Name: 从基因组DNA选择性捕获的5 - 羟甲基 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学习使用β-葡萄糖基转移酶和点击化学标记5-羟甲基胞嘧啶的方法，通过生物素捕获实现高密度独立富集。该技术适用于高通量表观基因组测序研究。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院的支持（C.H. 获资助号 GM071440，PJ 获资助号 NS051630/MH076090/MH078972）。

1. 基因组DNA片段化
使用超声处理将基因组DNA打断至适合全基因组测序平台的目标片段大小范围。（我们通常将DNA打断至约300 bp。）通过1%琼脂糖凝胶电泳检测打断后基因组DNA的片段大小分布（图1）。
2. DNA 制备
根据基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的丰度确定起始DNA用量。由于不同组织类型中5-hmC水平存在显著差异，起始DNA用量需根据样本的5-hmC水平进行调整。示例请参见表1。
3. β-GT 催化的反应（葡萄糖转移反应）
<ol>
 <li>按照 表2 中的详细说明，用移液器吹打混合反应体系，并在 37 °C 水浴中孵育 1 小时。</li>
 <li>孵育结束后，使用 QIAquick Nucleotide Removal Kit 纯化反应产物，每根柱子上样不超过 10 μg DNA。每根柱子用 30 μl 水洗脱，合并洗脱液。</li>
</ol>
4. 生物素标记反应（点击化学）
<ol>
 <li>将 DBCO-S-S-PEG3-Biotin 偶联物工作液（1 mM）加入洗脱的 DNA 溶液（步骤 3 所得）中，使终浓度为 150 μM (即, 5 μl 每份工作溶液 30 μl DNA 溶液）</li>
 <li>用移液器混匀，并在 37 °C 水浴 2 小时。</li>
 <li>使用 QIAquick Nucleotide Removal Kit 清除反应产物。理想的总洗脱体积为 100 μl.</li>
 <li>使用微升级分光光度计定量回收的DNA量（例如，NanoDrop）。</li>
</ol>
5. 捕获含5-hmC的DNA
<ol>
 <li>根据制造商说明书，用 1 ml 的 1X B&amp;W 缓冲液将 50 μl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 洗涤 3 次。使用磁力架分离磁珠。</li>
 <li>向回收的生物素化 DNA（100 μl）中加入等体积的 2X B&amp;W 缓冲液，并加入已洗涤的磁珠中。</li>
 <li>在旋转仪上室温温和旋转孵育 15 分钟。</li>
 <li>使用磁力架分离磁珠，并用 1 ml 的 1X B&amp;W 缓冲液洗涤磁珠 3 次。</li>
 <li>将磁珠在 100 μl 新鲜配制的 50 mM DTT 中孵育 2 小时，室温下温和旋转，以洗脱 DNA。</li>
 <li>使用磁力架分离磁珠。吸出洗脱液，并根据制造商说明将其上样至 Micro Bio-Spin 6 柱中以去除 DTT。目标 DNA 现在位于溶液中。</li>
 <li>使用 Qiagen MinElute PCR 纯化试剂盒对上一步洗脱的 DNA 进行纯化，并将 DNA 洗脱于 10 μl EB 缓冲液中。使用 Qubit 荧光计或 NanoDrop（当浓度高于 20 ng/μl 时）定量 DNA。所得 DNA 可用于后续全基因组测序文库构建。</li>
</ol>
6. 代表性结果
如果基因组DNA的质量较高，在β-GT和生物素化反应后的典型回收率约为60-70%。然而，捕获效率因不同组织类型而有显著差异，具体取决于样品中5-hmC的水平。通常情况下，脑组织基因组DNA的捕获效率约为4-9%，在某些极端情况下，效率可高达12%。对于胚胎干细胞（ES细胞），平均捕获效率约为2-4%，相比之下，神经干细胞的捕获效率约为0.5%。迄今为止观察到的最低效率来自癌细胞的基因组DNA。所有富集后的DNA均可直接用于标准的下一代测序文库构建流程。此外，如果有相应的引物，捕获后的DNA也可作为实时定量PCR的模板，用于检测与输入DNA相比某些片段的富集情况。
<img alt="超声处理DNA样品的凝胶电泳图；显示碱基对标记物和分离结果。" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 人基因组DNA片段在1%琼脂糖凝胶中的超声处理结果。 从人iPS细胞中提取的10 μg基因组DNA溶于120 μl的1× TE缓冲液中，使用超声处理仪（Covaris）进行超声处理。超声处理后，取2 μl样品加载到1%琼脂糖凝胶上，并使用100 bp DNA标记物作为参照，以比较超声处理后DNA片段的大小。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>_ μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 X β-GT 反应缓冲液</td>
 <td>2 μl</td>
 <td>1 X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>最多 10 μg 基因组 DNA</td>
 <td>_ μl</td>
 <td>最多 500 ng/μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UDP-6-N3-Glc (3 mM)</td>
 <td>0.67 μl</td>
 <td>100 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>β-GT (40 μM)</td>
 <td>1 μl</td>
 <td>2 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>20 μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
i) 对于组织基因组DNA（高5-hmC含量 > 0.1%）
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>_ μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 X β-GT 反应缓冲液</td>
 <td>10 μl</td>
 <td>1 X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>最多 20 μg 基因组 DNA</td>
 <td>_ μl</td>
 <td>最多 500 ng/μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UDP-6-N3-Glc (3 mM)</td>
 <td>1.33 μl</td>
 <td>100 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>β-GT (40 μM)</td>
 <td>2 μl</td>
 <td>2 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>40 μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
ii) 对于干细胞基因组DNA（中位5-hmC含量约为0.05%）
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 <td>终浓度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>_ μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 X β-GT 反应缓冲液</td>
 <td>10 μl</td>
 <td>1 X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>最多 50 μg 基因组 DNA</td>
 <td>_ μl</td>
 <td>最多 500 ng/μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UDP-6-N3-Glc (3 mM)</td>
 <td>3.33 μl</td>
 <td>100 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>β-GT (40 μM)</td>
 <td>5 μl</td>
 <td>2 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>100 μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
iii) 对于癌细胞基因组DNA（5-hmC含量较低，约0.01%）
表1. 使用选择性化学标记法对5-hmC水平不同的样本进行DNA输入量和标记反应的示例。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>样品</td>
 <td>5-hmC 水平</td>
 <td>起始 DNA (μg)</td>
 <td>标记后回收量（上样至磁珠）(μg)</td>
 <td>回收率</td>
 <td>拉下 DNA (ng)</td>
 <td>拉下效率</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>成年小鼠小脑</td>
 <td>0.4%</td>
 <td>10</td>
 <td>7.5</td>
 <td>75%</td>
 <td>236</td>
 <td>3.1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>出生后第 7 天小鼠小脑</td>
 <td>0.1%</td>
 <td>11</td>
 <td>9</td>
 <td>82%</td>
 <td>140</td>
 <td>1.6%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>小鼠 ES 细胞 E14</td>
 <td>0.05%</td>
 <td>60</td>
 <td>42</td>
 <td>70%</td>
 <td>350</td>
 <td>0.8%</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 小鼠脑组织和胚胎干细胞的代表性结果。

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li>
<li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li>
<li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241(2011).</li>
<li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li>
<li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li>
<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888(2010).</li>
<li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li>
<li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li>
<li>Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine%3A+a+new+kid+on+the+epigenetic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).</li>
<li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).</li>
<li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+recombinant+%CE%B2-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li>
<li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li>
<li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mbd3%2FNURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154(2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）是一种最近发现的表观遗传修饰，在某些哺乳动物细胞类型中含量较高。本文介绍的方法用于确定5-hmC在全基因组范围内的分布情况。我们利用T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶将含有叠氮基团的改造葡萄糖基团转移至5-hmC的羟基上。该叠氮基团可通过化学反应与生物素连接，从而实现对含有5-hmC的DNA片段进行检测、亲和富集及测序分析。与基于5-hmC抗体的羟甲基化DNA免疫沉淀测序技术（hMeDIP-Seq）13-15相比，本方法具有优势；尽管hMeDIP操作简便，但其对高密度5-hmC区域存在显著偏好性，且在不同次独立富集实验中通常产生不一致的结果。而我们的方法不会引入此类偏差。
然而，就我们的标记与捕获方法而言，可能存在两个问题。第一个问题是标记与捕获的特异性。由于最近有报道称5-羟甲基尿嘧啶（5-hmU）也可作为β-GT的底物，可能会引入假阳性信号，导致富集到的片段并非特异性地与5-hmC相关16。不过，这一担忧可能并无实际依据，因为高度活跃的5-羟甲基尿嘧啶-DNA糖基化酶会持续清除这种DNA损伤，使得哺乳动物基因组...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5M 氯化钠 (NaCl)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>0.5M pH8.0 乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma 碱 (Tris) pH7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027)</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M, pH7.4</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>DBCO-S-S-PEG3-生物素偶联物</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>A112P3</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇，超纯 (DTT) Superpure</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 核苷酸去除试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 6 柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6222</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne</td><td>Invitrogen</td><td>650-01</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>UDP-6-N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-葡萄糖</td><td>Active Motif</td><td>55013</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;酶&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;#946;-葡萄糖基转移酶 (&amp;#946;-GT)</td><td>New England Biolab</td><td>M0357</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labquake 试管摇床</td><td>Barnstead</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labquake 试管摇床</td><td>Thermolyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂配制&lt;/strong&gt; 10 X &amp;#946;-GT 反应缓冲液 (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)，2 X 结合与洗涤 (B&amp;W) 缓冲液 (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20)。</td></tr></tbody></table>

基因组dna中5-羟甲基胞嘧啶的选择性捕获

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-甲基胞嘧啶（5-mC）约占人类基因组DNA中总胞嘧啶的2%–8%，影响多种生物学功能，包括基因表达、基因组完整性维持、亲本印记、X染色体失活、发育调控、衰老以及癌症发生1。最近，人们在哺乳动物细胞中，特别是在胚胎干细胞（ES细胞）和神经元细胞中，发现了一种5-mC的氧化产物——5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）2-4。5-hmC是由TET家族铁（II）/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶催化5-mC氧化而生成的2, 3。研究表明，5-hmC可能参与胚胎干细胞（mES细胞）的维持、正常造血过程、恶性肿瘤的发生以及受精卵的发育2, 5-10。为了更深入地理解5-hmC的功能，建立一种可靠且简便的测序系统至关重要。传统的亚硫酸氢盐测序法无法区分5-hmC与5-mC11。为揭示5-hmC的生物学作用，我们开发了一种高效且特异的化学方法，用于标记和富集5-hmC，该方法利用了一种噬菌体酶，可特异性地将葡萄糖基团添加至5-hmC上12。
本文介绍一种用于选择性化学标记5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的简便两步法。第一步标记步骤中，基因组DNA中的5-hmC在T4噬菌体来源的葡萄糖基转移酶（β-GT）催化下，通过将修饰型辅因子UDP-6-N3-Glc（6-N3UDPG）上的6-叠氮基葡萄糖转移至5-hmC，从而实现对5-hmC的标记。第二步为生物素化步骤，通过点击化学反应将二硫键连接的生物素分子连接到叠氮基团上。这两个步骤均具有高度特异性和高效性，无论基因组区域中5-hmC的丰度如何，均可实现完全标记，并产生极低的背景信号。在完成5-hmC的生物素化后，含有5-hmC的DNA片段可通过链霉亲和素磁珠以密度无关的方式被选择性捕获。所获得的5-hmC富集DNA片段可用于后续分析，包括新一代测序。
我们的选择性标记与捕获方案具有高灵敏度，适用于任何来源的基因组DNA，且可应对不同或多样化的5-hmC丰度。尽管本方案的主要目的是用于下游应用（即，通过下一代测序绘制基因组中5-hmC的分布图谱），但它同样兼容单分子实时SMRT（DNA）测序，后者能够实现对5-hmC的单碱基分辨率测序。

本文描述了一种两步标记法，首先利用β-葡萄糖基转移酶（β-GT）将叠氮葡萄糖转移至5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），随后通过点击化学反应连接生物素接头，从而实现简便且不受密度影响的富集。该高效且特异的标记方法可实现5-hmC的低背景富集，并通过高通量测序进行表观基因组高通量作图。

基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶的选择性捕获

5-甲基胞嘧啶（5-mC）约占人类基因组DNA中总胞嘧啶的2-8%，影响多种生物学功能，包括基因表达调控、基因组稳定性、X染色体失活、印记基因调控以及胚胎发育等。

本实验的总体目标是对5-羟乙基胞嘧啶（5-hydroxyethylcytosine）这一新发现的DNA修饰进行标记和富集。首先通过超声处理将基因组DNA打断成片段，然后利用Qlik化学技术进行β-葡萄糖基转移酶反应，将叠氮葡萄糖基团转移至DNA上的5-羟乙基胞苷残基。接着将链霉亲和素-生物素连接子连接到叠氮基团上，从而生成生物素标记的DNA。随后，以密度非依赖的方式，利用链霉亲和素磁珠特异性捕获含有5-羟乙基胞苷的DNA片段。纯化的富含五种羟乙基胞苷的DNA片段可用于下游分析，包括下一代测序。该技术相较于现有方法（如基于抗体的方法）的主要优势在于，对羟乙基胞嘧啶的捕获不依赖于PHY C的密度。实验室高级研究助理Eugene Lee将演示此实验方案。首先，将基因组DNA超声处理至适合全基因组测序平台的片段大小。在1%琼脂糖凝胶上检测基因组DNA片段的大小分布。然后根据基因组DNA中五羟乙基胞苷的丰度确定起始DNA用量。由于不同组织样本中五羟乙基胞苷的含量存在显著差异，起始的DNA量将取决于样本中五羟乙基胞苷的水平。请参见论文中的表一以获取示例。标记过程的第一步是进行一个基本的转移反应，将AZA葡萄糖基团转移到片段化的基因组DNA的五羟乙基胞苷残基上。混合反应组分并通过移液混匀，然后将酶反应在37摄氏度水浴中孵育1小时。使用Kayak快速核苷酸去除试剂盒进行反应纯化，每柱上样10微克DNA，每柱用30微升水洗脱DNA，并在标记过程的第二步中收集样品。通过点击化学方法，将生物素化连接子连接到 eza 基团上。在生物素偶联反应中，每 30 微升 DNA 溶液加入 5 微升生物素偶联工作液。在 37 摄氏度水浴中孵育 2 小时。使用小离心柱快速核苷酸去除试剂盒处理反应产物，并将DNA溶解于100微升溶液中。随后使用NanoDrop定量回收的DNA。起始使用50微升链霉亲和素磁珠。按照制造商说明书进行三次洗涤，并将磁珠置于磁力架上收集。随后，用100微升2倍BNW缓冲液稀释生物素标记的DNA，将样品加入洗涤后的磁珠中。室温下轻轻旋转孵育15分钟。使用磁力架收集磁珠，并在洗脱DNA前清洗三次。加入100微升新配制的50毫摩尔DTT，在室温下轻轻旋转孵育两小时。使用磁力架分离磁珠。然后收集含有目标 DNA 的 EENT，并将样品上样至 microbio spin six 柱。为去除 DTT，需在 cogen 柱上进一步纯化样品，并用 10 µL EB 缓冲液洗脱 DNA，使用 Qubit 荧光仪或 NanoDrop 定量 DNA。如果浓度高于 20 ng/µL，此 1% 琼脂糖凝胶显示的是从人诱导多能干细胞（iPS 细胞）中分离并经超声处理的 DNA 片段。对于下一代测序等下游应用，典型的片段化大小约为 300 个碱基对。请注意，当基因组 DNA 质量较高时，β-GT 和生

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生物学

从基因组DNA选择性捕获的5  - 羟甲基

EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒可用于分析和定量特定基因座中的 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。该试剂盒通过利用β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）的酶促反应，将葡萄糖添加到 5-hmC 的羟基上，从而区分 5-mC 与 5-hmC。当 5-hmC 出现在 CCGG 序列背景下时，此修饰会将原本可被切割的 MspI...

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本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。...

完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

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