卵裂球外植体测试胚胎发育过程中细胞命运的承诺
2013年1月26日
单个胚胎细胞的命运可以继承的分子和/或通过来自相邻小区的信号的影响。利用爪蟾胚胎的卵裂阶段的命运地图，单个卵裂球可确定为文化隔离的贡献进行评估的遗传分子与细胞间的相互作用。
本视频中展示的方法利用卵裂期 opus 胚胎的命运图来识别孤立的单激光器培养物，以评估胚胎硫酸盐是由内在指令还是外在指令决定的，收集前两个细胞胚胎，其中第一个卵裂沟将动物半球的浅色素区域一分为二。当胚胎达到 16 到 32 个细胞时，培养这些胚胎，然后去除玻璃膜，并将相邻细胞从所选细胞中解剖出来。为了解释，然后将解剖的冲击波转移到螺旋涂层培养物中的凹陷处，充分培养。
一旦解释达到所需阶段，就收获它以使用原位杂交 QPCR 或免疫组织化学评估基因或蛋白质表达。与其他技术（例如培养、大群胚胎细胞或登录器官）相比，该技术的主要优点是，从谱系追踪研究中得知其发育命运的单个胚胎亵渎者可以在不添加生长因子或存在相邻细胞的情况下进行培养。因此，可以直接测试细胞内在的因素是否指示亵渎成为特定组织的前体，或者它是否需要来自周围细胞的信号。
这种方法的视觉演示至关重要，因为 Blairs 的解剖及其转移到培养孔需要在立体显微镜下进行精细作。在本视频中，我将使用这种方法来演示母体来源的 mRNA 是否使细胞偏向在解剖显微镜下工作的神经命运。使用 Illumina 研磨膜锐化四组镊子。
一对镊子用作备用，以防尖端在手术过程中损坏，将所有四个镊子高压灭菌并储存在无菌容器中，分别制作 500 毫升 0.1 x 和 1.0 x 改良巴特盐水或 MBS，并过滤消毒。将这些溶液在 14 至 18 摄氏度下储存在玻璃螺帽瓶中数月，在 100 毫升 1 X 培养物中制备 2% 电泳级 aros。中等高压灭菌器溶解 aros 微波炉，在下次需要时将 aros 液化，而 aros 是液体。
将约 0.5 毫升倒入无菌 24 孔培养板的每个孔的底部。这将防止植入物粘在塑料上。然后将大约 2 到 3 毫升倒入 2 到 360 毫米培养皿的底部，轻轻旋转以分散。
这些将用作解剖皿，aros 可防止胚胎粘附在塑料上。一旦它们的膜被移除，当 aros 冷却并硬化火焰时，将 6 英寸牧场移液器的尖端熔化成一个球。短暂地重新构建球，然后在培养板的孔中轻轻接触 aros 的表面。
这将创建一个浅凹陷，X 解释将放置在其中。对板中的每个孔重复此作。接下来，用 1 毫升 1 x 无菌培养基填充培养板的每个孔。
然后用 0.1 XMBS 填充解剖皿，以促进 blaster 分离。准备好解剖皿后，将去除果冻外套的受精卵转移到含有 0.5 x 培养基的 100 毫米培养皿中。那些没有立即使用的可以在 14 摄氏度下培养，同时对第一个培养皿进行两个细胞胚胎的调查。
使用塑料移液管使用解剖显微镜检查第一个培养皿中的胚胎，将大约 101 个细胞和两个细胞胚胎转移到一个装有 0.5 x 培养物的单独培养皿中。中等。将培养皿放入 14 摄氏度的培养箱中。该测定准确评估细胞发育潜力的能力取决于根据命运图剖析出正确的亵渎
神明。因此，在两个细胞阶段选择具有正确色素沉着模式的胚胎至关重要，这些胚胎因此符合规则的卵裂模式。如此处所示。规则的卵裂通常只发生在胚胎的一侧。
如果供体细胞来自常规侧，这些胚胎仍然可以用作供体。当胚胎到达两个细胞阶段时，将第一个卵裂沟将动物半球中浅色区域一分为二的胚胎分选到一个单独的培养皿中，分选大约是要解剖的胚胎数量的五倍。这些将是解释的捐助者。
在整个过程中，将剩余的两个细胞胚胎放在供体胚胎旁边的单独培养皿中，以作为兄弟姐妹对照以分阶段解释。胚胎分类和解剖后，返回培养箱中的培养皿中，找到更多的单细胞和双细胞胚胎。由于一个细胞胚胎需要大约 90 分钟才能分裂，因此可以在取卵后最多两个小时内完成。
为了准备解释，将 5 到 10 个胚胎放入解剖皿中。然后定位第一个胚胎，以便可以用镊子抓住透明的玻璃瓶膜。它通常看不到，但可以在动物极处抓住，在那里它被胚胎表面上方的透明间隙隔开。
用一只手用锋利的镊子，与要解剖的冲击波保持一定距离，以免损坏它。然后用另一只手用锋利的镊子抓住靠近其他镊子尖端的膜，并沿相反方向轻轻拉动以剥开膜。当膜被移除时，胚胎会变平。
接下来，用镊子抓住相邻的细胞，并将该细胞用作手柄，这样另一只手的镊子就不会直接接触要解剖的细胞，轻轻地将剩余的相邻细胞从所需的亵渎中拉开。如果以具有相同命运的中线单元格为目标，则可以将它们作为一对一起删除。最后，解剖掉手柄细胞。
用无菌玻璃杯通过移液管拿起亵渎或亵渎对，避免气泡和过度吸力。将牧场移液管的尖端放在 X ex解释培养皿的孔中的培养基表面下，然后轻轻排出喷出喷砂器。它应该在重力作用下滑入浅洼地。
来自多个胚胎的亵渎物可以通过将它们沉积在培养物中的同一凹陷中来组合成一个解释。好吧，对解剖皿中剩余的胚胎一个一个地重复此过程。大约 10 个胚胎后，解剖皿将充满细胞碎片。
发生这种情况时，换到下一个解剖皿。完成所有解剖后，检查解释是否在浅凹陷中。如果没有，可以在最后一次解剖后约一小时，用已在 70% 乙醇中消毒的发环轻轻地将它们推入凹陷中，并在室温下在工作台上风干孵育植入物。
用无菌玻璃牧场移液器培养物去除愈合的解释周围的碎片。在 14 至 20 摄氏度的 exopen 板旁边，位于包含兄弟姐妹对照胚胎的培养皿旁边。兄弟姐妹胚胎将表明亵渎解释的发展阶段。
培养大约一到两个小时后，外植的卵裂球将分裂大约四次，并脱落受损邻近细胞留下的大部分碎片。20 小时后，它们会形成小而坚固的细胞球。当兄弟姐妹达到所需的发育阶段时，收获解释。
这些解释可以很好地存活，即使一些细胞分解。因此，如果培养物中有混浊的肿块，请用发环或镊子探索它，以确定是否埋藏着健康的外表。用玻璃杯通过移液管捡起小体积培养液中的提取物，然后轻轻地将它们排出到适合进行测定的固定剂或裂解缓冲液中。
在16 个细胞阶段解剖两个背侧亵渎者或两个腹侧亵渎者，并在 14 摄氏度下在一个 XMBS 中培养，直到兄弟姐妹胚胎达到早期神经板阶段。测定每个样品的合子神经板的表达。Gene Sox 二通过原位杂交，这被视为蓝色反应产物。
该测定的结果表明，大多数背侧动物亵渎者是神经板的前体，可以自主表达 SOX 2。也就是说，没有来自胚胎其他区域的额外信号。那些不表示 SOX 2 的 explan 可能在剖析时被错误地识别出来。
相比之下，作为腹侧表皮前体的腹侧动物亵渎者均不表达 SOX 2。这些数据表明，背侧动物亵渎者具有形成神经组织的内在能力，而腹侧动物亵渎者则没有注意到。一些背侧外表也拉长了表明背侧中胚层形成的形态。
这些卵裂球也被褪色以在完整胚胎中形成 Noor，并且外胚培养物表达 Noor 标记蛋白以测试改变母体表达的神经基因的内源水平的效果。将 Fox D 5 mRNA 注射到 8 个细胞腹侧前体亵渎体中。如图所示，大多数腹侧植入物表达 SOX 2。
相反，当通过将反义形态寡核苷酸注射到 8 个细胞背前体冲击波中来降低 Fox D five 的内源水平时，只有少数背外表达 SOX 2。这些实验表明，Fox D five 的母体表达在背侧亵渎者获得神经命运的内在能力中发挥作用。可以执行其他方法，例如注射到 Blairs 中进行解剖，无论是用于功能增益的 mRNA 还是用于功能丧失的反义morpho 寡核苷酸，都可以用于回答其他问题。
例如，哪些基因参与细胞产生特定发育命运的内在能力？此外，可以通过向培养基中添加纯化因子来测试已知的信号因子。这种方法也可用于将单个亵渎者移植到完整胚胎中的新位置。
该测试移植细胞是否致力于其原始发育命运，此信息对于定义多能胚胎细胞致力于成为确定组织的前体的细胞机制至关重要。
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概述
这项研究探讨了遗传分子和细胞间相互作用对裂殖期非洲酋蛙胚胎细胞命运的影响。通过使用命运图谱，研究人员可以单独培养单个胚胎细胞，以辨别内源性和外源性因素的贡献。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 胚胎学
背景
- 胚胎细胞的命运可以受到遗传分子和邻近细胞信号的影响。
- 理解这些影响对发育生物学至关重要。
- 非洲酋蛙胚胎是研究早期发育过程的模型。
- 命运图谱提供了细胞谱系和命运决定的视觉表现。
研究目的
- 评估胚胎细胞的命运是否由内源性因素或外源性信号决定。
- 单独培养单个胚胎细胞以进行详细分析。
- 利用谱系追踪研究来识别发育结果。
使用的方法
- 收集两细胞期非洲酋蛙胚胎。
- 从选择的胚胎细胞中分离邻近的细胞。
- 在受控环境中培养分离的胚胎细胞。
- 使用in situ杂交和QPCR等技术评估基因或蛋白质表达。
主要结果
- 单个胚胎细胞可以在没有邻近细胞影响的情况下被培养。
- 该研究提供了关于细胞命运决定中内源性和外源性因素的见解。
- 基因和蛋白质表达分析揭示了分离细胞的发育潜力。
结论
- 胚胎细胞内的内源性因素在其发育命运中起着重要作用。
- 来自邻近细胞的外源性信号也很重要，但可以单独进行研究。
- 这种方法允许更清晰地理解细胞命运决定机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct testing of intrinsic versus extrinsic factors in cell fate determination, providing mechanistic de-risking for target validation in developmental pathways. By isolating single blastomeres with known lineage, it supports predictive confidence in early discovery by clarifying whether cellular responses are cell-autonomous or dependent on microenvironmental cues. This approach aids in distinguishing true target engagement from indirect effects, improving go/no-go decisions in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether a cell’s fate is fixed or influenced by extrinsic signals, informing target autonomy.
- Operational Value: Uses fate maps to identify and isolate single precursors with known developmental potential, enabling precise experimental design.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening readiness by establishing baseline autonomous behavior in a controlled, neighbor-free system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-cell resolution readouts (e.g., SOX2 expression via in situ hybridization or qPCR) for pathway-specific reporter assays.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture of isolated blastomeres in defined media without exogenous factors, reducing variability.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early fate commitment mechanisms to later tissue formation, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes require cell-cell communication, helping de-risk targets dependent on niche signaling.
- Predictive Confidence: Distinguishes cell-autonomous drivers from non-autonomous effects, improving target selection for modulation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for pathways where cellular context influences phenotype expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables to determine if a target’s effect is intrinsic or requires intercellular signaling.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs (e.g., marker gene expression) suitable for high-content or multiplexed assay formats.
- Analytics: Enables statistical comparison of fate outcomes across conditions, supporting replication and cross-functional data interpretation.
- Translational Research: Connects early embryonic decisions to later developmental stages, aiding in disease-relevant system modeling when lineage conservation exists.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing genetic or pharmacological perturbations in a defined, isolated cellular context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating intrinsic cellular properties from extrinsic microenvironmental influences.
- Operational Value: Promotes standardization through defined dissection, culture, and readout procedures, enhancing reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose efficacy depends on cell-autonomous function.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by clarifying whether a target’s modulation requires combination with microenvironment-modulating agents.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and fluorescence- or marker-guided cell identification using fate maps.
- Dependent on sterile culture infrastructure, including controlled-temperature incubators and precision pipetting tools for blastomere transfer.
- Necessitates standardization of culture conditions (e.g., MBS concentration, temperature) to ensure comparability across experiments.
- Must account for variability in embryo quality and cleavage symmetry when selecting donor cells for isolation.
- Limited to species with well-established fate maps and ex utero culture feasibility (e.g., Xenopus), restricting direct translation to mammalian systems without adaptation.
