LeafJ：一款用于半自动叶形测量的 ImageJ 插件
2013年1月21日
展示用于高通量叶片测量的关键方法。这些方法可用于加速对大量植物突变体的研究，或基于叶片表型对植物进行筛选时的表型分析。
本实验的目的是实现叶片形态测量的自动化，以适用于高通量实验。首先通过解剖叶片并使用平板扫描仪对其进行成像来完成。实验的第二步是使用 Leaf J 插件来识别并测量叶片。
第三步是制备叶片以进行显微观察，并使用复式显微镜对叶片进行拍照。最后一步是使用触控平板在所获得的图像上描记细胞轮廓线。最终，通过这一图像分析组合方法，结果可以展示叶片形态、细胞大小和细胞数量的差异。
与现有方法相比，该技术的主要优势在于其速度，比人工测量快约六倍。人们已知该方法可能存在困难，因为叶片的正确放置对下游分析至关重要，而且将叶片固定在载玻片上在技术上具有挑战性。
当我意识到我们有大约 15,000 片叶子需要分析时，我首次萌生了这种方法的想法。手动完成这项工作将耗时数月，且极其枯燥乏味，展示植物解剖技术可能会导致神经疲劳。我实验室的一名科研人员首先准备 8.5 英寸 × 11 英寸的透明胶片。每张胶片应划分为矩形框，大小需足以容纳一株植物的叶片，将第二张透明胶片贴在已打印的胶片上，作为覆盖层以防止叶片干燥。
标注植物、基因型和生长条件。解剖第26天的植株叶片。将叶片按从最年轻到最老的顺序整齐排列在透明胶片上。
将叶片垂直放置在框架内，避免接触边框或与其他叶片重叠。否则，在分析过程中会出现问题。重要的是将叶片垂直定向，不接触框架，不相互重叠。叶片摆放完毕后，用第二张空白透明片和支架将其夹紧，以保持叶片平整。
然后使用平板扫描仪生成图像，分辨率至少为每英寸600点。首先安装插件，下载ImageJ，将leaf jja文件拖入ImageJ的plugins文件夹中。当使用ImageJ时，leaf J插件即可使用。
在 ImageJ 中打开叶片图像文件。确保 ImageJ 版本为 1.45s 或更高版本。通过点击“图像”→“颜色”→“拆分通道”，将图像拆分为红、绿、蓝三个颜色通道。接着，对蓝色通道中的图像应用阈值。
现在使用矩形选择工具选中一株植物的全部叶片，然后选择叶片 J 插件。该插件将弹出一个设置框，允许设置实验的各种条件，例如实验组和基因型。在继续操作前，请先编辑这些选项，然后为所选叶片所在的感兴趣区域设定相应条件，并提供一个描述性名称。
按继续，J 软件将自动为每片叶子生成具有唯一性 ROI 的图像轮廓。如有需要，J 程序会将叶片拟合为椭圆，并计算该椭圆的长轴和短轴。可通过 ROI 管理器窗口编辑轮廓线。
将触摸屏平板电脑连接为外部显示器可能对本操作有所帮助。在正确设定边界后，通过按下按钮执行分析。好的，现在叶片 J 会输出花瓣长度以及叶片的各种几何参数。
最后，将测量结果及相关信息导出至电子表格中。扫描叶片后，用F-A-A-F-A固定液固定叶片。固定后的叶片可在4摄氏度下保存长达六个月。
在成像前一到两小时，将 FAA 固定液更换为氯酸溶液，以透明化叶片。透明化完成后，将叶片置于载玻片上，使表皮毛朝上，并使用复式显微镜在 40 倍放大倍数下，对每片叶片主脉两侧中央区域的 mesil 层进行成像，注意避开靠近表皮毛或叶脉的细胞。为避免图像处理困难，在制片时务必去除载玻片上的所有气泡，并在下一步中获取清晰对焦的图像。
在采集到所需的图像后，使用 ImageJ 打开其中一张图像，并借助触摸屏平板和触控笔，利用 ImageJ 的 ROI 管理器工具描记叶片细胞的轮廓。此过程不使用 LEAF J 插件。在将 LEAF J 用于实验之前，已将其分析的准确性和速度与经验丰富的研究人员进行比较。总体而言。
LEAF J 完成分析的速度比人工计算快 5.7 倍，且两种方法的数据对比显示，在所比较的 3,532 个测量参数中，所有参数的结果均高度相关。共有 172 个数据点为离群值。在这些离群值中，由 LEAF J 插件导致的仅有 29 个，远少于由人为误差导致的 143 个。
在手动测量过程中，LEAF J 已经经过进一步更新，以减少错误数量。基于对 LEAF J 测量结果的信心，采用混合效应模型，利用该工具对避荫反应进行了分析。其中，处理方式和叶片序号作为固定效应，重复实验作为随机效应。
许多参数受到遮荫处理的显著影响。此外，部分参数则未受到遮荫处理的显著影响。通过使用平板辅助的细胞参数图像分析，共检测了8,629个细胞，这些细胞来自224株植物的877片叶片，涵盖拟南芥ANA的67种基因型。
随后将基因型分为六类。大多数基因型具有正常的细胞大小和细胞数量，但有几种基因型表现出细胞大小增大而细胞数量正常。
在进行该实验操作时，尽管在植物培养过程中采用随机化和实验设计非常重要，但请务必注意，接触甲醛和盐酸可能具有极高危险性。因此，在操作过程中应采取佩戴手套、在通风橱内操作等防护措施。观看本视频后，您应能够充分理解如何在您自己的实验条件下，利用本实验方案对叶片和细胞形态表型进行高通量筛选。
其他方法（如RNA测序）可用于回答哪些基因有效调控形态发生等问题。
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概述
本文展示了高通量叶片测量的关键方法，旨在加快植物研究中的叶片表型分析。该方法包括对分离的叶片进行成像并加以分析，以揭示叶片形态和细胞特征的差异。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物表型分析
- 图像分析
- 植物学研究
背景
- 叶片形态测量对于研究植物突变体至关重要。
- 高通量方法可提高筛选效率。
- 自动化技术可减少人工操作并提高准确性。
- 图像分析可提供关于叶片形态的定量数据。
研究目的
- 实现叶片形态测量的自动化，以用于高通量实验。
- 通过高效的表型分析，促进植物突变体的研究。
- 利用先进的成像技术，提高叶片测量的准确性。
使用的方法
- 解剖叶片，随后使用平板扫描仪进行成像。
- 使用叶片J插件进行检测与测量。
- 制备用于显微镜观察和摄影的叶片样本。
- 利用触摸屏平板在图像上描记细胞轮廓线。
主要结果
- 展示了不同植物突变体之间叶片形态的差异。
- 通过图像分析量化了细胞大小和细胞数量。
- 提供了一种高效的高通量叶片表型分析方法。
- 证明了自动化技术在植物学研究中的有效性。
结论
- 高通量方法显著提升了叶片表型分析的效率。
- 自动化图像分析是植物研究中的有力工具。
- 未来的研究可利用这些方法实现更广泛的应用。
常见问题
执行层面的行业相关性
高通量表型分析可加速植物生物学中的基因到功能的图谱构建，支持农业生物技术中的靶点验证。通过自动化测量叶片形态和叶柄特征，能够在遮荫避让等环境信号下快速筛选突变体。该方法提高了将基因型与表型结果关联的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过定量分析叶片形态，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过标准化叶柄长度和叶片参数测量，支持生物学风险降低。
- 预测价值：通过将叶片性状与基因修饰相关联，增强项目筛选能力。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为下游化合物筛选工作流程制备经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过半自动图像分析确保检测的标准化和可重复性。
- 可扩展性：能够在大规模突变体群体中实现对叶片表型的高通量评估。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过测量环境响应性性状（如遮荫诱导的叶柄伸长），与疾病相关系统相契合。
- 操作价值：通过一致的叶片性状定量，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 风险缓解：通过降低表型筛选中的机制模糊性，支持基于风险调整的推进决策。
流程与工作流整合
该方法通过自动化的叶片形态量化实现假设检验，从而整合到早期发现工作流程中。
- 发现生物学：通过将基因扰动与可测量的叶片形态变化相关联，支持通路解析。
- 筛选：提供可用于检测的实验准备条件和定量输出结果，以在表型筛选中可靠地评估化合物。
- 分析：生成关于叶柄长度、叶片面积和细胞形态的统计输出，用于比较不同实验条件。
- 转化研究：通过追踪不同基因型中响应环境变化的叶片性状，实现与临床前研究的连续性衔接。
- 企业级复用：作为可重复使用的平台，支持跨多个项目的高通量叶片表型分析。
运营与企业影响
- 科学价值：通过高精度、低变异的叶片测量，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：提升标准化和可扩展性，相比人工方法减少约6倍的人工工作量。
- 战略价值：通过为基因筛选项目提供可重复的表型数据，增强决策的可行性判断。
- 项目组合影响：基于量化的叶片性状响应，实现对基因型的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备图像分析和植物样品制备方面的专业知识。
- 依赖于平板扫描仪（≥600 DPI）和触摸屏平板电脑进行边界校正。
- 需要在不同团队之间对叶片解剖和装片流程进行标准化。
- 针对拟南芥以外的不同叶片大小和模式系统，需考虑方法的适应性调整。
- 受限于叶片放置和载玻片封装过程中的技术难题，可能影响下游分析的质量。
