同时光感受器和二阶神经元在两栖类动物的视网膜切片制备全细胞记录
June 1st, 2013
我们描述了制备薄视网膜片从水产虎蝾螈（ Ambystoma tigrinum），并解释我们如何使用这些切片研究获得双全细胞电压钳记录，从感光细胞和二阶的水平细胞和双极细胞在视网膜突触处理。
该程序的总体目标是从水生虎蝾螈视网膜制备薄组织切片，并将它们用于来自光感受器和二阶水平和双极细胞的同步全细胞电压钳记录。这是通过首先解剖蝾螈眼并在一块硝酸纤维素膜上分离视网膜来实现的。第二步是切下视网膜的薄片并将它们放置在记录室中。
接下来，将腔室放置在直立固定台显微镜上，并将膜片移液器放置在视网膜切片上方。最后一步是从突触前、光感受器和突触后水平或双极细胞获得全细胞记录。最终，成对的全细胞记录可用于纵突触释放并研究视网膜中细胞之间的相互作用。
与单细胞制备不同，切片制备保留了完整的正接触，与全装视网膜制备不同，切片视网膜暴露了各种视网膜层，允许随时访问所有不同的细胞类型。在 Retina 切片中。制剂可用于电生理记录，包括多个细胞的同时记录和成像实验。
这种制剂已被证明对于研究视网膜神经元之间的突触相互作用非常有价值。在本视频中，我们描述了使用虎蝾螈视网膜制备切片，并强调了一些可以决定成败的小细节。通过组装腔室开始此过程。
将两颗相距 8 到 10 毫米的真空润滑脂珠放在记录室中，以形成一个用于 super fase 的通道，并在第二次润滑脂跳动时嵌入视黄醇切片，比这两颗润滑脂珠分别多几毫米，以起到限制溢出的作用。然后在腔室末端放置一小块三角形 Kim 抹布，以确保液体与参比电极接触。之后，将一块硝酸纤维素膜平压在玻璃显微镜上。
滑到两个小的真空润滑脂珠上。准备组织切片机。将双刃剃须刀片分成四块。
然后将其中一个连接到切片臂上。切割一片薄薄的硝酸纤维素滤纸，确保剃须刀片的刀刃平放在记录室上。接下来，在显微镜下用一把小威尼斯剪刀对蝾螈实施斩首安乐死后，在眼睛上成核，切开连接眼睛和周围眼眶的皮肤。
然后将眼睛向前拉，将剪刀滑到其下方，以切开眼部肌肉和视神经。之后，将去核的眼睛放在油毡块上的棉床上。现在用锋利的手术刀片在角膜中心做一个小切口。
通过将细威尼斯剪刀滑入切口并将切口径向向 Serrata 光环延伸，去除角膜。然后通过在切口之间旋转油毡块或棉花，围绕锯齿光环圆周切割。切开眼睛周围后，将角膜和晶状体从眼罩侧面拉出，将其取出。
将剩余的眼罩转移到用两栖生物盐水溶液润湿的油毡块的坚硬表面上。用锋利的剃须刀片以精细的锯切动作将其切成三份，以确保它完全穿过巩膜。然后将一两片 IUP 放在硝酸纤维素膜上，视网膜表面朝下。
用额外的盐水浸没剩余的碎片。之后，将它们放入冰箱中，以防以后切下额外的切片。现在，用一对细镊子轻轻地将 IUP 片压在硝酸纤维素膜上。
用几滴冷的两栖动物盐水浸没硝酸纤维素膜和 IUP 片。然后通过触摸硝酸纤维素膜和 iup 边缘的一块 Kim 抹布来排出盐水溶液。之后，将 IUP 浸入硝酸纤维素膜中，加入几滴冷的两栖动物盐水溶液。
同样，随后剥离巩膜脉络膜视网膜色素上皮以隔离视网膜。如果视网膜没有紧密粘附，请用 kim 湿巾将盐水排出。为了将视网膜更牢固地拉到硝酸纤维素膜上，更换盐水并在必要时重复该过程。
接下来，用冷的两栖动物盐水填充腔室。将其转移到组织切片机的阶段。然后轻轻但牢固地将视网膜和硝酸纤维素膜切成 125 微米的细条。
将整个视网膜切成薄片后，将视网膜切片一一转移到记录室的主通道。要转移切片，请握住一条膜条，同时滑动其下方的腔室。当切片位于腔室中心部分上方时，请务必将其浸没在水中。
将硝酸纤维素膜的边缘嵌入真空润滑脂条中，并将其旋转 90 度。要查看视网膜层，请将硝酸纤维素膜平压在玻璃表面，即使每片上都没有视网膜。以大约毫米的间隔放置硝酸纤维素膜条，以帮助打破表面张力，从而改善流体流动。
继续逐个转移切片，直到切片沿着灌注通道的整个长度放置。转移所有切片后，将记录室移至正置固定台显微镜的载物台上。将参比电极引线连接到放大器头级上的地线。
使用 40 至 60 倍物镜的长工作距离水浸聚焦在切片上。下一个超级。以每分钟 1 毫米的速度将切片与鼓泡有氧气的两栖生物盐水溶液熔合。
将吸入管路连接到腔室的输出管路。然后，通过旋转抽吸针的斜端或将腔室末端的 kim 擦拭布移近或远离流出针尖端的开口，调整流出量以平衡流入量。在昏暗或红外光下检查切片。
接下来，确定一对细胞、一个感光器和附近的水平或双极细胞以进行批发。记录在细胞内溶液实验之前准备的 Philip 移液器，将其安装在电极支架上。接下来，稍微抬高显微镜物镜。
将感光器移液器置于物镜下方。然后将其降低，使尖端位于切片的正上方，并同时调整焦距。避免走得太远。
使用第二个移液器重复此过程。接下来，使用 5 到 10 毫伏的去极化脉冲检查移液器电阻。调整 amp扩音器上基线电流电平的任何偏移。
之后，施加轻微的正压，同时定位突触后移液器，使其接触水平或双极细胞体。然后定位突触前移液器，使其接触杆状或锥形光感受器的细胞体。在监测电阻释放的同时，突触后移液器上的正压，有时正压的释放足以形成千兆欧姆密封。
当尖端电阻增加到 100 兆欧姆以上后，施加负 60 毫伏的保持电位。然后，当获得千兆密封时，消除移液器电容瞬态。使用膜片钳放大器的电容补偿电路，用感光移液器重复天花板程序，施加负 70 毫伏的保持电位并取消移液器电容。
瞬时，然后通过对每个细胞施加抽吸来破坏贴片。贴片破裂通过全电池电容瞬变的出现很明显。现在，通过闪光并以 20 毫伏的增量提供从负 120 到正 40 毫伏的一系列电压步长，从生理上确认突触后细胞的身份。
要评估细胞是否突触连接，请提供 25 到 100 毫秒的 60 毫伏电压。逐步去极化到光感受器并寻找突触后电流。在二阶神经元中，以下是蝾螈视网膜垂直切片中神经元的光反应的代表性痕迹。
锥形水平电池和关闭双极电池都显示响应光起的向外电流。在水平和双极细胞记录中，闪光后突出的向内电流是由光感受器在光偏移处去极化时谷氨酸释放增加引起的。双极细胞在光开始时以向内的电流响应，这是由反转代谢型谷氨酸受体信号级联的标志和 tripm one 通道的激活引起的。
水平电池和双极电池可以通过它们的电流电压关系来区分彼此。水平电池通常具有线性或向内整流电流电压关系，输入电阻小于 500 兆欧姆双极电池具有向外整流电流电压关系，输入电阻在 0.5 至 2 千兆欧姆之间。该图显示了锥形水平电池对和锥形双极电池对记录的代表性结果。
在每种情况下，将视锥体从负 70 毫伏的保持电位去极化至负 10 毫伏，从而在视锥体中产生电压门控钙电流和快速向内的突触后电流。水平或双极细胞 Retinal 切片中的电流。制剂已用于数百项关于视网膜解剖学和生理学的研究。
它们特别有利于同时检查多个细胞的反应，因为它们有助于同时记录和成像多个细胞。看完这个视频后，你应该对如何解剖视网膜、切下薄视网膜切片、将它们放置在记录室中以及从成对的突触连接自我中获得大量记录有很好的了解。
概述
本文描述了从水生虎斑蝾螈（Ambystoma tigrinum）制备视网膜薄片的方法，以及在视网膜中研究突触处理的方法。该技术涉及从光感受器和二级水平和双极细胞获取双重全细胞电压钳记录。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 视网膜生物学
背景
- 视网膜切片制备允许完整的突触接触。
- 它暴露了各种视网膜层以便接触不同类型的细胞。
- 这种方法对研究视网膜神经元之间的突触相互作用很有价值。
- 最初由Frank Werblin和Sam Wu的实验室开发。
研究目的
- 为电生理记录制备视网膜切片。
- 操纵突触释放并研究视网膜细胞之间的相互作用。
- 强调影响程序成功的关键细节。
使用的方法
- 斑蝾螈眼睛的解剖和视网膜的分离。
- 切割薄片视网膜以便在记录室中定位。
- 从光感受器和双极/水平细胞获得全细胞记录。
- 使用显微镜对视网膜切片进行聚焦成像。
主要结果
- 成功制备视网膜切片允许双重记录。
- 电生理记录提供了对突触处理的洞察。
- 该方法保留了完整的突触连接以供研究。
- 详细的程序步骤增强了重复性和成功率。
结论
- 视网膜切片制备是神经科学研究的有价值工具。
- 它促进了对视网膜突触相互作用的研究。
- 对准备过程中的细节关注对成功至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding synaptic signaling at the photoreceptor-to-second-order neuron synapse provides mechanistic insights into early visual processing, which can inform target validation for retinal disease therapies. This preparation enables direct interrogation of presynaptic release mechanisms and postsynaptic responses, supporting de-risking of targets involved in synaptic transmission. The ability to record from synaptically connected pairs enhances predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic ribbon function and glutamate release dynamics in photoreceptors.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets modulating presynaptic calcium currents and vesicle release.
- Scientific Value: Facilitates assessment of postsynaptic receptor responses in horizontal and bipolar cells.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Provides a reproducible platform for quantifying synaptic currents in response to controlled depolarization steps.
- Operational Value: Enables standardized measurement of excitatory and inhibitory postsynaptic currents in second-order neurons.
- Operational Value: Supports assay readiness for evaluating compounds that affect synaptic transmission kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains intact synaptic circuitry, allowing disease-relevant signaling studies in a vertebrate model.
- Translational Value: Enables comparison of wild-type and disease-model retinal function at the synapse.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular targets to electrophysiological outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing electrophysiological readouts that validate target modulation at the first retinal synapse, informing lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of presynaptic release mechanisms and postsynaptic receptor function.
- Screening: Delivers quantitative, real-time measurements of synaptic current amplitude and kinetics.
- Analytics: Enables comparison of input-output relationships and current-voltage profiles across cell types.
- Translational Research: Connects synaptic function to visual processing pathways relevant to retinal disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying synaptic interactions across multiple retinal cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides direct measurement of synaptic transmission, reducing ambiguity in mechanistic interpretations.
- Operational Value: Yields reproducible whole-cell recordings with stable seal formation and capacitance transient detection.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by confirming target effects on synaptic signaling fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on electrophysiological potency and selectivity.
Implementation Considerations
- Expertise in electrophysiology, patch clamp techniques, and retinal anatomy is required.
- Instrumentation includes a tissue slicer, upright fixed-stage microscope, and patch clamp amplifier with capacitance compensation.
- Standardization depends on consistent slice thickness (125 microns), perfusion rate, and solution composition.
- Adaptation to other species may require adjustments due to differences in retinal thickness and cell size.
- Success depends on precise micropipette placement and pressure control to achieve gigaohm seals without damaging cells.
