电纳米颗粒的低功率光镊捕获。

光镊是一种利用光对微小物体进行温和固定和操控的技术，已广泛应用于微粒捕获……

本实验的总体目标是构建一个孔径光镊系统，用于捕获尺寸约为20纳米的颗粒。为此，需在现有的激光光镊系统上增加一个探测器，以实现测量功能。随后，将待测的纳米颗粒溶液注入带有双纳米孔陷阱的微流控腔室中，并将该腔室装载到光镊装置上。当粒子进入被照明的孔径时，由于介电负载效应，光透射会显著增强。如果粒子试图离开孔径，透射光减少会导致动量向外发生变化，根据牛顿第三定律，这会产生一个将粒子拉回孔径内的力，从而使粒子被捕获。粒子会引起透射光谱曲线的红移，该现象可被监测。因此，该捕获装置可成为一种传感器。最终可以获得显示纳米颗粒捕获事件的结果，包括被捕获蛋白质的解折叠过程，这些可通过双纳米孔中激光强度的变化来反映。与现有的梯度力光镊等方法相比，该技术的主要优势在于能够以更低的激光强度捕获更小的纳米颗粒。该方法有助于回答生物化学领域的一些关键问题，例如单个蛋白质如何折叠和相互作用，以及病毒颗粒如何感染活细胞？通常，由于难以将双纳米孔整合到现有的激光捕获系统中，研究人员在应用该方法时会遇到困难。光学捕获装置基于 Thor Labs 公司的光镊套件，并配备力测量模块。在力测量模块中，使用雪崩光电二极管替代四象限探测器。搭建光镊系统时，激光开启期间应佩戴护目镜。确保光束被限制在安全区域内，应在密闭房间内操作，并尽可能将光束限制在捕获装置内部，同时应避免佩戴反光的首饰。佩戴乳胶手套。为确保光学系统的清洁，设置光镊装置和力测量模块。根据制造商的说明，组装好的光镊装置采用倒置光学显微镜设计，由以下部件组成：捕获激光器、100倍油浸物镜、三维样品定位平台和CCD相机。请注意，在操作激光二极管时建议采取静电放电防护措施。力测量模块可通过检测聚光镜后焦平面的位置实现光镊的校准。可使用基于硅的雪崩光电 DDE 或 PD 代替力测量模块。四象限位置探测器还需插入一个由200千欧电阻和100皮法电容组成的电阻-电容（RC）滤波器。该滤波器用于降低高频噪声，便于在示波器上观察捕获事件。使用同轴电缆将RC滤波器连接至APD之后，再通过同轴电缆和T型接头将示波器和数据采集模块连接到RC滤波器。系统现已准备好进行样品加载。双纳米孔孔径由聚焦离子束在金膜上加工出的两个纳米孔构成。该金膜厚度为100纳米，由玻璃基底支撑。纳米孔相互重叠形成两个尖锐的尖端。当激光照射到双纳米孔上时，纳米颗粒将被捕获在这些尖端之间的间隙中。还应在金属膜上加工出较大的定位标记，以帮助在光学显微镜下识别双纳米孔的位置。这些标记应设置在距离双纳米孔约100微米处。将10克聚二甲基硅氧烷（PDMS）基体与1克固化剂倒入一次性杯子中，混合几分钟。然后将混合物置于真空室中抽气，直至所有气泡完全消失。接着，将1.5克PDMS倒入直径为九厘米的培养皿中。按照旋转程序，在950 RPM转速下旋涂65秒，使PDMS均匀涂布于培养皿底部。厚度只要不超过80微米即可，无需特别精确。将三到五片1.5号盖玻片轻轻放置在PDMS上，确保彼此不重叠，然后抽真空30分钟。如果在抽真空过程中盖玻片发生移动并相互叠在一起，请轻轻将其分开。务必保持盖玻片下方的PDMS层薄且均匀。然后再次将培养皿抽真空30分钟。将培养皿从真空室中取出，并在85摄氏度的加热板上加热20分钟，以固化PDMS。PDMS完全固化后，使用剃刀刀片沿其中一个盖玻片的边缘切割。然后用精细尖头镊子或刀片轻轻撬起盖玻片，一层薄薄的PDMS将粘附在盖玻片上。将带有 PDMS 的盖玻片放入新的培养皿中。然后使用剃刀刀片在 PDMS 上切割出一个 3 毫米 × 3 毫米的窗口。该窗口将形成用于容纳纳米颗粒溶液的腔室。使用激光切割机制作一个中心带有直径为 3/4 英寸圆孔的亚克力显微镜载物片支架。用双面胶带粘贴圆孔的边缘。使用剃刀刀片切除多余的胶带。将制备好的显微镜载玻片放置在预先涂有聚二甲基硅氧烷（PDMS）的盖玻片上，使PDMS夹在玻璃与丙烯酸之间。使用微量移液器，向PDMS窗口加入数滴0.05%（质量/体积）的聚苯乙烯纳米微球溶液。在纳米孔所在的金膜表面加入一滴液体。将带有纳米孔的金样品放置在盖玻片上，使纳米孔位于PDMS窗口内。确保腔室内无气泡存在。然后将金样品压在盖玻片上。由于将使用油浸物镜，需擦去多余的溶液。在盖玻片另一侧的PDMS窗口上方滴加一滴油。注意纳米孔的位置。插入显微镜，将载玻片放入载物台，油面向下，然后降低载物台，直至浸油与显微镜接触。将载物台大致对准，使金膜上加工出的定位标记位于物镜正下方。使用图像采集软件（如 trapping kit 中包含的 Thor site）找到金膜上的定位标记，并沿着指示线找到纳米孔。调整载玻片位置，使指示标记及其他透光区域远离屏幕中心。过强的透射光可能会损坏APD，因此请开启激光。由于二向色镜并非完全理想，激光束会在屏幕中心附近形成一个光斑。使用压电平台控制软件，在所有三个轴向上进一步精细调整对准。当对准正确时，光电探测器电压将达到最大值，表明通过纳米孔径的透射率达到最高。现在系统已设置完毕且样品已加载，可以开始采集光镊数据。借助指示标记，将光斑定位到已知的纳米孔附近位置。双纳米孔过小，无法在屏幕上清晰分辨，将仅显示为微小的点状结构。样品的光透射率由示波器上的信号水平指示。进一步调整样品位置以最大化光透射率。注意指示标记以及可见和不可见的划痕，因为这些区域的光透射率会较高；纳米孔会导致光透射率突然跃升，而划痕则不同。使用波片展示更平缓的变化。调节光的偏振方向，使双纳米孔结构在偏振光作用下实现最高的光透过率。为获取数据，使用数据采集模块对APD的电压进行所需时长的采样。采集时间通常为数百秒。在此情况下，使用自定义软件进行数据采集，电压采样频率为每秒 2000 次。使用 MATLAB 对采集的数据应用 KY Gole 滤波器进行滤波，并将结果在图中以时间为横轴作图，显示对 20 纳米聚苯乙烯纳米颗粒的捕获过程；同时测量双纳米孔的透射率随时间的变化。随后绘制了PD光透射率的变化。随着时间推移，捕获事件通常表现为突然发生，透射光功率在两个水平之间出现明显的阶跃式切换，如本示例所示；在捕获状态下，信号噪声常会增加。这种噪声的增加来源于被捕获粒子的布朗运动。需要注意的是，如果没有捕获的颗粒，这种噪声源便不存在。结果中可能出现一些并非表明捕获事件的人为假象。如图所示，在数分钟内透射率出现缓慢变化的漂移现象，此类结果应予以舍弃。遵循此流程后，还可进行其他方法，如拉曼光谱和荧光光谱分析，以进一步探究被捕获纳米颗粒的性质。该技术为研究人员在单分子水平上研究具有生物学意义的纳米颗粒开辟了道路。例如，在单分子水平上检测蛋白质结合和研究病毒感染。观看本视频后，您应能够充分理解如何将双光镊集成到倒置显微镜激光系统中，以捕获单个纳米颗粒。

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