在两栖动物视网膜切片标本中对光感受器与二级神经元进行全细胞同步记录

本实验的总体目标是从水生虎纹蝾螈视网膜制备薄层组织切片，并用于同时对感光细胞以及二级水平细胞和双极细胞进行全细胞电压钳记录。该过程首先解剖蝾螈眼球，将视网膜分离并置于硝酸纤维素膜上；第二步是切割视网膜薄片，并将其放置于记录室中。

接下来，将记录室置于直立式固定载物台显微镜上，并将膜片钳电极置于视网膜切片上方。最后一步是从突触前的光感受器细胞以及突触后的水平细胞或双极细胞获取全细胞记录。最终，通过成对的全细胞记录技术可调控突触递质释放，并用于研究视网膜内细胞间的相互作用。

视网膜切片制备最初由 Frank Werblin 和 Sam Wu 的实验室开发。与单细胞制备不同，切片制备保留了细胞间完整的突触接触；而与视网膜全层制备不同，切片处理使视网膜各层暴露出来，便于接近所有不同类型的细胞。在视网膜中，切片制备可用于电生理记录，包括对多个细胞的同时记录以及成像实验。

这种制备方法已被证明对研究视网膜神经元之间的突触相互作用极为有价值。在本视频中，我们描述了使用虎纹蝾螈视网膜制备切片的方法，并强调了一些细微的操作要点，这些细节可能决定实验的成败。开始此操作前，先组装好记录室。

在记录室上放置两滴真空脂，两滴之间相距 8 到 10 毫米，以形成灌流液通道，并在每滴真空脂外侧几毫米处的第二滴真空脂中嵌入视网膜切片，作为堤坝以限制液体溢出。然后，在 chamber 的末端放置一小块三角形 Kim 擦纸，以确保液体与参比电极充分接触。随后，将一片硝酸纤维素膜紧贴在玻璃显微镜上压平。

在两个小珠状真空润滑脂上滑动。准备组织切片器。将双面剃须刀片折成四段。

然后将其中一个刀片安装到切片臂上。通过切割一片硝酸纤维素滤纸，确保剃刀刀片的刃口平整地贴合记录室。接下来，在显微镜下使用小型威尼斯剪刀，先通过断头法处死蝾螈，再剪除连接眼球与周围眼眶的皮肤。

然后将眼球向前牵拉，并将剪刀滑入其下方，剪断眼外肌和视神经。随后，将摘除的眼球置于油毡块上的棉垫上。现在用锋利的手术刀在角膜中央做一个小切口。

通过将精细的威尼斯剪刀插入切口并沿放射状向锯齿缘延伸切口来移除角膜。然后通过旋转油灰块或在切口之间旋转棉签，沿锯齿缘进行环形切割。完成眼球周围全周切割后，从眼球杯侧面拉出角膜和晶状体以将其移除。

将剩余的眼杯转移至用两栖类生理盐水润湿的油毡块硬质表面上。使用锋利的剃刀刀片以精细的锯切动作将其切成三等份，确保完全切穿巩膜。然后将一至两片IUP放置于硝酸纤维素膜上，使视网膜面朝下。

将剩余的组织块浸入额外的生理盐水中，随后置于冰箱中，以备后续可能需要切割更多切片。接着，用一对精细镊子轻轻将IUP组织块按压在硝酸纤维素膜上。

用数滴冷的两栖类生理盐水浸没硝酸纤维素膜和IUP片段。然后用Kimwipe纸巾轻触硝酸纤维素膜和IUP的边缘，吸去多余的生理盐水溶液。随后，将IUP浸入含有数滴冷的两栖类生理盐水溶液的硝酸纤维素膜中。

再次随后剥离巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮以分离视网膜。如果视网膜未紧密贴附，可用无尘纸巾吸除生理盐水。为了使视网膜更牢固地贴附于硝酸纤维素膜上，可更换生理盐水并根据需要重复操作步骤。

接着，用冷的两栖类生理盐水填充室腔，将其转移至组织切片机的载物台上。然后通过轻轻但稳固地压下剃刀刀片，将视网膜和硝酸纤维素膜切成125微米厚的条状。

将整个视网膜切成片后，逐片转移至记录室的主通道中。转移切片时，固定膜条位置，同时将记录室从其下方滑入。当切片位于记录室中央区域上方时，务必保持其完全浸没在液体中。

将硝酸纤维素膜的边缘嵌入真空脂条中，并将其旋转90度。为了观察视网膜各层结构，需将硝酸纤维素膜平整地压在玻璃表面，即使某些区域没有视网膜组织。以约毫米为间隔放置硝酸纤维素膜条，有助于打破表面张力，从而改善液体流动。

继续逐个转移切片，直至所有切片沿灌流通道全长放置完毕。所有切片转移完成后，将记录室移至直立式固定载物台显微镜的载物台上。将参考电极导线连接至放大器头部支架的接地线上。

使用长工作距离的水浸物镜（40至60倍）对切片进行聚焦。随后，在以每分钟一毫米的速度融合切片的同时，用经氧气鼓泡的两栖类生理盐水处理。

将吸力管连接到灌注室的出口管路。然后通过旋转吸力针的斜面末端，或通过调节灌注室末端棉签与流出针尖开口之间的距离，来调整流出量以平衡流入量。在弱光或红外光下观察脑片。

接下来，选择一对细胞，即一个感光细胞和邻近的水平细胞或双极细胞，用于全细胞记录。将实验前用细胞内液灌注好的Philip记录电极安装到电极夹持器上。然后，略微升高显微镜物镜。

将光感受器移液管置于物镜下方，然后降低移液管，使其尖端位于脑片上方稍高位置，同时调整焦距。注意避免下降过度。

使用第二支移液管重复此步骤。接着，通过施加 5 至 10 毫伏的去极化脉冲检查移液管的电阻。调节放大器上基线电流水平的任何偏移。

随后，施加轻微的正压，同时将突触后移液管定位，使其接触水平细胞或双极细胞的胞体。然后将突触前移液管定位，使其接触视杆细胞或视锥细胞的胞体。在监测电阻释放的同时，对突触后移液管保持正压，有时释放正压即可形成吉欧姆（giga ohm）密封。

当尖端电阻增加至超过100兆欧时，施加-60毫伏的保持电位。然后在形成吉欧封接后，消除移液管电容瞬变。利用膜片钳放大器的电容补偿电路，用光感受器移液管重复封接操作，施加-70毫伏的保持电位，并消除移液管电容。

短暂停留后，通过向每个细胞施加负压使膜片破裂。膜片破裂的标志是出现全细胞电容瞬变。现在，通过施加光刺激并施加一系列从 -120 到 +40 毫伏、以 20 毫伏为增量的电压阶跃，从生理学上确认突触后细胞的身份。

为了评估细胞之间是否存在突触连接，对感光细胞施加持续25至100毫秒、幅度为60毫伏的阶跃去极化刺激，并观察第二级神经元中是否出现突触后电流。以下是蝾螈视网膜垂直切片中神经元光反应的代表性记录 trace。

视锥水平细胞和关型双极细胞在光照开始时均表现出外向电流。此处水平细胞和双极细胞记录中光刺激后出现的显著内向电流，是由于光刺激结束时感光细胞去极化，导致谷氨酸释放增加所致。开型双极细胞在光照开始时产生内向电流，这是由于代谢型谷氨酸受体信号通路引发的信号极性反转，以及trpm1通道的激活所致。

水平细胞和双极细胞可以通过它们的电流-电压关系相互区分。水平细胞通常具有线性或内向整流型的电流-电压关系，其输入电阻小于500兆欧；而双极细胞具有外向整流型的电流-电压关系，输入电阻较高，介于0.5至2吉欧之间。该图显示了视锥-水平细胞对和视锥-离型双极细胞对记录的代表性结果。

在每种情况下，将视锥细胞从 -70 毫伏的保持电位去极化至 -10 毫伏，可诱发视锥细胞中的电压门控钙电流，以及水平细胞或双极细胞中的快速内向突触后电流。视网膜切片制备已被用于数百项关于视网膜解剖学与生理学的研究中。

它们在同时检测多个细胞的反应方面具有显著优势，因为能够实现对多个细胞的同步记录和成像。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离视网膜、制备薄层视网膜切片、将切片放置于记录室中，并从成对的突触连接细胞中获得全细胞记录。