Name: 定量荧光共振能量转移（福斯特共振能量转移）SENP1蛋白酶的动力学测定分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: 了解使用定量FRET技术测定SENP1蛋白酶动力学参数的创新方法。该方法通过实时监测荧光信号变化，可精确测定酶促反应的KM和kcat值，为蛋白酶研究提供高效分析工具。

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我们非常感谢 Victor G.J. Rodgers 提供的宝贵建议。感谢廖组所有成员的密切合作以及对本研究的帮助。本研究由美国国立卫生研究院资助（J.L. 获资助号 AI076504）。

1. 质粒构建
<ol>
 <li>通过 PCR 扩增基因的开放阅读框，并将 PCR 产物克隆至 PCRII-TOPO 载体中。</li>
 <li>通过测序确认产物，并将编码 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet、CyPet-SUMO1、YPet 以及 SENP1 催化结构域的 cDNA 克隆至 pET28 (b) 载体中，形成带有N端六聚组氨酸标签的重组质粒。</li>
</ol>
2. 蛋白质表达与纯化
<ol>
 <li>转化 大肠杆菌 菌株的细胞 BL21 (DE3）与编码 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet、CyPet-SUMO1、YPet 以及 SENP1 催化结构域的 pET28(b) 载体。</li>
 <li>在2xYT培养基中于37°C培养转化后的细菌3小时 37 °C （以250 rpm振荡）至600 nm处的光密度达到0.5。</li>
 <li>添加 100 μM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度）以诱导蛋白表达，并于37 °C下振荡培养16小时 25 °C 200 rpm 条件下。</li>
 <li>通过在 10,000 rpm 条件下离心收集细菌 4 °C 5分钟，然后将它们重悬于含有20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、50 mM NaCl和5 mM 咪唑的缓冲液中。</li>
 <li>使用 MiSonics 4,000 超声破碎仪，以 25 W 功率、5 秒脉冲间隔对细胞进行超声处理，总时长 10 分钟，随后在 35,000 x g 条件下离心收集细胞 4 °C 30分钟</li>
 <li>为1 L培养液准备装有500 ml Ni-NTA凝胶的层析柱，并将上清液转移至柱中。</li>
 <li>用含20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、500 mM NaCl和10 mM咪唑的缓冲液洗涤树脂两次。</li>
 <li>用含有 20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、500 mM NaCl 和 500 mM 咪唑的缓冲液洗脱蛋白，随后透析至含有 20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、50 mM NaCl 和 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）的缓冲液中 4 °C 过夜。</li>
 <li>通过 Bradford 法测定纯化蛋白的浓度。蛋白浓度测定的替代方法为 SDS-PAGE 凝胶电泳，随后用考马斯亮蓝染色并进行成像定量。</li>
</ol>
3. 定量FRET光谱分析
<ol>
 <li>该检测的总体策略基于FRET信号（图1）。FRET荧光对CyPet和YPet分别标记在pre-SUMO1的N端和C端。SENP1在SUMO1的C端Gly-Gly位点切割融合蛋白CyPet-(pre-SUMO1)-YPet，从而释放带有YPet的SUMO尾部。FRET信号被破坏，导致在CyPet激发波长下CyPet的发射增强，而YPet的发射显著降低。</li>
 <li>当以414 nm波长的光激发时，CyPet-(pre-SUMO1)-YPet在530 nm处的总荧光发射可来源于三个部分：FRET诱导的YPet发射、CyPet的直接发射以及YPet的直接发射（图2）。</li>
</ol>
<img alt="在科学分析中，FRET光谱学方程 FL530/414 = FLFRET + FLCyPet(cont) + FLYPet(cont)。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"> 
其中 FL530/414 表示在414 nm激发下530 nm处的总荧光发射，FLFRET 表示绝对FRET信号，FLCyPet(cont) 表示在414 nm激发下CyPet的直接发射，FLYPet (cont) 表示在414 nm激发下YPet的直接发射。(cont)下标表示贡献。
<ol start="3">
 <li>在414 nm激发下，CyPet在530 nm处的直接发射与其在475 nm处的发射成正比，比例常数为α。将CyPet-SUMO1配制成50、100、200、500、750 nM及1 mM的浓度，在414 nm激发后测定其在475 nm和530 nm处的发射值，以确定α（图3-1）。</li>
 <li>在414 nm激发下，YPet在530 nm处的直接发射与其在475 nm激发下在530 nm处的发射成正比，比例常数为β。将YPet配制成50、100、200、500、750和1,000 nM的浓度，在414 nm和475 nm激发下测定样品在530 nm处的发射，以确定β（图3-2）。</li>
 <li>当CyPet-(pre-SUMO1)-YPet被SENP1酶解时，切割反应释放出CyPet-SUMO1以及带有YPet的SUMO1尾部片段。当该化合物在414 nm激发时，530 nm处的荧光发射（FL'530/414）会降低，但仍可划分为三个部分：</li>
</ol>
<img alt="荧光分析公式；包含FRET、CyPet、YPet参数的示意图；光学研究。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"> 
其中，FL'530/414 表示在 414 nm 激发下，消化后于 530 nm 处的总荧光发射强度，FL'FRET 表示剩余的绝对 FRET 信号，FL'CyPet(475/414) 表示在 414 nm 激发下，消化后于 475 nm 处的 CyPet 发射强度（此处 CyPet 发射来自两部分：未消化的 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 和已消化的 CyPet-SUMO1），而 FLYPet (530/475) 表示在 475 nm 激发下 YPet 的发射强度，该值在 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 是否被消化的情况下均保持不变。
<ol start="6">
 <li>SENP1 消化后，剩余的 FRET 发射（FL'FRET）为：</li>
</ol>
<img alt="荧光能量转移方程，FRET分析公式，荧光研究。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 3"> 
其中 C 为 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 的总浓度，x 为已消化的 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 的浓度。
<ol start="7">
 <li>通过组合所有组分，在414 nm激发下检测到的530 nm荧光发射（FL'530/414）为：</li>
</ol>
<img alt="荧光计算方程，光谱数据分析，科研公式。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 4">
4. 基于FRET的蛋白酶活性检测用于酶动力学研究
<ol>
 <li>将CyPet-(pre-SUMO1)-YPet与SENP1的催化结构域在37 °C下孵育，缓冲液为20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、50 mM NaCl、0.1%（v/v）Tween-20和1 mM DTT，总体积为80 ml，随后转移至384孔板中。</li>
 <li>在荧光多孔板读板仪中，于414 nm激发光下，每隔15秒检测475 nm和530 nm处的荧光发射，持续测定5分钟。</li>
 <li>反应速率（v）与底物（S）量的变化关系如下：</li>
</ol>
<img alt="反应速率公式；酶动力学方程；v = -d[S]/dt = d[P]/dt；化学过程。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 5">
<ol start="4">
 <li>产物的浓度从0开始呈指数增长，随着[S]0 （原始底物浓度）时 t=0:</li>
</ol>
<img alt="化学动力学公式，[P]=[S]₀(1-e⁻ᵏᵗ)，反应速率表达式，方程。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 6">
<ol start="5">
 <li>当 t=0 时，初始速度（V0）为：</li>
</ol>
<img alt="酶动力学方程 V0=d[P]/dt=k[S]0，表示生物化学分析中的反应速率。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 7">
<ol start="6">
 <li>固定 SENP1 的浓度，逐步增加 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 的浓度，使其最高达到酶浓度的 100 倍，以满足米氏方程的要求。</li>
 <li>所有荧光读数均采用定量 FRET 分析方法进行分析，并在 GraphPad Prism V 软件中作图以拟合米氏方程。也可借助更常见的软件（如电子表格程序 Microsoft Excel）进行非线性回归分析。</li>
</ol>
5. 典型结果
通过监测反应过程中475 nm和530 nm处荧光信号的变化，可以确定SENP1对pre-SUMO1的成熟加工能力。图4显示，SENP1对pre-SUMO1的消化速率随底物浓度增加而升高，呈底物剂量依赖性。这表明SENP1的催化结构域对pre-SUMO1的成熟具有优异的催化活性。通过上述分析，计算了不同底物浓度下的初始反应速率（表1）。
kcat/KM 比值通常用于比较不同酶对同一底物，或同一酶对不同底物的催化效率。KM 和 Vmax 可通过米氏方程，利用不同浓度的 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 所对应的多个初始反应速率求得（图5）。kcat 的计算方法如下：
<img alt="催化效率方程 \(k_{cat}=\frac{V_{max}}{[E]}\)；酶动力学公式。" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 8"> 
根据上述分析，计算得到的 KM 为 0.21 ± 0.04 μM，kcat 为 6.90 ± 0.28 s-1，kcat/KM 比值为 (3.2 ± 0.55) × 107 M-1s-1。
<img alt="使用FRET的蛋白质相互作用示意图；显示CyPet-YPet、SENP切割、在530 nm和475 nm处的发射。" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 基于FRET的蛋白酶检测法用于SENP介导的前体SUMO成熟过程的图示。
<img alt="荧光发射光谱图；展示了在特定波长下的FRET效率。" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 荧光信号的定量分析，分别来自供体、受体及FRET的贡献。在414 nm激发下，对CyPet-(pre-SUMO1)-YPet的发射光谱进行分解。FLCyPet(530/414) 表示在414 nm激发下CyPet在530 nm处的发射，FLFRET表示在414 nm激发下由FRET引起的YPet在530 nm处的发射，而FLYPet(530/414)表示在414 nm激发下YPet在530 nm处的发射。
<img alt="荧光发射光谱；示意图显示 FL_CyPet 和 FL_YPet 比值；光学分析。" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 方向发射因子 α 和 β 的计算。
<img alt="定量FRET分析图；消化底物随时间变化（底物浓度[S1-S8]）" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 不同比例SENP1催化域消化CyPet-(pre-SUMO1)-YPet的定量分析。反应在前5分钟内进行监测。
<img alt="米氏动力学曲线图，酶反应速率与底物浓度关系，实验数据。" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. SENP1 消化 CyPet-(pre-SUMO1)-YPet 的米氏动力学图解分析。数据采用 GraphPad Prism V 软件绘图并进行非线性回归分析。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>[S](μM)</td>
 <td>V0(μM/s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.115</td>
 <td>0.0023±0.00005</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.214</td>
 <td>0.0028±0.00004</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.407</td>
 <td>0.0033±0.00007</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.594</td>
 <td>0.0037±0.00013</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.725</td>
 <td>0.0043±0.00012</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.471</td>
 <td>0.0051±0.00036</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.899</td>
 <td>0.0050±0.00031</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.300</td>
 <td>0.0050±0.00062</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. SENP1 对 pre-SUMO1 成熟化初始反应速率的测定。在每种底物浓度下，使用四个样品测量酶解反应，标准偏差来源于这四个样品的变异。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>KM(μM)</td>
 <td>kcat(s-1)</td>
 <td>kcat/kM(M-1•s-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.21±0.04</td>
 <td>6.90±0.28</td>
 <td>3.2±0.55×107</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 通过定量FRET分析测定SENP1对前体SUMO1成熟过程的动力学参数。标准差来源于每个底物浓度下的四个样本。

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li>
<li>Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%2C+ubiquitin%27s+mysterious+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-RING+for+SUMO%3A+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li>
<li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeSUMOylating+enzymes-SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li>
<li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+in+reverse%3A+the+SUMO+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li>
<li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

FRET 技术已被用于研究 SENP1 对 pre-SUMO1 成熟过程的作用9。实验中采用 CFP-YFP 作为 FRET 荧光对，并通过比率分析法（即受体与供体发射光强度的比值）来表征其动力学特性。然而，传统的比率 FRET 分析未考虑供体和受体的自体荧光问题，因此该比值并不能直接反映底物消化量。
本文报道了一种新开发的高灵敏度基于FRET的蛋白酶检测方法，用于研究SENP1对前体SUMO1成熟过程的动力学。与以往的比率法相比，我们从理论上对FRET信号在动力学分析中的应用进行了根本性改进，并建立了实验流程，通过定量分析供体和受体的自荧光以及真实的FRET诱导的受体发射，来准确获取动力学参数。传统的比率分析法无法实现这一点。忽略供体和受体的自荧光发射会导致对FRET信号及供体发射的高估。这种高估对最终的kcat/KM比值影响可能不大（比率法分析结果为3.81 × 107 M−1s−1，而本定量FRET分析为3.2 × 10<sup...

<table><tbody><tr><td>PCR II TOPO 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K466040</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>Research Products International Corp.</td><td>X15600</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus（Bradford）测定试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>384 孔板（玻璃底）</td><td>Greiner</td><td>781892</td><td></td></tr><tr><td>FlexStation II 384 孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定量fret（förster共振能量转移）分析用于senp1蛋白酶动力学测定

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

蛋白质与泛素或泛素样蛋白（Ubls）之间可逆的翻译后修饰被广泛用于动态调控蛋白质活性，并在多种生物学过程中发挥重要作用。例如，SUMO可通过共价修饰大量蛋白质，在细胞周期调控、细胞存活与死亡、DNA损伤应答以及应激反应等多种细胞过程发挥关键作用1-5。SENP作为SUMO特异性蛋白酶，既可作为内肽酶参与SUMO前体的成熟过程，也可作为异肽酶从靶蛋白上切除SUMO，从而维持SUMO化循环的更新 1,3,6,7.
酶的催化效率或特异性最好通过动力学常数的比值 kcat/KM 来表征。在多项研究中，SUMO-SENP 配对的动力学参数已通过多种方法测定，包括基于聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质印迹法、放射性标记底物、荧光化合物或荧光蛋白标记底物8-13。然而，基于聚丙烯酰胺凝胶的技术虽然使用了“天然”蛋白质，但操作繁琐且技术要求高，难以进行详细的定量分析。使用四肽或带有 ACC（7-氨基-4-羰甲基香豆素）或 AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）荧光基团的蛋白质作为底物所得的 kcat/KM 值，要么比天然底物低达两个数量级，要么无法明确区分 SENP 的异肽酶和内肽酶活性。
最近，基于FRET的蛋白酶检测方法被用于研究去泛素化酶（DUBs）或SENP蛋白酶，所用的FRET荧光对为青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）9,10,14,15。受体发射光与供体发射光的比值被用作定量参数，以监测FRET信号并确定蛋白酶活性。然而，该方法忽略了受体和供体自身荧光在受体和供体发射波长处的信号串扰，因此不够准确。
我们开发了一种基于FRET的新型高灵敏度、定量蛋白酶检测方法，用于测定SENP1对pre-SUMO1成熟过程的动力学参数。通过使用经基因工程改造的FRET荧光对CyPet和YPet，其FRET效率和荧光量子产率显著提高，构建了CyPet-(pre-SUMO1)-YPet底物16。我们分别在受体和发射波长处对供体和受体贡献的绝对荧光信号以及FRET信号进行了区分和定量。测得SENP1对pre-SUMO1的kcat/KM值为(3.2 ± 0.55) × 107 M-1s-1，该数值符合典型的酶促反应动力学参数。因此，该方法是可靠的，也可作为通用策略用于表征其他蛋白酶。

本文描述了一种涉及FRET（福斯特共振能量转移）信号定量分析的新方法，用于研究酶动力学。通过该方法获得了SENP1（SUMO/Sentrin特异性蛋白酶1）催化结构域对pre-SUMO1（小泛素样修饰蛋白1）水解反应的KM和kcat值。这种基于定量FRET的蛋白酶动力学研究的一般原理可应用于其他蛋白酶的研究。

定量FRET（Förster共振能量转移）分析用于SENP1蛋白酶动力学测定

蛋白质与泛素或泛素样蛋白（Ubls）发生的可逆翻译后修饰被广泛用于动态调控蛋白质……

本视频展示了一种用于定量分析蛋白酶动力学的新型单步荧光共振能量转移（FRET）检测方法。该检测方法的总体策略基于FRET信号分析。在此方法中，FRET荧光对CYPE和YPE连接于完整底物中pre-SUMO1的N端和C端，使CYPE和YPE彼此靠近。当该分子在 414 纳米处被激发时，大部分发射信号位于 530 纳米。然而，当加入 SENP1 蛋白酶后，底物在 SUMO1 的 C 末端 Gly-Gly 位点被切割，从而将 CIPA 与 wpa 分开。此时在 414 纳米激发下，观测到的大部分发射信号位于 475 纳米。为了评估该反应的动力学，每隔15秒测定一次荧光发射，持续五分钟。对所得荧光数据的分析揭示了cype pre sumo one ype底物被SENP one蛋白酶消化的速率。与现有的质量分析方法（如使用荧光肽底物的比色法、放射性分析或Western blot）相比，该技术的主要优势在于能够在单步实时检测中确定实时动力学参数。该技术的应用前景涉及与蛋白质相关的疾病（如癌症和代谢性疾病）的治疗与诊断。由于该技术能够为多种蛋白质提供精确且高通量的检测，可用于其抑制剂的发现及疾病相关表征的研究，因此具有重要意义。本实验方案将由我实验室的 ENUA 博士研究生示范，他也是该方法与流程的首位建立者。实验开始时，通过 PCR 扩增 Cype ype pre sumo one、成熟 sumo one 以及 SENP one 催化结构域的开放阅读框。将扩增产物克隆至PCR two topo载体中。接着，通过测序验证基因序列的正确性。然后将编码CYPE pre sumo one ype CYPE sumo one ype以及SENP one催化结构域的cDNA分别克隆至带有N端Polyhis标签的PET 28 B载体中。将基因克隆至载体后，通过电穿孔法将其转化入大肠杆菌 BBL 21 DE3。将转化后的细菌接种于固体培养基平板上，挑取单菌落并过夜培养。随后，按1:100的接种比例，将转化后的细菌接种于2 L的2×YT液体培养基中。将培养物在37摄氏度下孵育3小时，以250 RPM振荡，使600纳米处的光密度达到0.5。为诱导蛋白表达，加入IPTG至终浓度为100微摩尔，并在25摄氏度下以200 RPM振荡16小时。随后，将细菌转移至250毫升离心管中。然后在4°C条件下以8,000 G离心5分钟收集细菌。离心后弃去上清液，并将细菌细胞重悬于含有Tris-HCl、氯化钠和溶菌酶的裂解缓冲液中，随后将菌液转移至50毫升离心管中。接着以70%的超声振幅对细胞进行超声处理，每次5秒，间隔进行，总时长10分钟，以破碎细菌细胞。然后，将离心管在4°C条件下以35,000 RCF离心30分钟，以分离融合蛋白与细胞碎片。在离心过程中，为每升培养的细胞准备一个10毫升的BioRad层析柱，并装入500微升镍NTI树脂。离心结束后，让溶液流经层析柱。将上清液转移至一个新的50毫升锥形管中。将上清液倒入层析柱中。待全部上清液进入树脂后，用10毫升三羟甲基氨基甲烷盐酸钠氯化钠缓冲液洗涤层析柱两次，并洗脱aole缓冲液。洗脱：向蛋白中加入500 µL相同缓冲液，此次缓冲液中含有500 mmol/L的ole，将流出液收集至微量离心管中。接下来，将溶液转移至截留分子量为10千道尔顿的透析袋中，于4°C条件下，在含有20毫摩尔/升Tris、50毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升DTT的1升缓冲液中透析过夜。透析完成后，将纯化的蛋白质转移至微量离心管中，通过Bradford法测定纯化蛋白质的浓度。随后，使用纯化的蛋白质，通过定量FRET实验检测SENP1切割前体SUMO1的速率。在微量离心管中，配制60毫升浓度分别为5100、200、500、750和1000阿摩尔的Spet Sumo 1和YA。这些对照样品将用于表征在相同缓冲液中cype和YA直接发射的恒定比率。配制12种浓度范围从0.03微摩尔到0.9微摩尔的cype pre sumo 1 y PET，以及SENP 1催化结构域的0.3纳摩尔稀释液。将荧光多孔板读板仪设置为在37摄氏度条件下，每32秒间隔测量一次荧光信号，激发波长为414纳米，检测475纳米和530纳米处的发射光；以及激发波长为475纳米，检测530纳米处的发射光，持续两分钟。为获得多孔板的自发荧光值，将一块空的384孔板放入荧光仪中并进行测量。确定多孔板的自发荧光值后，调整荧光仪的设置：对于Cype-Sumo，激发波长设为414纳米，发射光检测波长分别为475纳米和530纳米；对于ype，激发波长设为414纳米和475纳米，发射光检测波长为530纳米。接下来，按照本图所示，向384孔板的相应孔中分别加入75微升的Cype-Sumo1 Ype或Cype-Sumo1 Ype，每个样本设三个复孔。然后向每孔加入5微升已配制好的SENP1，使终体积达到80微升，立即将该板放入荧光仪中，并在运行后开始荧光检测。使用下一节中展示的定量FRET分析方法对荧光读数进行分析。该技术的核心思想是将绝对的受体信号与消化过程相关联。想要获得绝对的受体信号，我们需要从受体发射波长处的总荧光发射中排除供体和受体的直接贡献。供体和受体的直接贡献分别通过供体和受体的相关系数因子 alpha 和 beta 计算得出。本视频部分将详细说明这些计算的实现方法。为分析 SENP1 对底物消化的动力学，使用 GraphPad Prism 5 软件，首先在 Excel 中打开导出的 txt 文件，并减去微孔板的背景荧光值。在不同时间点，PrepU制剂可通过波长为414纳米的光激发来计算消化底物的浓度。在530纳米处，spet pre sumo one ype的总荧光发射可来源于三个部分：绝对FRET诱导的Y pets发射、cype直接发射以及wpe直接发射。在此方程中，FL 530/414表示在414纳米激发下530纳米处的总荧光发射，FL fret则代表绝对FRET信号。FL Spet Con 是 Spet 的直接发射。在 414 纳米激发时，FL Ype Con 是 Ype 的直接发射。在 414 纳米激发时，Spet 在 530 纳米的直接发射与其在 475 纳米的发射成正比。当在α恒定比例下以414纳米激发时，YA在414纳米激发下于530纳米处的直接发射与其在530纳米处的发射成正比。当在β恒定比例下以475纳米激发时，spet pre sumo一个ype被SENP一个消化，并在414纳米处激发。530纳米处的荧光发射降低，但仍可划分为如下的三个部分。FL Prime five 30 slash four 14 是在消化后于 530 纳米处的总荧光发射。在 414 纳米激发时，FL Prime fret 是剩余的绝对 FRET 信号，而 FL prime SPET 4 75 slash four 14 是在 414 纳米激发、消化后于 475 纳米处的 SPET 发射。该发射来自两个部分：未消化的 cype-pre-SUMO1 ype 和已消化的 cype-SUMO1。当在475纳米激发时，FL Y PET五30斜杠4 75是Y型发射，无论CYPE前体SUMO1 YP是否被SENP1消化，该发射均保持恒定。SENP1消化后剩余的FRET发射由以下方程表示，其中C为CYPE前体SUMO1 YP的总浓度，X为已消化的CYPE前体SUMO1 YA的浓度。通过合并所有项，在414纳米激发下检测到的530纳米处荧光发射可由该方程表示，用于基于FRET的蛋白酶检测以进行酶动力学研究，反应速率与底物量的变化相关，随着产物浓度从零开始指数增长。当此处所示 T 等于零时，S 下标零表示 T 等于零时的初始底物浓度。初始速度为 SENP 对 pre-SUMO 的成熟作用。可通过监测该过程中475纳米和530纳米处荧光信号的变化来确定。如图所示，前体SUMO1的成熟速度具有底物剂量依赖性，这表明SENP1的催化结构域对前体SUMO1的成熟具有优异的活性。初始反应速度是通过相同分析方法结合不同底物浓度计算得出的。KCAT 与 KM 的比值通常用于比较不同酶对同一底物，或某种特定酶对不同底物的催化效率。通过麦凯拉·塞门汀方程，以对应于不同浓度 cype 的各种初始反应速率作图，可获得 KM 和 Vmax。使用该方程测得了 pre sumo one YA 的 kcat 值。根据上述分析，计算得出的 KM 值为 0.21 ± 0.4 微摩尔。kcat 为 6.90 ± 0.28 每秒，kcat/KM 比值为 (3.2 ± 0.55) × 10⁷ 每摩尔每秒。其次，观看本视频后，您应能够充分理解如何通过一种新型的定量脂肪检测方法，在实时单步测量中测定蛋白酶动力学参数。还可以采用其他方法，例如产物抑制或抑制剂表征，以回答更多问题，如真实的表观 KM 值或抑制剂的 K 值。该技术为蛋白质领域的研究人员探索精确的遗传学、理解参与生理和病理过程的蛋白质，以及在光学传感器中的应用开辟了道路，有助于实现快速诊断和药物发现。

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定量荧光共振能量转移（福斯特共振能量转移）SENP1蛋白酶的动力学测定分析

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