Name: 同时光感受器和二阶神经元在两栖类动物的视网膜切片制备全细胞记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学习制备虎纹钝口螈视网膜切片技术，用于光感受器与水平细胞、双极细胞的全细胞电压钳记录。该方法保留完整突触连接，便于研究视网膜神经元间的突触相互作用与信号处理机制。

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本工作由“预防失明研究”组织和美国国立卫生研究院资助项目EY10542支持。

1. 视网膜切片制备
<ol>
 <li>组装记录室（设计如图1所示）。在记录室上间隔约8–10 mm放置两条真空脂，形成用于灌流液流动并嵌入视网膜切片的通道。在上述每条真空脂外侧数毫米处再添加一条真空脂，作为堤坝以防止液体溢出。在记录室末端放置一小块三角形KimWipe，以确保灌流液与参比电极接触。</li>
 <li>将一片硝酸纤维素膜（约5 × 10 mm，孔径0.8 μm）压平贴附于载玻片上的两小段真空脂上。避免在硝酸纤维素膜中心正下方涂抹真空脂，以免影响视网膜的贴附。</li>
 <li>准备组织切片机时，将双刃剃须刀片折成四段，并将其中一段固定在切片臂上。用其裁切一小段硝酸纤维素膜，以确保刀片刃口能平整贴合记录室表面，从而干净地切过硝酸纤维素膜。</li>
 <li>在解剖操作台处准备一小烧杯两栖类生理盐水溶液（表1），并置于冰上冷却。</li>
 <li>通过断头法处死蝾螈。沿矢状面将头部切为两半，并用探针破坏脊髓。将半边头部置于浸有两栖类生理盐水的棉垫上，放置于油毡板上。另一半头部可用湿润纸巾包裹，于4 °C保存，供当日后续使用。</li>
 <li>摘除眼球。使用小型Vannas剪刀剪开眼球与周围眼眶之间的皮肤组织。在松解眼球前部周围组织后，向前牵拉眼球，并将剪刀滑至眼球下方，剪断眼外肌和视神经，使眼球完全脱离眼眶。</li>
 <li>将摘除的眼球置于油毡板上的棉垫上。丢弃已使用过的半边头部。修剪眼球后部多余的眶内脂肪组织。</li>
 <li>用锋利的手术刀片在角膜中央做一小切口。将精细Vannas剪刀插入切口，沿径向向外剪至锯齿缘。通过旋转油毡板或棉垫，在每次剪切之间完成围绕锯齿缘的环形切割。</li>
 <li>绕眼球完整切割一周后，将角膜和晶状体从眼杯侧方取出。将所得眼杯移至油毡板上湿润的硬质表面，用锋利剃须刀片将其切成三等份，采用轻柔的锯切动作，确保完全切透巩膜。</li>
 <li>将一至两块眼杯组织置于硝酸纤维素膜上，视网膜面朝下。将剩余眼杯组织浸入额外生理盐水中，并置于约4 °C冰箱中保存。</li>
 <li>用精细镊子轻轻将眼杯组织压向硝酸纤维素膜。滴加数滴冷的两栖类生理盐水浸没硝酸纤维素膜及眼杯组织，再用KimWipe轻吸边缘，以促进视网膜贴附。再次滴加数滴冷的两栖类生理盐水，然后剥离巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮层，以分离出视网膜（由于未漂白的视紫红质存在，视网膜可能呈粉红色）。如有必要，剪断视神经以完全游离视网膜。</li>
 <li>若视网膜未牢固贴附，可用KimWipe吸除生理盐水，使视网膜更紧密地压向硝酸纤维素膜。随后补充生理盐水。必要时可重复此步骤。</li>
 <li>向记录室中注入冷的两栖类生理盐水，并将其转移至组织切片机载物台上。从一端至另一端将视网膜与硝酸纤维素膜切成薄条，通过每次旋转游标千分尺125 μm进行进刀。将剃须刀片轻柔但稳固地压过视网膜和硝酸纤维素膜。</li>
 <li>通过移动硝酸纤维素膜条带，将视网膜切片转移至记录室的主通道中。提起一条膜带，固定其位置，同时移动记录室至其下方，注意始终保持切片浸没于液体中。将硝酸纤维素膜边缘嵌入真空脂条中，并将其旋转90度，以便观察视网膜各层结构。</li>
 <li>将硝酸纤维素膜平整压紧于玻璃表面。即使某些区域无视网膜组织，也应沿灌流通道全长以约1 mm间隔规律放置硝酸纤维素膜条，以破坏表面张力，改善液体流动。</li>
</ol>
2. 配对全细胞记录
<ol>
 <li>转移完所有切片后，将记录室移至直立式固定台显微镜的载物台上，并连接参考电极导线。使用长工作距离、水浸式、40–60倍物镜对切片进行聚焦。显微镜应放置在气浮台上以减少振动，并置于法拉第笼内以降低电干扰。</li>
 <li>以1 ml/min的流速持续灌流切片，灌流液为用100% O2饱和的两栖类生理盐水溶液。连接吸出装置，确保流入与流出平衡。可通过旋转吸管斜面末端，或调节腔室出口处KimWipe与出液针之间的距离来控制流出量。实验装置可保持在室温，也可通过帕尔贴装置降温，或直接在显微镜载物台上放置冰袋进行冷却。</li>
 <li>在弱光或红外光下观察切片，选择一对细胞——一个感光细胞（视杆或视锥细胞）及其附近的水平细胞或双极细胞——作为全细胞记录的目标。视杆细胞可通过其较大的胞体和明显的杆状外段来识别（图2A）。视锥细胞比视杆细胞小，外段较短且呈锥形。双极细胞和水平细胞的胞体位于内核层（INL）最外侧的一排（图2B 和 图2C）。</li>
 <li>在制备切片前，使用拉管仪从硼硅酸盐玻璃（外径1.2 mm，内径0.95 mm，带玻璃丝）中拉制微电极。每个微电极尖端直径应约为1–2微米。</li>
 <li>使用非金属填充针（例如由1 ml注射器或MicroFil制成的针），将细胞内液（表1）注入电极，并将其连接至电极夹持器。</li>
 <li>轻微抬升显微镜物镜。将感光细胞电极置于物镜下方，然后降低电极，使尖端刚好位于切片上方。对第二个电极重复此操作。</li>
 <li>在放大器上调节基线电流水平的任何偏移。使用5–10 mV去极化脉冲检测电极电阻。我们通常使用的电极电阻范围为10–15 MΩ，这是由于电极杆部具有较长的锥度以及两栖类电极溶液的低渗透压所致。使用较高渗透压的哺乳类溶液时，相同电极的电阻值约为8–12 MΩ。尽管我们在两栖类溶液中曾使用过电阻为3–4 MΩ、尖端直径更大的电极，但较低的接入电阻所带来的优势会被其在细胞膜上形成封接的难度增加，以及钙电流和其他第二信使敏感反应的快速衰减所抵消。</li>
 <li>在施加轻微正压的同时，将突触后电极定位至接触水平细胞或双极细胞的胞体。然后将突触前电极定位至接触视杆或视锥感光细胞的胞体。记录稳定性更高时，电极尖端接触的是内段而非胞体，尤其是在视锥细胞中。</li>
 <li>在监测电阻的同时，释放突触后电极上的正压。有时仅释放正压就足以形成吉欧姆级封接。若未形成，则使用1 ml注射器或口吸施加轻柔负压。当尖端电阻升至&gt;100 MΩ时，施加-60 mV的保持电位。获得吉欧姆级封接后，消除电极电容瞬变，并对感光细胞电极重复封接程序，施加-70 mV的保持电位。</li>
 <li>通过口吸或注射器对每个细胞依次施加负压以破裂膜片。视杆细胞、视锥细胞和双极细胞通常在轻柔负压下即可破裂。水平细胞达到全细胞构型可能需要更强的负压（即使用3 ml注射器），并结合膜片钳放大器“zap”功能提供的强而快速的电压脉冲。膜破裂并建立全细胞构型的标志是出现全细胞电容瞬变。</li>
 <li>通过施加光刺激并施加一系列从-120 mV到+40 mV、以20 mV为增量的电压阶跃，从生理学角度确认突触后细胞的身份（图3 和 图4）。</li>
 <li>为评估这对细胞是否存在突触连接，向感光细胞施加短暂（25–100毫秒）、60 mV的去极化阶跃（至-10 mV，接近L型电压门控钙电流峰值），并在第二级神经元中观察是否存在突触后电流（图5）。较强的去极化阶跃应会引发突触后水平细胞或OFF型双极细胞中快速、瞬时的内向突触后电流，这是由视锥细胞大量囊泡释放所引起的（图5）。</li>
</ol>

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<li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

视网膜切片制备已被证明在分析视网膜处理视觉信息所采用的神经环路和机制方面非常有用。能够同时从突触前和突触后神经元获得全细胞记录，在这一研究中尤为关键。与平铺视网膜制备相比，通过切片更容易实现成对全细胞记录，因为切片使视网膜的不同层次得以暴露。此外，由于蝾螈的视网膜神经元较大，长期以来一直被用作视网膜研究的模型，因此提供了一个特征明确且高度表征的模型系统。
通过练习，可以常规制备出健康的蝾螈视网膜切片。以下几个关键步骤决定了实验的成败：1）确保剃刀刀片安装在组织切片器上时，能平整地贴合玻璃表面，并干净地切开组织及下方的硝酸纤维素膜。若刀片已将硝酸纤维素膜完全切开，当刀片接触载玻片表面时，应能听到轻微的“咔哒”声。2）确保视网膜已牢固黏附于硝酸纤维素膜上，否则在操作的任何步骤中，视网膜都可能从膜上漂离。3）切勿将切好的切片暴露于空气中，因为这会损伤大量表层细胞。4）确保切片和硝酸纤维素膜平整地贴附在载玻片上，以便在解剖显微镜下清晰观察到视网膜各层结构。5）调节灌流液的流入与流出速度，保持平衡，避免记录室溢出。这可防止溶液液面突然变化，从而避免引起组织的突然移动。6）选择一对彼此靠近且状态良好的细胞。胞质光滑的细胞比胞质呈颗粒状的细胞更健康。位于切片较深层的细胞更有可能保持完整的突触连接。7）确保移液管尖端在下降至细胞过程中未发生断裂或触碰到其他组织或碎屑。8）检查移液管的电阻，确保其未被碎屑或气泡堵塞，因为这些因素均会影响获得高质量全细胞记录的能力。
一些研究者并不将视网膜附着在硝酸纤维素滤纸上，而是将其包埋在琼脂块中，使用振动切片机（vibratome）制备视网膜切片。尽管我们尚未尝试这种方法，Kim et al.11 已对两种方法的优劣进行了讨论。根据他们的经验，基于琼脂的方法能够更稳定地获得视网膜层次清晰的平整切片，而基于滤纸的方法则能获得活性更高的感光细胞。
视杆细胞和视锥细胞负责将光转化为膜电位的变化。通过成对记录，可以直接操控视杆细胞或视锥细胞的膜电位，因此，尽管产生光反应的能力有助于鉴定细胞类型，但可能并非必需。因此，我们通常在白光下制备视网膜切片。然而，即使在强光照明下制备，蝾螈视网膜神经元仍可产生显著的光反应，如图3所示。这部分归因于其较大的外节体积中含有相对丰富的发色团储备，也可能反映了穆勒细胞为视锥细胞再生11-顺式视黄醛的能力12。为了获得完全暗适应的光反应，可以在红外照明下制备切片。在红外光下进行解剖时，我们将第三代图像增强器（GenIII image intensifiers，Nitemate NAV3，Litton Industries，Tempe，AZ）连接至解剖显微镜的目镜，并使用红外LED手电筒照射组织。对于不在解剖显微镜下进行的切片及其他操作，我们采用头戴式图像增强器。在放置膜片钳电极时，我们使用安装在直立式固定载物台显微镜上的红外敏感CCD相机（例如 Watec 502H，Watec Inc.，Middletown，NY）来观察切片。采取这些预防措施后，可以获得表现出单光子敏感性的视杆细胞反应6, 13。
在视网膜切片中工作的一个局限性是，大视野视网膜神经元的长细胞突起可能在切片过程中丢失大量树突。因此，视网膜切片制备更适用于研究那些突触连接集中在胞体附近突起的细胞的生理特性。两栖类和哺乳类视网膜具有许多相同的细胞类型，并采用相似的生理机制14-16。尽管蝾螈视网膜在许多方面是哺乳类视网膜的良好模型，但一个重要差异在于哺乳类存在专门的视杆细胞通路，该通路涉及特化的视杆双极细胞与AII无长突细胞之间的连接14。蝾螈视网膜的另一个局限性是针对该物种开发的遗传工具数量较少。然而，针对其他物种中高度保守区域设计的抗体和shRNA试剂可在蝾螈中成功应用，许多小分子抑制剂和肽类试剂也可通用。此外，通过在技术上稍作修改，还可从其他一些工具更易获得的物种中制备视网膜切片。
除了适用于成对全细胞记录外，蝾螈视网膜切片制备还可用于多种其他研究方法。如上所述，视网膜切片可结合多种电压钳制方案用于研究光反应17视网膜神经元也可加载对Ca²⁺敏感的荧光染料2+，Cl⁻-，或 Na+ 通过膜片电极引入或浴式给药15,18-20一种可结合突触带的荧光肽21 可通过膜片移液管引入，并用于成像视网膜突触小带10 或者，当与荧光素偶联时，可急性且选择性地损伤突触带22我们还结合使用视网膜切片和量子点来监测视杆细胞和视锥细胞突触终末处单个钙通道的运动。23因此，视网膜垂直切片是一种多功能的实验制备方法，可用于研究视觉信号通路中第一突触处的基本突触机制及其独特的信息处理功能。

<table><tbody><tr><td>组织切片器</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>AAWP 型，孔径 0.8 mm</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃移液管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>外径 1.2 mm，内径 0.95 mm</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 小球电极</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>34 号填充针头，长 67 mm</td></tr></tbody></table>

在两栖动物视网膜切片标本中对光感受器与二级神经元进行全细胞同步记录

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

视网膜神经科学的核心任务之一是理解视网膜神经元的神经环路，以及这些连接如何调控传递至大脑的信号。视网膜中的视杆细胞和视锥细胞可捕获光子，并将光能转化为电信号，传递给其他视网膜神经元，在此经过加工处理后，通过视神经将信息传送到大脑的中枢靶区。关于视网膜环路和视觉信息处理的重要早期认识，源于 Cajal1,2 的组织学研究，随后则来自对视网膜神经节细胞——即视网膜的输出神经元——放电活动的电生理记录3,4。
要深入理解视网膜中的视觉信息处理过程，必须了解从光感受器到视网膜神经节细胞通路中每一步的信号传递机制。然而，许多视网膜细胞类型深埋于组织内部，因此相对难以进行电生理记录。这一局限性可通过使用垂直切片技术加以克服，在垂直切片中，位于视网膜各层内的细胞清晰可见，且便于进行电生理记录。
本文介绍一种制作幼年虎斑蝾螈（Ambystoma tigrinum）视网膜垂直切片的方法。尽管该制备最初是为尖锐微电极记录而开发的5,6，我们在此描述一种用于光感受器与二级水平细胞及双极细胞的双全细胞电压钳记录方法，其中在操控光感受器膜电位的同时，同步记录水平细胞或双极细胞中的突触后反应。虎斑蝾螈的光感受器明显大于哺乳动物物种，使其成为实施这一技术上具有挑战性的实验方法的理想制备模型。这些实验旨在探究突触带（synaptic ribbon）的信号传递特性——这是一种仅存在于少数神经元（包括视杆细胞和视锥细胞光感受器）中的特化突触结构，非常适合维持高频率的紧张性神经递质释放7,8——并阐明其如何贡献于视网膜第一突触的独特信号传递特性。

美西螈视网膜垂直切片中神经元对光反应的代表性记录 trace 如下所示 图3视锥细胞、水平细胞和OFF型双极细胞在光照开始时均表现出外向电流。在水平细胞和双极细胞的记录中，光刺激后出现的显著内向电流，是由于光照终止时感光细胞去极化，导致谷氨酸释放增加所致。ON型双极细胞在光照开始时产生内向电流，这是由信号反转的代谢型谷氨酸受体信号通路介导，并通过TRPM1通道的激活实现的。9水平细胞和双极细胞可通过其 I-V 关系（图4。水平细胞通常具有线性或向内整流的特性 I-V 且输入电阻低（&lt;500 MΩ 图 4A而双极细胞具有较高的输入电阻（0.5–2 GΩ）和外向整流特性 I--V (图4B). 图5 显示一对视锥细胞-水平细胞记录的代表性结果（图 5A）以及视锥-OFF双极细胞对（图5B）。在每种情况下，将视锥细胞从 -70 mV 的钳制电位去极化至 -10 mV，可引发视锥细胞中的电压门控钙电流，并在水平细胞或双极细胞中诱发快速内向兴奋性突触后电流（EPSC）。这种强刺激足以使每个突触带的可立即释放囊泡池（约20个囊泡）完全释放，从而产生约47 pA/突触带的EPSC。10水平细胞EPSC在 图5A 为232 pA，提示其接收到来自前突触视锥细胞的5个带状突触联系。根据离型双极细胞中178 pA的EPSC得出的类似估算（图5B）表明其接收到来自突触前视锥细胞的4个带状突触接触。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>两栖类生理盐水</td>
 <td>突触前电极内液</td>
 <td>突触后电极内液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>116 mM</td>
 <td>3.5 mM</td>
 <td>3.5 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>2.5 mM</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2</td>
 <td>1.8 mM</td>
 <td>1 mM</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>0.5 mM</td>
 <td>1 mM</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10 mM</td>
 <td>10 mM</td>
 <td>10 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>葡萄糖</td>
 <td>5 mM</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cs-glutamate*</td>
 <td> </td>
 <td>40 mM</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cs-gluconate**</td>
 <td> </td>
 <td>50 mM</td>
 <td>90 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>四乙基氯化铵</td>
 <td> </td>
 <td>10 mM</td>
 <td>10 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP-Mg</td>
 <td> </td>
 <td>9 mM</td>
 <td>9 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td> </td>
 <td>0.5 mM</td>
 <td>0.5 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td> </td>
 <td>5 mM</td>
 <td>5 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH***</td>
 <td>7.8</td>
 <td>7.2</td>
 <td>7.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>渗透压****</td>
 <td>245 mOsm</td>
 <td>240 mOsm</td>
 <td>240 mOSM</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
*Cs-谷氨酸盐通过在移液管溶液中用40 mM CsOH中和40 mM L-谷氨酸制备。** Cs-葡糖酸盐母液（1 M）通过用45–50% D-葡糖酸中和CsOH溶液制备。***细胞外溶液的pH应使用NaOH调节，移液管溶液的pH应使用CsOH调节。****保持移液管溶液的渗透压略低于细胞外溶液，可防止细胞肿胀并延长记录的持续时间。
表1. 本实验方案中使用的标准细胞内液和细胞外液的成分与参数。
<img alt="视网膜电生理记录室示意图，包含俯视图、侧视图和剖面图；显示电极设置。" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 记录室设计。 (A-C) 记录室的俯视图、侧视图和剖面图，显示其尺寸。该记录室由一块 2 mm 厚的丙烯酸材料加工而成。 (D) 组装好的记录室。灌流液通过一段 10 cm 长的聚四氟乙烯（Teflon）管（进液管；型号 24LW）进入记录室。在记录室的另一侧，通过对接一个斜面的 20 号金属管施加轻微负压，以排出灌流液。在此出液管旁边是一个 Ag/AgCl 小球参比电极。该参比电极的导线连接至前置放大器的参考输入端。在参比电极上方放置一小块三角形 KimWipe 滤纸，以保持其与溶液接触，并调节液体流入出液管的流速。记录室的底部由一块置于腔体凹槽边缘内的玻璃显微镜载玻片构成。载玻片用一圈真空脂固定。带有视网膜切片的硝酸纤维素膜条嵌入真空脂中，形成供溶液流动的通道。在制备切片前，先用两小滴真空脂将一块 5 × 10 mm 的硝酸纤维素膜固定在记录室内。将一个眼杯组织置于硝酸纤维素膜上，神经节细胞层朝下，待视网膜黏附后将其移除。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="视网膜神经元连接示意图、突触标记、神经科学研究显微图像。" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 垂直切片制备中染料填充的细胞对。 A) 通过全细胞记录期间经膜片钳电极引入不同荧光染料标记的视杆细胞及其突触偶联的水平细胞图像。视杆细胞的电极液中包含 Lucifer yellow（2 mg/ml，黄色），水平细胞的电极液中包含 sulfarhodamine B（1 mg/ml，紫色）。荧光图像使用配备冷却 CCD 相机（Orca ER）的转盘共聚焦显微镜（Perkin Elmer Ultraview LCI）采集，并安装在固定载物台显微镜（Nikon E600 FN，60X，1.0 NA 水浸物镜）上。这些荧光图像通过 Adobe Photoshop 与相应视网膜切片的明场图像叠加。 B) 视锥细胞及其突触偶联的 OFF 型双极细胞图像。该双极细胞的轴突终末分支位于内丛状层最外层（S1 亚层），靠近内核层边界。 C) 视锥细胞及其突触偶联的水平细胞图像。注意，视锥细胞终末明显大于视杆细胞的轴突终末。尽管水平细胞可通过其椭圆形的胞体形态进行识别，但在记录前，内核层（INL）中的 ON 型和 OFF 型双极细胞的胞体难以区分。然而，可靶向那些由视锥细胞驱动且胞体位于外核层（ONL）的移位型 OFF 双极细胞，这类细胞可通过缺乏内节和外节的结构与视锥细胞相区分。比例尺为 20 μm。
<img alt="膜片钳记录的电生理信号，20-100 pA，视锥细胞，水平细胞，双极细胞，电流反应，实验图谱。" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 在电压钳制条件下记录的四种不同类型视网膜神经元对持续500毫秒的强白光刺激所诱发的电流反应。 视锥细胞(A)、水平细胞(B)和off型双极细胞(C)均对光刺激产生外向电流反应。(D) on型双极细胞则对相同的光刺激产生内向电流反应。off型双极细胞(C)所表现出的基础噪声反映了在暗处突触囊泡持续释放的现象，当感光细胞在光照下发生超极化时，这种释放减少。这四种细胞的反应分别在白光下制备的视网膜切片中通过独立记录获得。本示例中使用的白光刺激强度，在水平细胞和双极细胞中引发的反应相当于580 nm波长的光子通量为1 × 105 光子/秒/μm2。
<img alt="电压钳实验；离子通道电流；显示水平细胞和Off双极细胞反应的图表；电生理学。" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 水平细胞与Off双极细胞的电流-电压（I-V）关系。 (A) 上图，对水平细胞施加一系列从 -120 mV 到 +40 mV、以 20 mV 为增量的 150 毫秒电压阶跃所诱发的膜电流（下图）。水平细胞通常具有较低的输入电阻，其 I-V 关系呈线性或向内整流特性。 (B) Off双极细胞在一系列电压阶跃刺激下的 I-V 关系。双极细胞具有较高的输入电阻，并因电压门控钾电流的激活而表现出向外整流的 I-V 特性。
<img alt="电生理实验中视锥细胞Ica和PSC电流迹线；显示Vm变化和电压阶跃。" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 配对记录数据示例。 (A) 在保持电位为 -70 mV 时，对视锥细胞施加 100 毫秒、至 -10 mV 的电压阶跃，记录其电压门控钙电流（Cone ICa）（Cone Vm）。使用 P/8 泄漏减法程序扣除漏电流和电容瞬变。同时从水平细胞记录到快速兴奋性突触后电流（EPSC；HC PSC），表明这两个细胞之间存在突触连接。(B) 在另一视锥细胞施加相同刺激时，记录到离型双极细胞中的兴奋性突触后电流（EPSC）。

我们描述了从水生虎纹蝾螈（Ambystoma tigrinum）制备视网膜薄片的方法，并解释了如何通过从感光细胞以及二级水平细胞和双极细胞获得双全细胞电压钳记录，来研究视网膜中的突触信息处理过程。

视网膜神经科学的核心任务之一是理解视网膜神经元的神经环路，以及这些连接如何通过其结构特征影响……

本实验的总体目标是从水生虎纹蝾螈视网膜制备薄层组织切片，并用于同时对感光细胞以及二级水平细胞和双极细胞进行全细胞电压钳记录。该过程首先解剖蝾螈眼球，将视网膜分离并置于硝酸纤维素膜上；第二步是切割视网膜薄片，并将其放置于记录室中。接下来，将记录室置于直立式固定载物台显微镜上，并将膜片钳电极置于视网膜切片上方。最后一步是从突触前的光感受器细胞以及突触后的水平细胞或双极细胞获取全细胞记录。最终，通过成对的全细胞记录技术可调控突触递质释放，并用于研究视网膜内细胞间的相互作用。视网膜切片制备最初由 Frank Werblin 和 Sam Wu 的实验室开发。与单细胞制备不同，切片制备保留了细胞间完整的突触接触；而与视网膜全层制备不同，切片处理使视网膜各层暴露出来，便于接近所有不同类型的细胞。在视网膜中，切片制备可用于电生理记录，包括对多个细胞的同时记录以及成像实验。这种制备方法已被证明对研究视网膜神经元之间的突触相互作用极为有价值。在本视频中，我们描述了使用虎纹蝾螈视网膜制备切片的方法，并强调了一些细微的操作要点，这些细节可能决定实验的成败。开始此操作前，先组装好记录室。在记录室上放置两滴真空脂，两滴之间相距 8 到 10 毫米，以形成灌流液通道，并在每滴真空脂外侧几毫米处的第二滴真空脂中嵌入视网膜切片，作为堤坝以限制液体溢出。然后，在 chamber 的末端放置一小块三角形 Kim 擦纸，以确保液体与参比电极充分接触。随后，将一片硝酸纤维素膜紧贴在玻璃显微镜上压平。在两个小珠状真空润滑脂上滑动。准备组织切片器。将双面剃须刀片折成四段。然后将其中一个刀片安装到切片臂上。通过切割一片硝酸纤维素滤纸，确保剃刀刀片的刃口平整地贴合记录室。接下来，在显微镜下使用小型威尼斯剪刀，先通过断头法处死蝾螈，再剪除连接眼球与周围眼眶的皮肤。然后将眼球向前牵拉，并将剪刀滑入其下方，剪断眼外肌和视神经。随后，将摘除的眼球置于油毡块上的棉垫上。现在用锋利的手术刀在角膜中央做一个小切口。通过将精细的威尼斯剪刀插入切口并沿放射状向锯齿缘延伸切口来移除角膜。然后通过旋转油灰块或在切口之间旋转棉签，沿锯齿缘进行环形切割。完成眼球周围全周切割后，从眼球杯侧面拉出角膜和晶状体以将其移除。将剩余的眼杯转移至用两栖类生理盐水润湿的油毡块硬质表面上。使用锋利的剃刀刀片以精细的锯切动作将其切成三等份，确保完全切穿巩膜。然后将一至两片IUP放置于硝酸纤维素膜上，使视网膜面朝下。将剩余的组织块浸入额外的生理盐水中，随后置于冰箱中，以备后续可能需要切割更多切片。接着，用一对精细镊子轻轻将IUP组织块按压在硝酸纤维素膜上。用数滴冷的两栖类生理盐水浸没硝酸纤维素膜和IUP片段。然后用Kimwipe纸巾轻触硝酸纤维素膜和IUP的边缘，吸去多余的生理盐水溶液。随后，将IUP浸入含有数滴冷的两栖类生理盐水溶液的硝酸纤维素膜中。再次随后剥离巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮以分离视网膜。如果视网膜未紧密贴附，可用无尘纸巾吸除生理盐水。为了使视网膜更牢固地贴附于硝酸纤维素膜上，可更换生理盐水并根据需要重复操作步骤。接着，用冷的两栖类生理盐水填充室腔，将其转移至组织切片机的载物台上。然后通过轻轻但稳固地压下剃刀刀片，将视网膜和硝酸纤维素膜切成125微米厚的条状。将整个视网膜切成片后，逐片转移至记录室的主通道中。转移切片时，固定膜条位置，同时将记录室从其下方滑入。当切片位于记录室中央区域上方时，务必保持其完全浸没在液体中。将硝酸纤维素膜的边缘嵌入真空脂条中，并将其旋转90度。为了观察视网膜各层结构，需将硝酸纤维素膜平整地压在玻璃表面，即使某些区域没有视网膜组织。以约毫米为间隔放置硝酸纤维素膜条，有助于打破表面张力，从而改善液体流动。继续逐个转移切片，直至所有切片沿灌流通道全长放置完毕。所有切片转移完成后，将记录室移至直立式固定载物台显微镜的载物台上。将参考电极导线连接至放大器头部支架的接地线上。使用长工作距离的水浸物镜（40至60倍）对切片进行聚焦。随后，在以每分钟一毫米的速度融合切片的同时，用经氧气鼓泡的两栖类生理盐水处理。将吸力管连接到灌注室的出口管路。然后通过旋转吸力针的斜面末端，或通过调节灌注室末端棉签与流出针尖开口之间的距离，来调整流出量以平衡流入量。在弱光或红外光下观察脑片。接下来，选择一对细胞，即一个感光细胞和邻近的水平细胞或双极细胞，用于全细胞记录。将实验前用细胞内液灌注好的Philip记录电极安装到电极夹持器上。然后，略微升高显微镜物镜。将光感受器移液管置于物镜下方，然后降低移液管，使其尖端位于脑片上方稍高位置，同时调整焦距。注意避免下降过度。使用第二支移液管重复此步骤。接着，通过施加 5 至 10 毫伏的去极化脉冲检查移液管的电阻。调节放大器上基线电流水平的任何偏移。随后，施加轻微的正压，同时将突触后移液管定位，使其接触水平细胞或双极细胞的胞体。然后将突触前移液管定位，使其接触视杆细胞或视锥细胞的胞体。在监测电阻释放的同时，对突触后移液管保持正压，有时释放正压即可形成吉欧姆（giga ohm）密封。当尖端电阻增加至超过100兆欧时，施加-60毫伏的保持电位。然后在形成吉欧封接后，消除移液管电容瞬变。利用膜片钳放大器的电容补偿电路，用光感受器移液管重复封接操作，施加-70毫伏的保持电位，并消除移液管电容。短暂停留后，通过向每个细胞施加负压使膜片破裂。膜片破裂的标志是出现全细胞电容瞬变。现在，通过施加光刺激并施加一系列从 -120 到 +40 毫伏、以 20 毫伏为增量的电压阶跃，从生理学上确认突触后细胞的身份。为了评估细胞之间是否存在突触连接，对感光细胞施加持续25至100毫秒、幅度为60毫伏的阶跃去极化刺激，并观察第二级神经元中是否出现突触后电流。以下是蝾螈视网膜垂直切片中神经元光反应的代表性记录 trace。视锥水平细胞和关型双极细胞在光照开始时均表现出外向电流。此处水平细胞和双极细胞记录中光刺激后出现的显著内向电流，是由于光刺激结束时感光细胞去极化，导致谷氨酸释放增加所致。开型双极细胞在光照开始时产生内向电流，这是由于代谢型谷氨酸受体信号通路引发的信号极性反转，以及trpm1通道的激活所致。水平细胞和双极细胞可以通过它们的电流-电压关系相互区分。水平细胞通常具有线性或内向整流型的电流-电压关系，其输入电阻小于500兆欧；而双极细胞具有外向整流型的电流-电压关系，输入电阻较高，介于0.5至2吉欧之间。该图显示了视锥-水平细胞对和视锥-离型双极细胞对记录的代表性结果。在每种情况下，将视锥细胞从 -70 毫伏的保持电位去极化至 -10 毫伏，可诱发视锥细胞中的电压门控钙电流，以及水平细胞或双极细胞中的快速内向突触后电流。视网膜切片制备已被用于数百项关于视网膜解剖学与生理学的研究中。它们在同时检测多个细胞的反应方面具有显著优势，因为能够实现对多个细胞的同步记录和成像。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离视网膜、制备薄层视网膜切片、将切片放置于记录室中，并从成对的突触连接细胞中获得全细胞记录。

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