新鲜组织分离正常和癌症相关的成纤维细胞的荧光激活细胞分选（FACS）

癌相关成纤维细胞（CAFS）信号，促进细胞增殖，血管生成和炎症促进肿瘤的发生，生长和发展。在这里，我们描述了一种方法，分离出纯净的新鲜小鼠和人体组织的正常成纤维细胞和纤维母细胞分选，表面标志使用PDGFRα的人口。

该程序的目的是从新鲜组织中分离正常和癌症相关的成纤维细胞。这是通过首先解剖乳腺来完成的。第二步是制备乳腺、单细胞悬液、下一个细胞维持成纤维细胞特异性抗体，以及针对其他细胞群的特异性抗体。

最后一步是进行荧光激活细胞来源或事实。最终，使用分选细胞群中表达的特异性标记物的 Q-R-T-P-C-R 表达谱来评估分选细胞群的纯度。与现有的成纤维细胞分离方法相比，该技术的主要优点是它允许分离大多数组织成纤维细胞，同时受免疫细胞或上皮细胞的污染最小，同时避免了可能改变成纤维细胞基因表达谱的组织培养步骤。

该技术的含义延伸到所有乳腺癌治疗，因为理解和识别分子靶标可能提供一种新的 Combinator 方法来对抗乳腺癌进展，延长患者生存期，并最终帮助改进和定制个体化治疗方案。除了您的眼睛之外，只有 Lena 博士，实验室经理将演示该程序以开始此程序。将安乐死的雌性老鼠仰卧在聚苯乙烯泡沫塑料表面上，并使用 25 号针头牢固地固定所有四个肢体。

使用镊子向小鼠大量喷洒 70% 乙醇。拉起中线处的腹部皮肤，从切口开始用锋利的剪刀做一个小切口。将皮肤切开到动物的脖子，同时避免刺穿腹腔。

从中线切口向腿部切开后腿的皮肤，形成 Y 形。接下来，将皮肤从小鼠身体上拉开，固定住，露出附着在皮肤下侧的乳腺。这个过程中最有问题的事情之一是避免服用肌肉组织。

为了避免这个问题，我只会取第四和第五个乳腺，而不取第二个，因为它离肌肉组织很近。使用棉签轻轻地将记忆腺与皮肤分离，同时用小锋利的剪刀剪开结膜组织，将记忆腺向鼠标脊柱分离，去除发现的任何坏死区域。将解剖的记忆腺置于冰上的 PBS 中。

无需脱毛即可获得皮肤组织的最简单方法是使用老鼠耳朵。使用锋利的剪刀剪掉被安乐死的小鼠的双耳。立即将耳朵放入含有少量 PBS 的冰消化罐中。

为了制备乳腺单细胞悬液，使用弯曲的剪刀将含有少量 PBS 的消化罐中的乳腺彻底切碎，在冰上加入 20 毫升胶原酶溶液到碎组织中。这一量的胶原酶溶液将有效地从多达 15 只小鼠身上解离大约 5 克的记忆或肿瘤组织和耳朵。立即放在 37 摄氏度水浴中的搅拌板上，孵育 15 分钟，同时以中等速率搅拌，以在 30 毫升冷 DMEM 加 10% FCS 中终止反应。

接下来，通过放置在 50 毫升锥形管顶部的 70 微米细胞过滤器过滤组织和培养基混合物。在 4 摄氏度下以 450 倍 G 离心锥形管 5 分钟。如果小鼠在处死前没有用 PBS 进行心脏灌注，则样品中的红细胞在免疫染色前必须是谎言。

在标记成纤维细胞和其他细胞群之前，必须封闭细胞以进行内源性 FC。复苏：将细胞悬浮在 1 至 3 毫升传真缓冲液 1 中，然后加入 1 至 50 稀释的 FC 块，在冰上孵育 10 至 20 分钟。无需洗掉 FC 模块，将 100 μL 细胞等分试样转移至孤儿管，用作未染色对照和单色对照。

根据本演示中使用的荧光抗体的数量，将使用两种荧光抗体来标记抗 PDGF 受体 α 处的成纤维细胞。将其直接与稀释度为 1 到 50 的 Fluor 偶联到分选样品中，并与单色对照物偶联以标记其他细胞群。将适当的荧光偶联抗体也以 1 比 50 的稀释度添加到表面标记物中。

建议将抗体也添加到适当的单色对照管中，包括免疫细胞和上皮细胞的抗体，以排除任何双阳性群体，从而提高分离的成纤维细胞的纯度。接下来，将细胞与抗体在黑暗中的冰上孵育 1 小时，用传真缓冲液 1 填充试管，并在 4 摄氏度下以 450 倍 G 旋转 5 分钟，超声抽吸液将传真缓冲液 1 中的细胞弯曲至最适合使用要使用的传真分拣机进行分选的浓度。将标记的细胞转移到带有过滤器顶部的传真管中，并将过滤细胞转移到管中，以防止细胞结块、结块以排除死细胞。

除未染色对照外的所有样品的 DPI。传真分析期间将样品放在冰上。要开始此过程，请使用 fact sorter 软件准备荧光设置、采集设置和流体动力学液滴设置。

上样到细胞分选仪之前，对每个样品进行短暂涡旋以重悬细胞。首先分析未染色的样品，以便为总细胞群设置门控，以门控细胞碎片并确定自发荧光或背景染色。接下来，分析未染色的样品和 DPI，以确定和门控总细胞群中的活细胞群。

分析每个单一的颜色控件，以确定和校准补偿等参数。分析染色样品以定义用于分选的门的位置。设置好所需细胞群的参数和门后，开始将标记的细胞群分选到含有培养基或 RNA 裂解缓冲液的 eph 管或 15 ml 锥形管中。

分选完成后，立即将细胞离心并转移到新鲜培养基或 RNA 裂解缓冲液中。根据您的实验目的，如果分选，要培养成纤维细胞，始终接种在胶原包被的平板上，切勿直接接种在塑料上，因为这会导致成纤维细胞激活，从而导致其基因表达发生变化。使用 PDGF 受体 α 作为成纤维细胞的标志物，可产生分离的、高度富集的组织成纤维细胞群。

在这个例子中，小鼠乳腺的单细胞悬液用 PDGF 受体 α 和 F 四种 80 抗体染色。事实排序图显示在左面板中，其中 P 2 是成纤维细胞门，P 4 是巨噬细胞门。进行后源分析以确定分选成纤维细胞（右图所示）和巨噬细胞（中图所示）的纯度。

下图显示了通过 Q-R-T-P-C-R 对成纤维细胞、免疫细胞和上皮细胞的细胞特异性对照基因的来源纯度的分析。结果归一化为两个看家基因 ga、DH 和 mgus，以及与 gap 的相对表达。DH 显示此类分析通常显示 0.1% 至 0.6% 的污染。

这种纯度水平允许对分离的成纤维细胞进行高质量的转录组分析。未分类的乳腺成纤维细胞群中 PDGF 受体 α 表达的定量表明，乳腺中约 85% 的总组织成纤维细胞为 PDGF 受体 α 阳性。我孤立了。

成纤维细胞可以在分选后直接培养，但可能需要几天才能恢复。必须使用低位按摩细胞进行所有进一步的实验，因为原代成纤维细胞在繁殖过程中会经历衰老。在培养中，一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。

如果指定第三个细胞进行培养，则导入该细胞以记住在无菌条件下执行所有程序。在这次拍摄中，我们没有进行无菌排序。看完这个视频后，您应该对如何从新鲜组织中分离高度富集的成纤维细胞群有很好的了解。