毛细力光刻技术在心肌组织工程中的应用

本实验的总体目标是制备仿生细胞培养基底，以构建宏观心脏组织的结构与功能。首先通过深反应离子刻蚀技术制备具有理想拓扑结构的硅模板。第二步是利用紫外辅助毛细力光刻技术，将硅模板上的理想拓扑图案转移至PUA模具上。

接下来，利用PUA模具作为模板，通过紫外辅助或溶剂介导的毛细力光刻技术，使用不同的聚合物材料制备细胞培养基底，具体材料选择取决于预期应用。最后一步是将原代心肌细胞或干细胞分化而来的心肌细胞接种到纳米图案化的细胞培养基底上，用于后续分析。最终，通过明场显微镜和免疫荧光显微镜观察心肌细胞内细胞形态及收缩蛋白排列的变化。

与微接触印刷等现有方法相比，该技术的主要优势在于，毛细力光刻能够制备出具有纳米图案的细胞培养基底，从而在不依赖细胞增殖或迁移的情况下诱导心肌组织单层的结构定向排列。尽管该方法可用于研究心肌组织结构与功能之间的关系，也可应用于其他系统，例如癌症力学生物学。为研究基质形貌对细胞迁移的影响，请首先用100%乙醇或二甲苯清洗硅模板表面，并在氧气或氮气下吹干，以开始此操作。

接下来，将硅胶母版的图案面朝上放置于培养皿中，对于表面图案为 2 厘米 × 2 厘米的硅胶母版，加入 40 微升的 PUA。然后将一张 4 厘米 × 4 厘米的透明聚酯薄膜覆盖在已滴加的 PUA 上，按压 PET 薄膜，使用滚轮或平边工具在薄膜下方将 PUA 涂布至整个图案表面，确保整个图案区域均被 PUA 预聚物覆盖。随后，将硅胶母版、预聚物和 PET 薄膜置于 20 瓦紫外灯下方约 10 厘米处，照射 50 秒。

固化后，用镊子缓慢移除PET薄膜，PUA应附着于PET薄膜上，并带有硅胶母版纳米图案的负模。随后，在使用前需将PUA-PET纳米图案在紫外光下继续固化至少12小时。

为了清洗硅模板，将另一层PET膜覆盖在模板上，不添加PUA。用紫外光照射50秒后揭去PET膜。随后用100%乙醇或二甲苯冲洗硅模板，并在氧气或氮气下吹干。

在此步骤中，将直径为18毫米的圆形玻璃载片放入臭氧室中处理10分钟。接着，将载片放置在聚二甲基硅氧烷（PDMS）块上，以暂时固定，便于操作。然后，在玻璃载片表面涂覆一层玻璃底涂剂。

让引物在空气中干燥30分钟。现在将玻片放置在一张打印纸上。在每张玻片的中央滴加10 µL聚氨酯预聚体，并确保不产生气泡。

然后将PUA模具的图案面朝下放置在玻璃载片上，通过沿PUA模具滚动橡胶压辊，使PU预聚物均匀分散在玻璃载片表面。随后用打印纸吸除多余的聚合物溢出物，并在20瓦紫外灯下紫外固化60秒。接着将样品从紫外光源处取出，小心地将PUA模具从涂有PU的玻璃载片上剥离，即认为PU的聚合反应已完成。

当PUA模具能够干净地从样品上剥离，且聚氨酯玻璃载片呈现彩虹光泽时，将样品放入干燥器中保存，可保存长达一个月。接着，将NFS盖玻片粘附至35毫米组织培养用聚苯乙烯培养皿中，用移液器向培养皿底部加入20微升NOA。轻轻将NPPU盖玻片置于NOA上，使胶水自然铺展并覆盖整个盖玻片底部，随后将培养皿暴露于紫外光下照射10分钟，以固化NOA。

接下来，用 70% 水乙醇溶液对 NP 基质进行灭菌处理，每次使用两毫升，冲洗两次，每次持续五分钟。用抽吸法去除乙醇。将 A NFS 置于生物安全柜内的紫外灭菌灯下，静置约一小时，使其完全自然风干。

为了增强细胞黏附，首先将纤连蛋白用去离子水稀释至每毫升5微克，然后将A NFS用纤连蛋白溶液在4℃过夜包被。接着，将2毫升纤连蛋白溶液加入培养皿中。随后将A NFS置于37摄氏度、5%CO2的培养箱中孵育过夜。

取NR VMs、HESC CMS或其他感兴趣的 cardiac 细胞，将细胞样品在1000 RPM下离心3分钟以沉淀细胞。小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。随后，将细胞重悬于培养基中，调整浓度至4.6 × 10⁶ 个细胞/毫升。

用移液器小心地将200微升细胞悬液滴加到已灭菌的A NFS上，并确保细胞悬液保留在盖玻片上。接着，将细胞置于37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育4小时，使细胞贴附于A NFS上。然后向培养皿中加入2毫升预热的培养基，并在相同条件下再次将细胞放回培养箱中继续培养。

24小时后，吸去培养基，用2毫升DPBS洗涤两次，以去除多余的细胞。随后，向培养皿中加入2毫升预热的培养基。将细胞置于相同条件下培养箱中继续培养。

细胞长至融合后，每隔一天更换一次培养基。该图显示了培养7天后大鼠心室心肌细胞（NR VMs）和人胚胎干细胞来源的心肌细胞（HESC CMS）的代表性明场图像。培养48小时后，NP表面的大鼠心室心肌细胞和人胚胎干细胞来源的心肌细胞表现出明显的结构各向异性和排列取向，而在UN图案化表面的心肌细胞则呈随机排列。

免疫组织化学分析凸显了纳米形貌对细胞骨架排列、肌动蛋白微丝以及α-肌节肌动蛋白的影响：在各向异性纳米结构（A NFS）上培养的细胞中，这些结构沿纳米脊方向排列，而在无图案基底上的细胞中则呈随机分布。在进行该操作时，务必记住在细胞接种前对基底进行灭菌，因为污染可能在后续培养过程中引发严重问题。该技术为心血管生物学领域的研究人员探索心脏成熟过程及干细胞来源的心肌细胞提供了重要途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过毛细力光刻技术制备用于心脏组织工程的仿生细胞培养基质。