Name: 局部应用药物研究烟碱型乙酰胆碱受体功能的小鼠脑片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习局部药物应用方法研究小鼠脑片神经元中烟碱型乙酰胆碱受体功能。该技术结合膜片钳记录，可快速精准激活配体门控离子通道，揭示天然受体的生物物理学特性。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DA030396 支持。感谢 Drenan 实验室成员对本文手稿提供的有益讨论和批评建议。特别感谢 Mi Ran Kim 在技术方面的协助，以及 Jonathan Thomas Ting 在成年小鼠脑切片方面的建议。

1. 脑片制备与电生理实验用溶液的配制
<ol>
 <li>用于制备脑切片的溶液此前已有描述3, 4。配制基于N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）的切片与恢复溶液，其成分为（单位为 mM）：93 N-甲基-D-葡萄糖胺、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、5 Na+ 抗坏血酸、2 硫脲、3 Na+ 丙酮酸、10 MgSO4•7H2O、0.5 CaCl2•2H2O。用 NMDG 调节渗透压至 300–310 mOsm。用 10 N HCl 将 pH 值调节至 7.3–7.4。
 <ol class="lalpha">
 <li>将 MgSO4•7H2O 和 CaCl2•2H2O 溶解于 Millipore 水中，分别配制成 2 M 的储备液。</li>
 <li>按所列顺序称取其余组分，在搅拌条件下加入已部分装有 Millipore 水的容量瓶中以助溶解。所有组分加入后，用 Millipore 水定容至刻度。</li>
 <li>测定 pH 值，并用 10 N HCl 调节。</li>
 <li>测定渗透压，必要时用 NMDG 调节。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>配制 HEPES 保存型人工脑脊液（aCSF），其成分为（单位为 mM）：92 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、5 Na+ 抗坏血酸、2 硫脲、3 Na+ 丙酮酸、2 MgSO4•7H2O、2 CaCl2•2H2O。用蔗糖调节渗透压至 300–310 mOsm。用 1 N HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.3–7.4。
 <ol class="lalpha">
 <li>按所列顺序称取各组分，在搅拌条件下加入已部分装有 Millipore 水的容量瓶中以助溶解。所有组分加入后，用 Millipore 水定容至刻度。</li>
 <li>测定 pH 值，必要时用 NaOH 或 HCl 调节。</li>
 <li>测定渗透压，必要时用蔗糖调节。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>配制标准 aCSF 记录溶液，其成分为（单位为 mM）：124 NaCl、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5 葡萄糖、2 MgSO4•7H2O、2 CaCl2•2H2O。用蔗糖调节渗透压至 300–310 mOsm。用 1 N HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.3–7.4。</li>
</ol>
2. 急性脑切片的制备
<ol>
 <li>脑切片的切割与恢复操作如前所述3, 4。将两个盛有NMDG恢复液的玻璃培养皿用95%氧气/5% CO2混合气体（碳合气）充气，其中一个置于冰上，另一个置于33 °C环境中。</li>
 <li>在室温下，用碳合气对盛有HEPES保存aCSF的玻璃培养皿进行充气。</li>
 <li>使用Na+戊巴比妥（200 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年小鼠（年龄为2至12个月）。当动物对脚趾夹捏无反应时，开始后续操作。</li>
 <li>如有需要，剪取尾部组织样本以备后续基因型鉴定。</li>
 <li>打开胸腔，暴露心脏，并夹闭降主动脉。撕裂右心房。</li>
 <li>经心脏灌注5–10 ml的0–4 °C NMDG恢复液。</li>
 <li>处死动物，取出脑组织并置于4 °C NMDG恢复液中1分钟。</li>
 <li>在预冷的金属板上，将脑组织按所需方向（冠状面、旁矢状面、水平面等）修整，以包含目标区域。</li>
 <li>用速干胶将脑组织块固定在振动切片机（DSK-Zero 1；Dosaka）干燥的切片台上，将脑组织块浸入4 °C NMDG恢复液中，并持续用碳合气充气。</li>
 <li>切割目标脑区的切片。切片厚度为200–400 μm，具体取决于目标脑区、动物年龄及实验需求。</li>
 <li>切片完成后，立即将所需切片放入经碳合气饱和的33 °C NMDG恢复液中，精确孵育12分钟，随后转移至经碳合气饱和的室温HEPES保存液中，初始孵育60分钟。此60分钟孵育结束后，切片即可用于记录。在当天使用前，切片均保存在HEPES保存液中。</li>
</ol>
3. 脑片中神经元的膜片钳记录
<ol>
 <li>使用可编程的Flaming-Brown拉制仪（Sutter P-97或同等垂直拉制仪）拉制标准的膜片钳玻璃微电极。适用于形成吉欧姆封接的微电极通常具有4–6 MΩ的电阻。</li>
 <li>将一片脑片转移至直立显微镜（Nikon FN-1）载物台上的记录室（RC-27L；Warner Instruments）中，并以持续灌流（1.5–2.0 ml/min）的方式用含碳合气（carbogenated）的标准记录用人工脑脊液（aCSF），在32 °C下加热并维持脑片活性。也可选择在室温下维持脑片。</li>
 <li>使用10倍空气物镜（Nikon Plan Fluor 10X；NA 0.3；WD：16 mm）定位并居中目标脑区。</li>
 <li>通过连接近红外差分干涉对比（IR-DIC）光学系统和高速近红外电荷耦合器件（CCD）视频摄像机（Hamamatsu C-7500）的40倍近红外（IR）水浸物镜（Nikon APO 40XW；NA：0.80；WD：3.5 mm）观察单个神经元。在IR-DIC观察下，健康的神经元表现出光滑、浅灰色的细胞膜。</li>
 <li>用合适的细胞内记录液填充微电极。在大多数应用中，我们使用以下溶液（单位为 mM）：135 钾葡萄糖酸盐、5 EGTA、0.5 CaCl2、2 MgCl2、10 HEPES、2 Mg-ATP 和 0.1 GTP（用Tris碱调节pH至7.25，用蔗糖调节渗透压至290 mOsm）。对已观察到的神经元建立全细胞记录模式。</li>
</ol>
4. 脑片中神经元的药物局部施加
<ol>
 <li>按照上述方法拉制标准的膜片钳玻璃微电极。当需要在同一细胞上使用多种药物溶液时，使用如Sutter P-97这类可从同一根玻璃毛细管拉出两个相同“姐妹”尖端的电极拉制仪具有优势。若用上述细胞内液填充，电极尖端电阻约为5 MΩ时为最佳。</li>
 <li>用溶解在通有碳合气（carbogenated）的标准记录aCSF中的药物溶液从后端填充微电极。将电极尖端朝下，轻弹装有药物的微电极，以去除溶液柱中可能存在的气泡。</li>
 <li>将装有药物的微电极安装在连接管路的压力喷射系统（如Picospritzer III，General Valve Co.）配套的电极架上。电极架应固定于显微操作器上，其分辨率应与常规膜片钳记录所用操作器相当（例如Sutter MP-285）。此外，该操作器应支持对脑片进行斜向进出移动。手动向微电极施加3至4次压力脉冲，以在液柱后方建立足够的压力。</li>
 <li>通过显微操作器控制，将药物电极在红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统下缓慢插入脑片。理想情况下，应先在视野中识别并居中一个待记录的神经元，随后在将记录电极插入脑片之前，先将药物电极定位至该细胞附近。若在形成吉欧姆封接（gigaohm seal）后再移动药物电极，其操作可能引起记录细胞周围组织位移，从而干扰记录。</li>
 <li>利用红外视频系统，将药物微电极置于脑片组织表面。执行一次压力喷射，并观察：1）电极尖端周围是否有因喷射引起的碎屑移动；2）电极尖端是否存在堵塞或阻塞迹象。若发现尖端堵塞，应撤回电极并更换新的电极。</li>
 <li>从脑片上方以斜向方式接近记录细胞，使药物填充电极尖端最终位置满足以下两点：1）与记录细胞及记录电极尖端处于同一焦平面或略低于该平面；2）距离记录细胞10至40 μm。若药物电极尖端位于记录细胞上方，压力喷射产生的力可能破坏吉欧姆封接。</li>
 <li>在电压钳或电流钳模式下记录目标细胞反应。我们常规在电压钳模式下记录乙酰胆碱和/或尼古丁诱导的细胞电流。尽管使用Picospritzer III时可手动触发压力喷射，但为了获得更可重复的结果，建议通过数据采集系统（Axon Digidata 1440和pClamp 10.3）发送数字TTL脉冲来自动触发压力喷射。</li>
</ol>
5. 使用压电驱动器控制载药微移液管
<ol>
 <li>如果可能，将装有药物的移液管固定器安装到单维压电位移器上（例如 压电驱动器（Piezojena PA-100 或 Burleigh PZM-150），能够接收来自采集系统的模拟电压输入信号，并安装至高精度显微操作器（Sutter MP-285）上。使用压电平移装置的优势在于，可更精确地控制药物填充移液管进出脑片的运动，包括进入和退出的时间与速度，从而在不同实验间实现更一致的操作。在研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）时，若使用压电平移装置仅在施加压力喷射的瞬间将移液管移近细胞，可最大限度减少因移液管中尼古丁泄漏所导致的受体脱敏效应。</li>
 <li>使用压电电压控制放大器上的手动电位计，将电压调节至最大值。</li>
 <li>使用显微操作仪，将装有药物的移液管定位至脑片中，使其能够将内容物释放到记录细胞上；然后通过手动将压电电压控制放大器的电压降至零，回撤移液管。</li>
 <li>通过记录采集系统的模拟输出信号，在压力喷射TTL脉冲发生前300毫秒开始，用250毫秒的时间将充满药物的移液管移入脑片中。在TTL脉冲结束50毫秒后，开始用250毫秒的时间将移液管撤回。</li>
</ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
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<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
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<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
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</ol>

本文介绍的方法在脑片制备中研究配体门控离子通道功能方面具有广泛的应用价值。然而，使用该方法时，有许多因素会显著影响实验数据的质量和可重复性。例如，诱发电流对充满药物的移液管尖端直径非常敏感。尖端过小会导致药物溶液难以推出，而尖端过大、电阻过低则更容易破坏记录细胞与记录电极之间的吉欧姆密封。该方法的另一个局限性在于，距离记录细胞10 μm范围内的其他细胞可能暴露于药物移液管释放的药物中，这可能会增加这些细胞的活性，进而可能影响记录细胞的活动。
在使用同一移液管对细胞多次施加药物时，每次施加都必须将移液管准确放回脑片中的同一位置。即使微小的偏差（例如 1-2 μm）的微小位置变化就可能导致观测到的峰值反应出现显著差异。使用可编程的压电驱动移液器（如上所述）或机器人显微操作器有助于精确定位给药移液管。另一个关键因素是记录细胞在脑片中的深度。位于脑片表面的细胞周围药物容易较快扩散，而位于脑片深层的细胞在给药时药物可能被“困”在组织内部。这一因素在应用尼古丁时尤为重要，因为当暴露时间超过100-200毫秒时，尼古丁会迅速导致nAChRs脱敏。同样，施加到药物填充移液管中的压...

<table><tbody><tr><td>N-甲基-D-葡糖胺</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 丙酮酸</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 戊巴比妥钠</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>76351315</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖酸钾</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>DSK-Zero 1 振动切片机</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-27 记录室</td><td>沃纳</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-344B 灌流加热控制器</td><td>沃纳</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>SH-27B 溶液加热器</td><td>沃纳</td><td>640102</td><td></td></tr><tr><td>尼康 FN-1</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-7500 CCD 视频相机</td><td>滨松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>通用阀门公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MP-285 微操作器 </td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA-100 压电控制器&amp;#8211;电翻译器 </td><td>piezosystem jena, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12V40 压电放大器</td><td>piezosystem jena, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td><td>Molecular Devices Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

局部给药法研究小鼠脑切片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

吸烟会导致多种健康问题，包括癌症、心脏病、肺气肿和中风。尼古丁成瘾是一种常见的神经精神障碍，源于尼古丁作用于中枢神经系统中广泛存在的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）所产生的生物物理和细胞效应。明确与尼古丁成瘾相关脑区中存在的各种nAChR亚型，是当前研究的重要优先方向。
采用膜片钳技术（如全细胞膜片钳或双电极电压钳记录）的实验对于目标烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的药理学表征具有重要意义。表达nAChR的细胞（例如哺乳动物组织培养细胞或Xenopus laevis卵母细胞）在物理上相互分离，因此可方便地利用现代药理学工具进行研究。这些技术已取得显著进展，尤其是在靶标受体已知且易于实现异源表达的情况下。然而，通常有必要在nAChR的天然环境中对其进行研究，即在从实验小鼠或大鼠急性分离的脑片中的神经元内进行研究。例如，表达“高敏性”nAChR亚基的小鼠模型，如α4 L9′A小鼠1和α6 L9′S小鼠2，可根据特定nAChR亚基的功能性表达明确识别相关神经元。尽管熟练的电生理学家常规可在脑片神经元上进行全细胞膜片钳记录，但在脑片中对记录的细胞局部施加乙酰胆碱或尼古丁等药物仍具挑战性。将药物扩散至灌流液（浴式给药）的方式难以快速撤除，而U型管系统则不易适用于脑片实验。
本文介绍了一种在成年小鼠脑片记录神经元时快速施加nAChR激活药物的方法。通过对脑片中的神经元进行标准的全细胞记录，同时将另一根充满目标药物的微电极移至记录细胞附近。向含药微电极中注入加压空气或惰性氮气，可使少量药物溶液从电极尖端喷出并作用于记录的细胞。利用该方法，可实现毫秒级精度解析nAChR介导的电流。药物施加时间可灵活调节，且含药微电极可回撤并更换为新的电极，从而可在单个神经元上构建浓度-反应曲线。尽管本方法是在nAChR神经生物学背景下描述的，但该技术也适用于研究脑片神经元中多种类型的配体门控离子通道或受体。

在我们的实验中，通常记录腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNc）中多巴胺（DA）能神经元的电活动。在电压钳模式下，对这些细胞施加乙酰胆碱或尼古丁，通常会引发快速的内向阳离子电流，电流在100–200毫秒内达到峰值（图1A-B）。电流的衰减主要取决于药物从作用位点的扩散情况，以及脑片中是否存在能够将药物代谢为无活性形式的酶。例如，乙酰胆碱可被富含多巴胺神经元脑区细胞表面的乙酰胆碱酯酶迅速水解5，从而导致诱发电流快速衰减（图1A）。相比之下，尼古丁不会被水解，因此尼古丁诱发的电流衰减速度远慢于乙酰胆碱诱发的电流（图1B），这使其能够强烈激活并导致烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）脱敏6。
压力喷射系统允许操作者调节压力脉冲的时间。这一特性在研究脑切片中神经元表面的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）时非常有用，因为它使研究者能够确定药物脉冲是否已引发最大诱发电流。例如，图2中的两条记录曲线显示，250毫秒的药...

本文介绍了一种用于研究急性分离脑片神经元中配体门控离子通道功能的有效方法。该方法结合标准膜片钳技术记录神经元，同时使用充满药物的微电极对神经元进行局部药物施加。

吸烟会导致多种健康问题，包括癌症、心脏病、肺气肿和中风。对香烟的成瘾是一种普遍现象……

本实验的总体目标是研究从成年小鼠急性制备的脑片中分离出的神经元上配体门控离子通道的功能。首先，对经过特殊人工脑脊液经心脏灌注的成年小鼠，取出完整的大脑；其次，在目标脑区按所需方向制备脑片，以此实现上述研究目标。接下来，将单个脑切片置于显微镜下的记录室中，并在切片内识别出单个神经元以进行记录。最后一步是对神经元进行全细胞膜片钳记录，随后使用第二根玻璃微电极局部施加药物，以激活配体门控离子通道。最终，该研究配体门控离子通道的方法可用于揭示活体神经元上天然受体的生物物理特性。与现有的灌注给药或YouTube药物递送等方法相比，该技术的主要优势在于药物递送至记录神经元的速度快且具有高度局部化。可递送微量药物，并可在单个脑片上研究多个神经元。该方法有助于回答烟碱型乙酰胆碱受体领域的关键科学问题，例如确定参与尼古丁介导的细胞生物物理特性、生物学反应及行为反应的天然烟碱型受体类型。在此操作中，处死成年小鼠并取出脑组织后，将脑组织置于冰上预冷的金属板上，按所需方向修整脑块，以包含目标区域。接着，用超级胶水将脑块固定在振动切片机的干燥载物台表面。然后，将脑块浸入4摄氏度的NMDG恢复液中，并持续用碳氧混合气（carbogen）对该溶液通气。随后，从目标脑区切取厚度为250微米的脑片。接下来，使用可编程的Flaming/Brown拉制仪制备标准的膜片钳微电极，其电阻应为4至6兆欧姆。用合适的细胞内记录溶液填充微电极。然后将脑片转移至直立显微镜载物台上的记录室中，并持续以每分钟1.5至2.0毫升的速度向脑片灌流含有碳酸气的32摄氏度标准记录用人工脑脊液（ACSF）。在显微镜下，使用10倍空气物镜定位并居中目标脑区。随后，使用连接至红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统的40倍近红外水浸物镜，以及高速近红外电荷耦合器件（CCD）摄像机观察单个神经元。在IR-DIC观察下，健康的神经元呈现光滑的浅灰色细胞膜。完成细胞观察后，进行后续实验操作。采用常规技术进行全细胞记录。现在，像之前一样，从同一根玻璃管上再拉制一根标准的膜片钳微电极，以获得两个特性相同的尖端，其理想电阻约为五兆欧姆。将其中一个微电极用溶解于碳酸化标准记录人工脑脊液中的药物溶液从后端填充，尖端朝下，轻弹装有药物的微电极，以去除微电极中可能被困住的气泡。接下来，将装有药物的微量移液管安装到连接在显微操作器上的移液管架中。移液管架应通过管路连接至合适的压力喷射系统。手动施加压力，对微量移液管进行三到四次压力喷射，以在液柱后方建立足够的压力。然后使用显微操作器按照I-R-D-I-C.Observation的步骤将药物移液管降低至脑片中。将药物微移液管置于组织切片表面。执行一次压力喷射，并观察喷射口附近是否有与喷射相关的碎屑移动以及微移液管尖端的情况。若发现吸头有堵塞迹象，应立即将移液管撤回并更换新的吸头。从脑片上方以对角线方向接近已记录的细胞。当到达最终位置时，充满药物的移液管尖端应与记录细胞及记录电极尖端处于同一焦平面，并且距离记录细胞约10至40微米。如果装有药物的移液管尖端位于记录细胞的上方，压力喷射产生的力可能会破坏细胞的吉欧封接（giga seal），此时在电压钳模式下记录乙酰胆碱和/或尼古丁诱导的细胞电流。尽管使用Pico Spritzer III时可手动触发压力喷射，但为了获得更可重复的结果，建议通过采集系统和数字TTL脉冲来触发压力喷射。为了改进实验，可将装有药物的移液管支架安装在能够接收模拟电压输入的单维压电平移装置上，再将该装置固定于高精度显微操作器上。压电微操作器之所以有用，是因为可以更轻松地控制药物填充移液管进出脑片的运动，包括进出的时间和速度，从而在不同实验之间更容易地重复操作。接下来，使用压电电压控制放大器上的手动电位计将电压调节至最大值。使用显微操作器将装有药物的移液管定位到脑片中。使用记录采集系统的模拟输出信号，通过手动将pazo电动电压控制放大器上的电压降至零，从而回撤移液管。在药物填充的移液管施加压力喷射TTL脉冲之前，将其移入脑片中。脉冲发生后，回撤移液管。该图显示了多巴胺能神经元对局部施加的100微摩尔乙酰胆碱的典型反应，此图则显示了另一多巴胺能神经元对局部施加的100微摩尔尼古丁的典型反应。此处为在电流钳模式下记录的Alpha six L nine prime S小鼠脑片中多巴胺能神经元的自发动作电位。使用250毫秒压力喷射施加1微摩尔尼古丁，可诱导动作电位发放频率和静息膜电位的变化。使用P钳制软件中的阈值搜索功能，通过分析单个上丘神经元对乙酰胆碱反应的类型来分类神经元，并由此推导出瞬时放电频率。在Alpha6 L9'小鼠脑片中，将神经元进行电压钳制后，通过压力喷射方式局部施加1 µM尼古丁；I型神经元表现出IPSC增加。在施加尼古丁后，II型神经元表现出显著的内向电流以及EPSC增加。压电平移器可提供稳定性并防止药物泄漏。在来自Alpha six L nine prime S小鼠脑切片中的VTA多巴胺能神经元上，以电压钳模式进行记录。在施加1微摩尔尼古丁期间，先将充满尼古丁的移液管通过压电平移器移动至最终位置，进行压力喷射，喷射结束后再将其撤回。在首次记录后两分钟记录了第二次反应，以证明未发生N-A-C-H-R脱敏。实验中应用了10微摩尔的尼古丁重复进行。与第一次反应相比，第二次反应仍未观察到脱敏现象。一旦掌握，该技术若操作得当，最短可在三小时内完成。在某些情况下，可在一天内从单个脑切片中研究 10 至 15 个神经元。在尝试该操作时，需牢记准确放置充满药物的移液管，以维持表面烟碱型受体的充分激活与吉欧封接完整性的平衡。

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局部应用药物研究烟碱型乙酰胆碱受体功能的小鼠脑片

我们开发了一种新技术，通过结合基因敲入方法对受体进行荧光蛋白标记以及光谱共聚焦成像等多种手段，定量分析中枢神经系统特定亚型神经元亚细胞区域中烟碱型乙酰胆碱受体的变化，以更深入地理解尼古丁成瘾的机制。...

慢性尼古丁给药条件下，荧光标记的烟碱型受体在基因敲入小鼠中的共聚焦光谱成像

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex...

脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

我们开发了一种腹侧海马-伏隔核环路的基因嵌合体构建方法 体外...

活体成像观察尼古丁诱导的腹侧海马轴突钙信号传导及神经递质释放

本方案演示了一种优化方法的实施...

使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

采用经过验证的计算机化神经心理学和神经生理学测试组合，用于研究新开发药物在早期研发阶段对中枢神经系统的药效动力学影响。为展示该测试组合的应用，本文描述了美加明的急性作用，以及两种激动剂药物对这些作用的逆转效果。...

用于早期药物研发中研究胆碱能药物对中枢神经系统药效动力学作用的计算机化测试组合

我们提出一种方法，该方法能够 为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外...

使用替代方法研究神经退行性变早期事件 离体 大鼠脑切片

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。...

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

本文介绍了一种通过尼古丁光解技术在小鼠脑切片中研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的方法。当该技术与同时进行的膜片钳记录和双光子激光扫描显微镜相结合时，尼古丁光解能够将烟碱型受体功能与细胞形态联系起来，从而加深对胆碱能神经生物学的理解。...

通过光激活型尼古丁的激光闪光光解法探查小鼠脑片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

我们介绍一种用于评估成年小鼠急性脑片中单个皮质-纹状体谷氨酸能突触处谷氨酸释放与清除之间平衡的实验方案。该方案采用谷氨酸荧光探针 iGluu 进行谷氨酸检测，利用 sCMOS...

正常与亨廷顿病小鼠急性脑切片中谷氨酸释放与摄取的单突触指示剂

本方法介绍了一种利用急性脑切片检测内源性单胺类物质释放的简单技术。该实验装置采用一个48孔板，其中包含用于单胺释放的组织固定装置。释放的单胺类物质通过高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测进行分析。此外，该技术还可作为药物发现的筛选方法。...

一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法

本方案描述了利用哺乳动物 Neuro-2a 细胞系表达并定量神经元型烟碱乙酰胆碱受体亚基的方法。通过 pH 敏感性荧光标签结合共聚焦显微镜，可精确评估受体在质膜上的定位情况，以及在 pH 中性细胞内区室中的表达情况，从而促进对 nAChR...

利用哺乳动物细胞中的定量成像技术定位质膜及细胞内神经元型烟碱乙酰胆碱受体

学习局部药物应用方法研究小鼠脑片神经元中烟碱型乙酰胆碱受体功能。该技术结合膜片钳记录，可快速精准激活配体门控离子通道，揭示天然受体的生物物理学特性。

局部给药法研究小鼠脑切片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

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