June 10th, 2014
在该协议中,我们展示了使用毛细管力光刻技术制造由两种不同的聚合物材料制成的仿生心肌细胞培养基质。 所描述的方法提供了一种可扩展、经济高效的技术,用于体外和体内应用的宏观心脏组织的结构和功能。
该程序的总体目标是产生仿生细胞培养基质,以设计宏观心脏组织的结构和功能。这是通过首先通过深度反应离子蚀刻制造具有所需形貌结构的有机硅母版来实现的。第二步是使用 UV 辅助毛细管力光刻技术将所需的形貌图案从硅母版转移到 PUA 模具中。
接下来,使用 PUA 模具作为模板,根据所需的应用,通过 UV 辅助或溶剂介导的毛细管力光刻技术,用各种聚合物材料制造细胞培养基质。最后一步是将原代或干细胞来源的心肌细胞接种到纳米型细胞培养基质上,用于后续分析。最终,明场和免疫荧光显微镜用于显示心肌细胞内细胞形态和契约蛋白排列的变化。
与现有方法(如微接触打印)相比,该技术的主要优点是毛细管力光刻产生纳米图案细胞培养基质,该基质可以诱导心脏组织单层的结构排列,而无需依赖细胞增殖或迁移。虽然这种方法可用于深入了解心脏组织的结构功能关系,但它也可以应用于其他系统,例如癌症机械生物学。为了研究基质拓扑结构对细胞迁移 Be 的影响,通过用 100% 乙醇或二甲苯清洁硅母体表面并在氧气氮气下干燥来开始此过程。
接下来,将硅母模面朝上放入硅母模培养皿中,用 2 厘米 x 2 厘米的表面图案吸取 40 微升 PUA。然后将一张 4 厘米 x 4 厘米的透明聚酯薄膜放在分配的 PUA 上,压在 PET 片材上,并使用滚筒或平边表面将片材下方的 PUA 铺在模型面上,以便整个模型被 PUA 预聚物覆盖。然后将有机硅预聚物和 PET 置于 20 瓦紫外线灯下方约 10 厘米处 50 秒。
固化后,用镊子慢慢去除 PET 薄膜。PUA 应贴在 PET 薄膜上,并带有 Silicon Master 纳米图案的底片。随后在使用前在 UV 下固化 P-U-A-P-E-T 纳米模型至少 12 小时。
要清洁 Silicon Masters,请在 Master 顶部放置另一层 PET 薄膜,而不添加 PUA。将其暴露在紫外线下 50 秒,然后去除 PET 薄膜。然后用 100% 乙醇或二甲苯冲洗硅母版,并在氧气、氮气下干燥。
在此过程中,将直径为 18 毫米的圆形载玻片放入臭氧室中 10 分钟,对其进行处理。接下来,将玻片放在 PDMS 块上以暂时固定它们以便于处理。接下来,在载玻片表面涂上一层玻璃底漆。
让底漆风干 30 分钟。现在将载玻片放在一张打印纸上。将 10 微升聚氨酯预聚物滴到每个载玻片的中心,确保不产生气泡。
然后将 PUA 模具模型面朝下放在载玻片上,沿 PUA 模具滚动橡胶圆筒辊,将 PU 预聚物均匀分散在载玻片表面。打印纸将吸收溢出的聚合物,然后在 60 瓦紫外线灯下对其进行紫外线固化 20 秒。随后,从紫外光源中取出样品,小心地从 PU 涂层载玻片上剥离 PUA 模具,PU 的聚合被认为是完成的。
当 PUA 模具从样品上干净地剥离并且 PU 载玻片具有彩虹色外观时,将样品置于干燥液中存放长达一个月。现在将 NFS 盖玻片贴在 35 毫米组织培养聚苯乙烯培养皿上,移液管将 20 微升 NOA 移液到培养皿底部。轻轻地将 NPPU 盖玻片放在 NOA 的顶部,让胶水散开并覆盖整个盖玻片底部,然后将培养皿暴露在紫外线下 10 分钟,固化 NOA。
接下来,用 2 毫升 70% 乙醇水溶液冲洗 NP SUBSTRATA 两次,每次 5 分钟,对 NP SUBSTRATA 进行消毒。通过抽吸去除乙醇。让 A NFS 在生物安全柜的紫外线消毒灯下完全风干约一小时。
为了增强细胞粘附,先将纤连蛋白在纤连蛋白中稀释至 5 μg/mL,将 A NFS 包被在纤连蛋白中过夜。接下来,将 2 毫升纤连蛋白溶液移液到培养皿中。然后将 A NFS 放入 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中过夜。
获取 NR VM、HESC CMS 或其他感兴趣的心肌细胞,以 1000 RPM 离心细胞样品 3 分钟以沉淀细胞。通过抽吸小心地去除上清液,并确保不要干扰沉淀。之后,将细胞重悬于培养基中,浓度为 4.6 x 10 至每毫升 6 个细胞。
小心地将 200 微升细胞悬液移液到灭菌的 A NFS 上,并确保细胞悬液留在盖玻片上。接下来,将细胞置于 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中 4 小时,让细胞附着在 A NFS 上。然后向培养皿中加入 2 mL 额外的温热培养基,并在相同条件下再次将细胞放入培养箱中。
24 小时后,取出培养基并用 2 毫升 DPBS 洗涤两次以去除多余的细胞。之后,向培养皿中加入 2 毫升温热的培养基。将细胞置于相同条件下的培养箱中并培养。
汇合的细胞每隔一天更换一次培养基。该图显示了培养 7 天和 HESC cms 后 NR VM 的代表性明场图像。培养 48 小时后,NP 表面的 NR VM 和 HESC CMS 显示出明显的结构各向异性和对齐,而 UN 模式表面上的心肌细胞是随机定向的。
免疫组织化学分析突出了纳米拓扑结构对细胞骨架排列的影响,在 A NFS 上培养的细胞中的肌动蛋白微丝和 α 肌节肌动蛋白沿纳米脊排列,但仍随机分布在未图案基质上的细胞中。在尝试此程序时,重要的是要记住在细胞放置之前对底层进行消毒,因为污染在其形成后可能是一个大问题。这项技术为心血管生物学研究人员探索心脏成熟和干细胞衍生的心肌细胞铺平了道路。
观看此视频后,您应该对如何通过毛细管力光刻技术为心脏组织工程应用生产仿生细胞培养基质有很好的了解。
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本协议展示了使用毛细力光刻技术制造仿生心脏细胞培养基质的方法。所概述的方法提供了一种可扩展且成本效益高的方法来工程化宏观心脏组织以供各种应用。
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.