Name: Microgavage斑马鱼幼虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习斑马鱼幼虫微量灌胃技术，利用显微注射设备将受控剂量的物质精准递送至肠道腔，用于研究肠道转运及肠外组织分布。该方法安全高效，可显著降低实验变异性。

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我们感谢Rawls实验室成员对内容提出的有益建议，以及Alan Fanning博士在紧密连接通透性大小及破坏方法方面的宝贵讨论。我们还感谢Michael Hooker显微技术中心的Michael Chua博士和Neal Kramarcy博士在共聚焦显微镜方面的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助，基金编号为T32 DK007737-15（J.L.C.受训人员）、F32 DK094592（授予J.L.C.）和R01 DK081426（授予J.F.R.）。

我们采用已发表的标准斑马鱼饲养和维护方案来获取用于微量灌胃的幼鱼27。我们主要通过自然繁殖方式繁育斑马鱼，并将其维持在14小时光照/10小时黑暗的循环条件下。本方案已针对受精后6至7天（dpf）的斑马鱼幼鱼微量灌胃进行了优化。我们预计，经过少量修改后，这些方法也可普遍适用于更早或更晚的发育阶段。除非另有说明，实验中主要使用6 dpf的野生型TL斑马鱼品系，且实验前未进行喂食。所有实验均在来自常规斑马鱼养殖设施的系统水中进行；但也可使用其他合适的斑马鱼培养基（例如胚胎培养基或无菌斑马鱼培养基（GZM）28）。在本方案中，“斑马鱼培养基”指用户自行选择的培养基。
1. 甲基纤维素的制备、灌胃模具及微灌胃针的制作
在实验前一天或实验当天尽早准备好甲基纤维素、用于幼虫固定的琼脂糖模具以及微量灌胃针头。
<ol>
	<li>将3 g甲基纤维素溶解于100 ml无菌去离子水或斑马鱼培养基（根据具体应用选择）中，配制成3%溶液。向瓶中加入磁力搅拌子，将水加热至接近沸腾，置于磁力搅拌器上高温搅拌。在搅拌过程中，缓慢撒入甲基纤维素，确保其不结块。在当天内逐渐降低搅拌速度和搅拌器温度，直至达到室温。</li>
	<li>继续缓慢搅拌过夜，直至甲基纤维素完全溶解。溶液可在密封容器中室温保存数月。</li>
	<li>使用塑料模具（Adaptive Science Tools, TU-1）在10 cm培养皿中制备3%琼脂糖凝胶模具，具体操作按照制造商说明进行。用封口膜密封后，于4 °C保存以防干燥。实验前升温至室温或28 °C。琼脂糖模具通常可重复使用多次。</li>
	<li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管和配备宽槽加热丝（FT330B）的Flaming Brown微电极拉制仪拉制若干灌胃针。我们用于制针的程序如下：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>针头类型</td>
			<td>压力</td>
			<td>加热</td>
			<td>拉力</td>
			<td>速度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胚胎</td>
			<td>500</td>
			<td>315</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>灌胃</td>
			<td>500</td>
			<td>315</td>
			<td>125</td>
			<td>75</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
由于不同仪器的拉制丝可能存在差异，需记录升压时间（主动加热时间）。本程序的升压时间范围为 8.57–8.79 ms。该程序制备的针尖比传统的显微注射针更短且更粗壮（图 1）。这些参数可能需要根据不同型号的微电极拉制仪进行优化。
2. 微量灌胃针的剪切、装样与校准
注意*：针头修剪是本方案中的关键步骤。此外，针头装载和校准的方法将根据所使用的显微注射仪类型而有所不同。我们已使用 Drummond II 型显微注射仪对该方案进行了优化，但预计本方案经轻微调整后也可适用于其他类型的显微注射仪器。由于不同实验室的注射装置和拉针仪可能存在差异，因此测量和校准注射体积至关重要（参见第 2.8 节）。
<ol>
	<li>在体视显微镜下剪切针头。我们使用放大倍数设为2.5倍的Leica S6E体视显微镜。在此设置下，目镜测微尺上100个刻度的总长度为2 mm。</li>
	<li>将针尖与测微尺末端对齐（即第100刻度处），然后使用尖头钟表镊在距离针尖约1 mm处（第48–50刻度）剪断针头（图1A）。</li>
	<li>针头直径应约为27–30 μm，且端部应钝化。在100倍放大倍数下检查针尖。尖锐或不规则的针头在灌胃过程中更容易造成组织损伤，应尽可能避免使用。</li>
	<li>如有条件，可使用微电极拉制仪更精确地控制剪切位置，并对针尖进行火焰抛光以去除锋利边缘（图1B）。</li>
	<li>配制灌胃溶液。在大多数应用中，我们在杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（Sigma-Aldrich）中加入0.5%酚红溶液，稀释10倍（1:10），以确保在体视显微镜下可观察到溶液，从而监测显微注射仪的工作状态以及灌胃液是否准确注入前部胃球。其他染料尚未经过评估，但也可考虑使用。</li>
	<li>使用带有25G 5/8针头的1 ml注射器将矿物油注入灌胃针中，完成针头的准备，并将其安装到Nanoject II显微注射仪上。</li>
	<li>用Parafilm膜包裹一个10 cm的塑料培养皿，以提供一个平整、防水的表面，将约2 μl灌胃溶液点样于膜上。手动回填灌胃针，注意避免在矿物油中产生气泡。</li>
	<li>为测试显微注射仪功能并校准喷出体积，将矿物油注入3 cm培养皿中，并向油中连续注射，直至液滴大小一致。使用测微尺或体视显微镜自带的测量功能测定液滴直径（如配备）。根据公式计算液滴体积（公式：V=4/3πr3）。不同针头之间的体积一致性可绘图表示（图1C）。</li>
	<li>开始灌胃前，将针尖反复浸入洁净的斑马鱼培养液中进行冲洗，以去除残留的矿物油。矿物油密度较高，若未从针尖清除，可能对上皮组织造成损伤。</li>
</ol>
3. 斑马鱼幼鱼的麻醉、固定与灌胃
<ol>
	<li>实验前将琼脂糖模具在室温或28 °C下预热。</li>
	<li>用3%甲基纤维素覆盖模具上的3条凹槽，以准备灌胃操作。甲基纤维素的用量应足以覆盖凹槽并固定斑马鱼，但不宜过少，以免迅速干燥。</li>
	<li>在洁净的6孔板中，将各实验组的斑马鱼幼鱼分别加入不同的孔中，每孔含3.5–4.0 ml斑马鱼培养液。</li>
	<li>在适当的斑马鱼培养液中配制3倍浓度的三卡因溶液（0.05% w/v）。每次对一孔幼鱼进行麻醉处理，向含幼鱼的孔中加入等体积的3倍三卡因溶液，使终浓度为1.5倍（0.025%），并轻轻摇晃混匀。</li>
	<li>一旦斑马鱼停止活动，立即使用宽口玻璃巴斯德吸管和吸管泵将其从孔中取出，并逐个放置于甲基纤维素上，使鱼头位于凹槽45°角处，鱼尾朝向90°角方向。用钝头解剖探针轻轻按压斑马鱼，使其固定在甲基纤维素中。</li>
	<li>调整Nanoject II微量注射装置，使注射针倾斜角度较小，大致与琼脂糖模具的45°角平行。确保注射针的伸展范围足以超过模具孔底部，以便在斑马鱼定位后减少进一步调整。</li>
	<li>将微量注射仪设置为“慢速注射”模式（23 nl/sec），单次释放体积设为4.6 nl（最大值）。在此参数下，注射体积应刚好充满肠道前膨大部分，而不从食管或泄殖腔泄漏。根据实验目的，也可使用更小的注射体积。</li>
	<li>一手轻微调整固定幼鱼的培养板，同时另一手操控微量注射仪的操纵杆。</li>
	<li>轻柔地将灌胃针插入麻醉后的斑马鱼口中，经食管推进，并轻微下压食管括约肌，使灌胃针尖端刚好进入肠道前膨大部分内（图2，步骤1–2，a&amp;b）。</li>
	<li>针头进入肠道前膨大部分后，轻踩脚踏开关或按下注射按钮，缓慢注入样品。随后迅速而平稳地撤出针头，尽量避免将大量样品释放回食管中（图2，步骤3–4）。</li>
	<li>完成灌胃后，使用宽口玻璃巴斯德吸管和吸管泵将斑马鱼幼鱼轻柔转移至新鲜培养液中。在吸管中吸入水至颈部弯曲处上方约1英寸处，在幼鱼头部附近的甲基纤维素中制造一个小水袋以释放幼鱼，轻柔地将鱼头提起并进入吸管口，将幼鱼从甲基纤维素中吸出。随后将幼鱼连同所有水体轻柔排出至盛有新鲜培养液的培养皿中。</li>
	<li>通过轻柔吹打或多次冲洗培养液的方式清洗幼鱼，以去除残留的甲基纤维素并帮助其从麻醉状态恢复。将幼鱼转移至培养皿或6孔板中，待后续成像与分析时使用。</li>
</ol>
4. 右旋糖酐检测法评估灌胃安全性和肠道屏障完整性
微量灌胃可用于将多种物质递送至肠道。例如，我们提供以下方案：通过灌胃给予与德克萨斯红标记的10 kD葡聚糖，以分析肠上皮屏障的完整性。旁细胞通透性至少存在两条潜在途径，根据溶质的电荷和大小选择性不同，分别称为“孔道”或“渗漏”途径29。由于该葡聚糖分子过大，无法通过旁细胞孔道途径（尺寸限制约4Å，10 kD葡聚糖直径约23Å）被肠上皮吸收9,30-32，因此若肠道屏障完整性未受损，其应保留在肠腔内。尽管10 kD葡聚糖可能通过旁细胞渗漏途径转运，但该途径容量较低且动力学较慢29,33，因此在本检测的时间范围内不太可能发生。使用EDTA作为破坏屏障完整性的“阳性对照”处理，因其可破坏上皮紧密连接34,35。该葡聚糖灌胃检测可作为质量控制试验，证明灌胃操作安全进行，未造成意外的组织损伤。此外，该检测还可用于评估基因型或处理因素对肠道屏障完整性的影响。
<ol>
	<li>配制以下灌胃溶液：1% 右旋糖酐/1× PBS/0.05% 酚红，以及 1% 右旋糖酐/20 mM EDTA/1× PBS/0.05% 酚红（阳性对照）。5% 右旋糖酐母液溶于 ddH2O 中，分装为 50 μl 每份，于 -20 °C 保存，以减少冻融次数。同时，配制不含右旋糖酐的对照灌胃溶液：1× PBS/0.05% 酚红。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>+ 对照（EDTA）</td>
			<td>无 EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>储备液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>稀释倍数</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA，pH 8</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡聚糖</td>
			<td>5%</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>10x</td>
			<td>1x</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酚红</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.05%</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>小计：</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>ddH2O：</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>总量：</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>针对每种实验条件，使用第3节中的方案对10-20条斑马鱼幼鱼进行灌胃处理。如有可能，应设置重复或三重复实验组。</li>
	<li>灌胃后，使幼鱼从麻醉状态恢复，并将其置于新鲜培养液中自由游动。</li>
	<li>灌胃后18-20分钟，按照步骤3.3的方法重新麻醉幼鱼。将幼鱼置于3%琼脂糖块上，并用3%甲基纤维素固定（以减少成像时的背景反光）。</li>
	<li>使用荧光体视显微镜（例如，Leica M205C）配合Texas Red滤光片，在能够完整显示幼鱼从吻部至肛门后缘的放大倍数下进行成像。</li>
	<li>所有图像应在相同的曝光参数下采集，以便后续进行定量和比较。所有注射葡聚糖的幼鱼肠道腔内均会呈现强烈荧光，而屏障功能则通过观察葡聚糖在肠外组织（即，躯干组织和血管）中的渗漏程度来评估（图5）。调整曝光参数，确保能够清晰观察到躯干部位的荧光信号，即使这会导致肠腔荧光过曝。</li>
	<li>合理安排各组的灌胃时间，使每组幼鱼在灌胃后的恢复时间大致相同，并在相近的时间点进行成像。本实验中，每组操作由一人完成约需1小时。幼鱼在灌胃后18-20分钟进行麻醉，每条鱼的成像时间约为1-2分钟。</li>
	<li>使用ImageJ等图像分析软件，定量分析肠道上方躯干部位区域的平均荧光强度。通过减去图像中鱼体外区域的背景荧光值，对所得数据进行背景校正。</li>
	<li>使用GraphPad Prism或类似的统计分析软件对图像分析所得数据进行绘图与统计分析。</li>
</ol>
5. 荧光微球检测法检测肠道蠕动功能
灌胃法可更精确地控制物质递送至肠道的时间和剂量，因此是肠道动力学研究的理想替代方法。既往发表的斑马鱼幼鱼肠道动力学检测技术包括通过显微镜直接观察肠段收缩和蠕动波1,21,36，或喂食掺有黄绿色荧光聚苯乙烯微球的食物26。在某些研究中，通过将幼鱼浸入含食用染料的培养液37，或采用一种称为时空图谱分析（spatiotemporal mapping）的特殊视频分析技术38,39，进一步提高了肠道动力学模式的定量能力。本文提供一项概念验证研究，证明可将荧光微球灌胃至肠道前部盲囊，通过追踪微球的移动可用于评估肠道动力学（图6）。本方法与Field及其同事26所用方法的主要区别在于，微球单独引入，无法因灌胃针直径限制而掺入食物中。
<ol>
	<li>将斑马鱼幼鱼饲养于直径10 cm的培养皿中，每皿加入35 ml培养基，直至7 dpf进行实验。从5 dpf开始，每天早晨喂食一次幼鱼饲料（幼鱼饲料配方如前所述40），每次约0.6 mg（使用无菌的1 mm接种环给药）。</li>
	<li>轻轻摇动Fluoresbrite YG 2.0 μm聚苯乙烯微球（~2.5%水悬浮液）瓶，使悬浮液充分混匀。取一滴悬浮液滴加至Parafilm膜上，以便用移液器准确量取特定体积。</li>
	<li>将微球转移至离心管中，在台式微量离心机中低速离心，弃去上清液，加入与原始体积相等的1×PBS重悬。重复该步骤，共洗涤微球2次。</li>
	<li>配制灌胃悬浮液，含0.25%微球（即原液1:10稀释）、1×PBS和0.05%酚红。每条幼鱼灌胃体积为4.6 nl，其中约含2.6×103个微球。</li>
	<li>按照第3节中的方案对所需数量的幼鱼进行灌胃。由于微球具有一定浮力，因此灌胃操作应尽可能迅速，以最大程度保持悬浮液的均匀性。</li>
	<li>本实验中，共对15条幼鱼进行灌胃，麻醉恢复后将其分别置于12孔板的单个孔中，以便单独追踪个体内的微球转运情况。然而，也可对较大群体进行灌胃，并以群体为单位评估转运情况，而非个体追踪。标准操作可参考Field et al. 的研究26。</li>
	<li>使用荧光体视显微镜，在不同时间点观察活体幼鱼肠道内荧光微球的最前端（或最前部）位置，以评估肠道蠕动功能。简要步骤为：用1×（0.017%）三卡因对幼鱼进行短暂麻醉，记录微球所在区域或拍摄图像以供后续分析评分。</li>
	<li>绘制并比较随时间变化，微球位于特定肠段的幼鱼占总数的百分比。</li>
</ol>

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未声明任何利益冲突。

在本研究中，我们描述了一种通过微量灌胃直接将物质递送至幼年斑马鱼肠道的新方法。整个操作过程中有几个关键步骤需要特别注意。首先，在进行灌胃实验前，斑马鱼幼鱼应保持良好健康状态，以避免与处理无关的死亡。另一个重要因素是灌胃针的质量。该方案中最困难的步骤之一是在适当位置剪切针头时，避免产生锋利或参差不齐的边缘。可使用微电极拉制仪（micropipette microforge）实现更一致的断裂，并对针尖进行火焰抛光，以消除锐边。尽管此类设备并非必需，但经微电极拉制仪加工的针头确实能降低操作过程中损伤幼鱼的频率。此外，微量灌胃也可在不使用琼脂糖模具的情况下，将样本固定于3%甲基纤维素中完成。然而，使用模具有助于正确固定鱼体位置，从而提高同时对多条鱼进行灌胃的速度，并减少导致物理损伤的操作失误。
与目前用于斑马鱼模型肠道载样的其他常规方法相比，该技术具有多项优势。其中最重要的优势在于，该技术能够更精确地调控引入物质的剂量以及递送的时间。这些因素对于分析物质在肠道内的吸收或转运动力学至关重要。为了让物质进入肠腔并被肠上皮吸收，斑马鱼幼体必须随水吞咽或摄取底物。然而，不同个体之间的吞咽频率和吞咽...

<table><tbody><tr><td>芬奎尔（三卡因甲磺酸盐）</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>幼虫麻醉</td></tr><tr><td>酚红溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>DPBS 中 0.5%，经细胞培养测试</td></tr><tr><td>轻质白色矿物油（高纯度）</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>用于针头回填和体积检测</td></tr><tr><td>TxRed-葡聚糖，10,000 分子量，赖氨酸可固定</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>1× PBS/酚红中 1% 悬浮液</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>水中 5 mM 储存液</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>外径 1.14 mm，内径 0.53 mm，长度 3.5 英寸</td></tr><tr><td>用于模具制作的塑料模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 微注射仪</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown 微量移液器拉制仪，3.0 mm 宽槽灯丝</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>针头制备</td></tr><tr><td>学生型 Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0.1 × 0.06 mm，用于剪切针头</td></tr><tr><td>目镜测微尺，5 mm - 100 分度</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>针头剪切</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>针头剪切和火焰抛光</td></tr><tr><td>结核菌素 SlipTip 注射器针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml，25G 5/8 针头</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 微球（2.0 &amp;mu;m）</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>肠道蠕动分析</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>灌胃操作</td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>葡聚糖屏障检测</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>循环中葡聚糖的成像</td></tr></tbody></table>

斑马鱼幼鱼的微量灌胃

Microgavage of Zebrafish Larvae

斑马鱼已成为研究肠道发育1-5、生理学6-11、疾病12-16以及宿主-微生物相互作用17-25的强大模式生物。研究肠道生物学的实验方法通常需要将特定物质以体内方式导入肠道腔内。在斑马鱼幼鱼模型中，这一过程通常通过将鱼浸泡于含有目标物质的溶液中，或通过腹壁注射来实现。采用浸泡法时，难以准确监控或控制物质进入肠道的途径和时间，因此可能导致非预期的毒性及其他对肠外组织的影响，限制了可递送至肠道的物质剂量范围。此外，在浸泡暴露过程中，不同个体幼鱼摄入的物质量可能存在显著差异26。尽管通过腹壁直接注射可避免上述问题，但正确实施注射操作难度较大，且会造成组织损伤，可能影响实验结果。 我们介绍一种斑马鱼幼鱼的微量灌胃方法。该方法旨在提供一种安全、高效且可重复的方式，以精确控制时间，将物质直接递送至斑马鱼幼鱼前肠腔内。微量灌胃技术利用大多数斑马鱼研究实验室常见的标准胚胎显微注射设备和体视显微镜。一旦将鱼体在甲基纤维素中正确固定，灌胃操作可快速完成，速度约为每分钟7–10尾，且灌胃后的存活率接近100%，具体取决于所灌注物质的性质。我们还证明，微量灌胃可将高浓度的物质导入肠道腔内，而这些物质若通过浸泡方式暴露则会对鱼体致死。为展示该方法的应用价值，我们提供了一种荧光标记葡聚糖微量灌胃检测法，可用于量化物质从肠道腔向肠外空间的转运情况。该检测可用于验证微量灌胃操作的准确性，同时也提供了一种新颖的斑马鱼检测手段，用于在不同实验条件下（例如基因操作、药物处理或环境因素暴露）评估肠道上皮屏障的完整性。此外，我们展示了如何通过灌胃荧光微球并监测其后续转运过程，来评估肠道蠕动功能。微量灌胃可用于递送多种物质，包括活体微生物、微生物分泌因子/毒素、药理学试剂以及生理探针。凭借这些能力，斑马鱼幼鱼微量灌胃方法有望推动利用斑马鱼模型系统的广泛研究领域的发展。

正确进行灌胃操作时，所给予的物质应完全停留在前肠内，食管中残留的物质应极少或没有（图3）。所选择的给药体积应能够容纳于前肠膨大部分，且不会从泄殖腔或食管漏出。如果给予的物质体积过大或推注压力过高，灌胃的物理作用力可能导致上皮组织损伤或物质渗漏。还可能将管腔内其他成分（例如，胆汁或黏液）推出或改变其分布，从而改变局部生化环境，并可能干扰实验结果。通常情况下，在给予物质后迅速撤出针头，可使食管括约肌闭合，防止物质大量反流至食管。
与浸泡法相比，该灌胃方法可更精确地控制物质暴露于幼年斑马鱼组织的时间和途径（图3）。在使用荧光内吞示踪剂FM4-64FX进行灌胃的幼鱼中，递送至肠道组织的物质含量比浸泡在探针溶液中的幼鱼更为一致（图3A-B）。在浸泡约1小时的幼鱼中，FM4-64FX可在全身的外部上皮组织中检测到，但在肠腔内的信号相对较弱（图3A.ii），而灌胃幼鱼的肠腔内则显示出明显更强的信号（图3B.<e...

我们介绍一种利用标准胚胎显微注射和体视显微镜设备对斑马鱼幼鱼进行微量灌胃的新方法。我们证明，微量灌胃是一种安全且高效的技术，可用于将精确控制的多种物质特异性地递送至斑马鱼幼鱼的肠腔内。

斑马鱼已成为研究肠道发育1-5、生理学6-11、疾病12-16以及宿主-微生物相互作用17-21的有力模式生物。

本实验的总体目标是将物质经口给予斑马鱼幼鱼的肠腔。首先，将幼鱼麻醉后放置于涂有甲基纤维素的注射模具上。接着，将幼鱼轻轻浸入模具中，并使其与灌胃针头及显微操作仪的角度保持一致。然后将针头插入幼虫的口部，并将其引导至肠腔。到位后，将材料释放到肠腔内。最后一步是将幼虫从甲基纤维素中取出，并置于新鲜培养基中，使其从麻醉状态恢复。最终，该方法可用于将物质特异性地递送至斑马鱼幼鱼的肠腔内，从而研究物质在肠道内的转运或在肠外组织中的分布。与现有的方法（如将幼鱼浸入含有目标物质的水中）相比，该技术的主要优势在于能够严格控制递送至动物体内的物质量、递送时机和剂量。这可以降低实验的变异性，并在某些情况下减少与特定物质相关的毒性。我们最初想到这种方法，是因为在尝试将某些荧光探针以足够高的浓度应用于肠道上皮组织时遇到了困难，导致显微镜下无法检测到信号。高浓度有时会杀死斑马鱼，但仍无法获得足够强的荧光信号用于成像。首先，使用微量移液器拉针仪拉制若干根灌胃针，并借用石英玻璃毛细管。转移至体视显微镜下进行针头裁剪。首先，将针头尖端与透明直尺或坐标纸的刻度线对齐。对齐后，使用精细尖头钟表镊从针尖起约一毫米处剪断针头。在100倍放大倍数下检查针尖。针的直径应约为27至30微米，且为钝头。为获得更一致的结果，应避免使用尖锐或锯齿状的针。 可以使用微型熔炉来更好地控制针头夹持点，并对针头进行火焰抛光，以去除尖锐边缘。接下来，准备灌胃溶液。对于大多数应用，可添加酚红以帮助观察显微注射器及胃内给药溶液的定位。用矿物油填充后，将胃内给药针安装到NanoJet Two微注射装置上。用生物膜包裹一个直径10厘米的塑料培养皿，以提供一个平整的防水表面，并将约2微升的胃内给药溶液滴加到Parafilm上。下一步是手动回填灌胃针。注意避免将气泡引入矿物油中。为校准推出液体的体积，将小液滴注入盛有矿物油的小培养皿中，直至液滴大小一致，使用图像分析工具测量液滴直径，并据此计算液滴体积。此处绘制了针头之间的一致性。在使用针头进行灌胃前，用干净的斑马鱼培养液冲洗，以去除残留的矿物油。在加热 aros 模具后，用 3% 甲基纤维素覆盖三个凹槽。覆盖的甲基纤维素应足以固定斑马鱼，但不宜过少，以免甲基纤维素过快干燥。接下来，将约四毫升斑马鱼培养基分装至六孔板的各孔中，然后将每个实验组的斑马鱼幼鱼转移至不同的孔中。为麻醉鱼类，需在适当的斑马鱼培养基中配制三倍浓度的三卡溶液。每孔一次。通过将等体积的三卡溶液加入培养基中并轻轻混匀，使鱼类麻醉。一旦鱼类停止活动，立即使用宽口玻璃移液管将它们逐一转移至甲基纤维素上，使鱼头位于凹槽45度角处，鱼尾朝向凹槽90度角方向。用钝头解剖探针轻轻按压每条幼鱼，使其嵌入甲基纤维素中，以固定其位置。接下来，调整纳米喷射双微注射装置，使针头倾斜至一个较小的角度。确保其延伸范围足以穿过孔底。为尽量减少后续调整的需要，将微注射单元设置为在慢速注射模式下释放 4.6 纳升。一手轻微调整载有固定幼虫的培养板，另一手控制微注射装置的显微操作器。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为斑马鱼体型非常小，且极易受损。需要经过练习才能在体视显微镜下识别食管结构，并掌握向灌胃针施加适当压力以进入肠腔的技巧。首先，将灌胃针轻轻插入一条已麻醉鱼的口中。通过食道并轻压食道括约肌，将管尖送入前肠壁内侧。进入前肠球后，在此设置下轻柔注入物质。注入的体积应恰好充满肠道前肠球部分，不得从食道或泄殖腔漏出。迅速而平稳地拔出针头。注意不要将大量物质释放到食管中。取出灌胃针后，将鱼转移至含有新鲜培养基的培养皿中。将幼鱼从麻醉状态复苏，并通过在新鲜培养基中多次冲洗去除甲基纤维素。将幼鱼转移至培养皿或六孔板中，待用。后续分析中，可通过微量灌胃法将多种物质递送至斑马鱼幼鱼体内。首先，配制必要的灌胃溶液，以演示该方法。使用与德克萨斯红偶联的10 KD葡聚糖来分析肠道上皮屏障的完整性。按照先前演示的步骤，对每种实验条件下10至20条斑马鱼幼鱼进行灌胃。如果可能，对重复或三份样本组重复此操作。灌胃后，使幼鱼从麻醉状态恢复，并将其置于新鲜培养液中自由游动。大约20分钟后，按照之前所示方法重新麻醉幼鱼。麻醉完成后，将幼鱼置于3%甲基纤维素中，并放置在3%琼脂块上，使用配备Texas red滤光片的荧光体视显微镜进行观察，选择合适的放大倍数，使幼鱼从吻部至肛门末端的区域清晰可见。肠道腔内应呈现强烈的荧光信号。然而，屏障功能的评估是通过检测出现在肠外组织中的葡聚糖水平来进行的，需调整曝光以实现躯干荧光的可视化。即使单独给予时会导致肠腔荧光过度曝光，葡聚糖仍保留在肠腔内。然而，在与EDTA共同孵育的幼鱼中（EDTA可破坏上皮紧密连接），可在循环系统及淋巴管和间隙中观察到葡聚糖。在这些示例中，使用 Image J 对斑马鱼躯干感兴趣区域内的相对平均荧光强度进行定量，并以鱼体外的一个 ROI 作为内部对照进行归一化。此处，将普通针头的结果与微锻针头的结果进行了比较。仅注射糊精的组中较少的幼鱼表现出肠外荧光，表明微锻针头对幼鱼的损伤可能性更低。更仔细地观察某一区域，可见葡聚糖仍局限于肠腔内，未泄漏至血管或肠外空间。在未使用EDTA的情况下，当与EDTA共同孵育时，可在肠外空间以及背主动脉和后主静脉的管腔内观察到葡聚糖，此处的血流信号源于血液流动。在进行该操作时，务必确保针头无锯齿状边缘，将斑马鱼在甲基纤维素中放置到位并固定稳妥，并在学习如何将针头穿过幼鱼食道时保持谨慎和耐心。该技术可用于斑马鱼的多种应用，适用于需要在肠道内进行受控引入或可视化物质的实验。它能够严格控制向动物体内递送物质的时间、途径和剂量，显著减少实验内和实验间的变异。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Microgavage斑马鱼幼虫

本视频展示了如何在单细胞阶段将吗啉代寡核苷酸（morpholino）或 mRNA...

显微注射斑马鱼胚胎以分析基因功能

来源： Li, J., 等 建立幼年斑马鱼感染模型 艰难梭菌（Clostridioides difficile） 视频实验杂志...

利用微灌胃法建立斑马鱼幼鱼感染模型

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对单个细胞进行靶向操作以引发定向应激或死亡，一直以来较难实现。本文介绍一种基于标准共聚焦紫外激光的单细胞分辨率消融方法，可在细胞培养体系及活体动物中选择性地对单个细胞施加应激并诱导其死亡。...

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向幼年斑马鱼脑室微量注射脂多糖以评估神经炎症与神经毒性

我们展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜对发育中斑马鱼视顶盖内的小胶质细胞进行活体成像的方法，从而实现对这些细胞动态行为的分析 体内.

活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

本方案描述了一种在受精后3至7天的斑马鱼幼鱼中进行药物筛选并随后进行形态学评估的实验流程。...

早期斑马鱼幼鱼中的小分子筛选与毒性检测

学习斑马鱼幼虫微量灌胃技术，利用显微注射设备将受控剂量的物质精准递送至肠道腔，用于研究肠道转运及肠外组织分布。该方法安全高效，可显著降低实验变异性。

斑马鱼幼鱼的微量灌胃

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