Name: 单分子成像的基因调控 em在体内 /em使用转位激活裂解（CoTrAC） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解CoTrAC单分子成像技术用于活细胞基因调控研究，通过荧光显微镜实时追踪大肠杆菌中蛋白质合成动态。该方法实现单分子精度观察转录因子表达，为细胞生物学研究提供非侵入性工具。

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表达Ubp1的质粒pCG001由约翰·柯廷医学研究中心的Rohan Baker惠赠。本研究由美国出生缺陷基金会研究资助1-FY2011、美国出生缺陷基金会Basil O'Connor启动学者研究奖#5-FY20以及美国国家科学基金会CAREER奖0746796资助。

1. 菌株改造工作流程
<ol>
	<li>插入编码以下元件的序列：(a) 膜定位序列，(b) 快速成熟荧光蛋白，以及 (c) 蛋白酶识别序列，位于目标蛋白的N端且与之阅读框一致例如 一种转录因子）。我们使用了膜定位的 Tsr-Venus 报告基因 2 并将其与蛋白酶识别序列泛素（Ub）融合，以计数表达的噬菌体数量 &lambda; 阻遏蛋白CI分子。关于如何构建融合蛋白Tsr-Venus-Ub-CI的详细信息，包括替换野生型CI编码区并将该构建体插入到 E. coli 染色体使用 &lambda; 红重组 3，详见参考文献1。</li>
	<li>通过测序验证所有修饰。</li>
	<li>将编码一种蛋白酶的质粒转化至表达荧光报告蛋白与目的蛋白的翻译融合体的菌株中，该蛋白酶特异性识别上述所用的识别序列。我们使用了Ubp1蛋白酶，其可在泛素C末端残基之后立即进行切割 4.</li>
</ol>
2. 培养细胞并制备样品
<ol>
	<li>从新划线的琼脂平板上挑选一个感兴趣的 E. coli 单菌落，接种至 1 ml 添加了 1X MEM 氨基酸和适当抗生素的 M9 最小培养基5中。在适宜温度下振荡培养，直至 OD600 &gt; 1.0（600 nm 处的光密度）。</li>
	<li>将菌液按适当抗生素浓度稀释至 1 ml 新鲜 M9 培养基中，使 OD600 = 0.02。在适宜温度下振荡培养。若需低温生长，可酌情提高初始细胞密度。</li>
	<li>当 OD600 = 0.2–0.3 时（在 37 °C 条件下，初始接种 OD600 = 0.02 的菌液通常需培养 3–4 小时），开始制备琼脂糖凝胶垫（步骤 3）。</li>
	<li>当 OD600 = 0.3–0.4 时，细胞即可用于显微成像。</li>
	<li>取 1 ml 培养后的菌液转移至 1.5 ml 微离心管中，在台式微离心机中以 10,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>弃上清，加入 1 ml 新鲜 M9 培养基，轻柔重悬菌体沉淀。</li>
	<li>以 10,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>重复步骤 1.6 和 1.7，弃上清。</li>
	<li>用 1 ml M9 培养基轻柔重悬菌体。细胞可直接用于显微镜成像，或稀释 10 至 100 倍以确保低细胞密度，用于延时成像。需注意，低细胞密度对长时间延时成像至关重要。实验过程中成像腔室（步骤 4）处于密封状态。由于细胞呈指数生长，初始细胞密度过高会导致在凝胶垫中长时间生长后腔室内氧气显著耗尽，从而影响荧光蛋白的成熟并干扰细胞正常生长。</li>
</ol>
3. 准备琼脂糖溶液
<ol>
	<li>称取 10–20 mg 低熔点琼脂糖至 1.5 ml 微量离心管中。</li>
	<li>加入适量不含抗生素的 M9 最小培养基，配制成 3% 的琼脂糖溶液。</li>
	<li>将琼脂糖溶液在 70 °C 下加热 30 分钟以完全融化，期间倒置离心管数次，确保溶液充分融化且均匀。此时可直接进行下一步（步骤 4）制备凝胶垫，或将温度降至 50 °C 并在此温度下保存数小时，以备后续使用。</li>
</ol>
4. 在腔室上制备凝胶垫
<ol>
	<li>成像前约50分钟，用水冲洗一片Microaqueduct载玻片。</li>
	<li>用无菌水冲洗一片已清洁的盖玻片（使用严格清洁方法，例如文献6中所述）和Microaqueduct载玻片，并用压缩空气吹干。</li>
	<li>将橡胶垫圈放置在Microaqueduct载玻片上，使其覆盖载玻片玻璃面的进样口和出样口（若需通过样品灌注培养基，可对此步骤进行相应调整）。在Microaqueduct载玻片中央加入50 μl琼脂糖溶液（步骤3）。</li>
	<li>将已清洁并干燥的盖玻片覆盖在琼脂糖溶液上方。</li>
	<li>让琼脂糖溶液在室温下静置30分钟。</li>
	<li>在此期间，准备细胞样品（步骤2）。</li>
	<li>小心地将盖玻片从凝胶垫顶部剥离。在凝胶垫表面加入1.0 μl洗涤后的细胞培养物。等待约2分钟，使培养物被凝胶垫吸收。注意等待时间不宜过长，以免凝胶垫过度干燥；但需足够时间以确保细胞充分黏附于凝胶垫上。理想的等待时间会因温度和湿度而异。</li>
	<li>等待过程中，将另一片预清洁的盖玻片干燥备用。</li>
	<li>用新的盖玻片覆盖样品，确保盖玻片与Microaqueduct载玻片对齐良好。</li>
	<li>按照制造商说明组装温控培养室。此后即可用于显微镜成像（步骤5）。</li>
</ol>
5. 时间序列成像与图像采集
<ol>
	<li>按照制造商的说明打开激光器和显微镜例如 激光器可能需要预热约0.5小时后才能开始实验。</li>
	<li>将组装好的培养室锁定在显微镜的载物台插入件上。将培养室和物镜加热器的温度设置为37 &deg;C或其他所需生长温度。</li>
	<li>若在室温以上成像，焦点或凝胶垫通常在初始温度变化后的约15分钟内会发生显著漂移。实际操作中，可利用这段时间寻找感兴趣区域，并根据实验需要调整成像程序。</li>
	<li>在显微镜下找到细胞，并在将每个细胞居中于预定义且对齐的成像区域后，记录其位置。每次图像采集时间窗口内可对多个细胞进行成像。对于跨越多代的延时成像，需确保初始成像的细胞与其他细胞相隔至少数百微米。 &mu;m，以确保其他菌落在生长过程中不会进入成像区域。</li>
	<li>调节激光激发强度，使几乎所有荧光分子在6次曝光内发生光漂白图5).</li>
	<li>使用自动成像脚本/日志，按照实验流程中描述的算法获取延时成像数据 图3.</li>
</ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

我们没有披露事项。

CoTrAC 方法可推广用于检测其他蛋白质的表达，尤其适用于传统的N端或C端荧光蛋白融合可能破坏目标蛋白活性的情况。与现有方法相比，CoTrAC 策略具有三个独特优势。首先，共翻译融合可确保每个目标蛋白分子对应产生一个荧光报告分子，从而实现实时、准确的蛋白质表达量定量。其次，靶向细胞膜的报告蛋白 Tsr-Venus 能够实现荧光报告分子的单分子水平检测，因而可检测极低水平表达的蛋白质。第三，也是最重要的一点，荧光报告分子的共翻译切割使目标蛋白几乎保留了野生型的氨基酸序列并正常发挥功能——在 E. coli 中利用泛素（Ubiquitin）作为蛋白酶识别序列，目标蛋白仅在其N端第一个 N-甲酰甲硫氨酸被替换为甲硫氨酸，其余序列与野生型肽段完全一致。
使用 CoTrAC 方法时，需要注意该方法测量的是每个 5 分钟时间窗口内产生的蛋白质分子数量，这与测量每个细胞中蛋白质分子的存量（即蛋白质浓度）不同。i.e. 蛋白质浓度是蛋白质合成与降解达到平衡的结果。大多数单细胞荧光基因表达检测方法测量的是蛋白质浓度，因此，若利用浓度测量值来推断...

<table><tbody><tr><td>琼脂糖（低熔点）</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&amp;#215;M9 盐溶液</td><td></td><td></td><td>配制方法见参考文献&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>20% 葡萄糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50&amp;#215;MEM 氨基酸溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>温控培养室&lt;br/&gt; 阶段适配器</td><td>Bioptechs</td><td>FCS-2</td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>Bioptechs</td><td>型号取决于显微镜物镜</td><td></td></tr><tr><td>微流道载玻片</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>40CIR-1</td><td>可能难以采购；Bioptechs 亦有供应</td></tr><tr><td>盖玻片/载玻片密封垫圈</td><td>Bioptechs</td><td>FCS2 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>多种</td><td>示例配置：Coherent Innova 308C 氩离子激光器、Olympus IX-81 显微镜、Olympus PlanApo 100X NA 1.45 物镜、Metamorph 软件</td><td>必须具备激光激发功能、自动 xyz 载物台、支持脚本成像和自动对焦的自动化软件，以及能够分辨单个荧光蛋白的光学系统</td></tr><tr><td>EM-CCD 相机</td><td>多种</td><td>示例配置：Andor Ixon DU-898</td><td>必须具有足够低的噪声水平，以检测高于背景的单个荧光蛋白信号</td></tr></tbody></table>

基因调控的单分子成像 在体 利用共翻译切割激活（cotrac）

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

我们介绍一种荧光显微镜方法——共翻译切割激活法（Co-Translational Activation by Cleavage, CoTrAC），可在单分子精度下对活细胞中蛋白质分子的合成过程进行成像，且不干扰目标蛋白的功能。该方法能够对单个细胞在连续的五分钟时间窗口内产生的蛋白质分子数量进行计数。该技术需要配备激光激发功率密度约为0.5至1 kW/cm2的荧光显微镜，该灵敏度足以在活细胞中检测单个荧光蛋白分子。本方法所用的荧光报告蛋白包含三个部分：膜定位序列、快速成熟型黄色荧光蛋白以及蛋白酶识别序列。该报告蛋白在翻译水平上融合至目标蛋白的N端。细胞培养于温度可控的显微镜载物台上。每五分钟对细胞内的荧光分子进行成像（后续通过分析荧光图像进行计数），随后进行光漂白，以确保在下一次测量中仅计数新翻译合成的蛋白质分子。
通过检测每幅图像中的荧光点，将其分配给单个细胞，再将细胞归入细胞谱系，可对本方法获得的荧光图像进行分析。通过将荧光点的总荧光强度除以单个荧光分子的平均强度，可计算出特定细胞在一定时间窗口内产生的蛋白分子数量。我们利用该方法测量了单个5分钟时间窗口内0至45个分子范围的表达水平。该方法使我们能够测量λ阻遏蛋白CI表达过程中的噪声，并在系统生物学中具有广泛的其他潜在应用。

CoTrAC 实验追踪λ阻遏蛋白CI产生的典型结果如图所示 图4 和 5在本实验中，以5分钟为间隔对12个菌落进行成像。在每个时间点，首先对菌落进行自动对焦并将其居中于成像区域，随后保存已居中/对焦的位置并采集明场图像。然后将载物台移动约~0.5 μm 沿 z 轴移动，从明场焦平面移至细胞的中分平面（若无相差或微分干涉差（DIC）光学器件，可对半透明物体在略微离焦的平面上进行成像） 8最后，以1秒间隔采集六幅图像，每幅图像曝光时间为100毫秒（图5 显示其中一个时间点）。对每个时间点的所有细胞均重复此操作。由于在每个时间点几乎所有的Venus分子均被光漂白，因此荧光斑点在 图4 和 5 对应于过去5分钟内成熟（变为荧光）的Venus分子。Venus分子成熟迅速 体内 半衰期约为 2–7 分钟 1, 2, 7 Ubp1 的切割效率非常高 4, 9因此，可以通过计数膜上 Venus 分子的数...

我们介绍一种荧光显微镜方法——翻译偶联切割激活法（Co-Translational Activation by Cleavage, CoTrAC），可在不干扰蛋白质功能的前提下，以单分子精度对活细胞中蛋白质分子的生成进行成像。该方法已被用于追踪转录因子λ阻遏蛋白CI 1 的随机表达动态。

基因调控的单分子成像 在体 利用共翻译切割激活（CoTrAC）

我们介绍一种荧光显微镜方法——翻译偶联切割激活法（Co-Translational Activation by Cleavage, CoTrAC），用于在活细胞中对蛋白质分子的合成过程进行成像……

本实验的目的是获取表达共追踪构建体的生长中大肠杆菌菌落的时间序列荧光图像，以确定新合成的蛋白质分子数量。该目标通过以下步骤实现：首先制备共表达目标蛋白与荧光Cora报告分子融合蛋白的细胞样品，同时该细胞还表达一种特异性切割Cora报告分子与目标蛋白之间连接位点的蛋白酶；第二步是使用M9最小培养基制备低熔点琼脂糖凝胶。接下来，准备一个 AROS 凝胶垫，并将其用于温度可控的样品室。将大肠杆菌细胞放置在凝胶上，然后组装样品室。最后一步是将样品室置于荧光显微镜下，对多个世代中若干正在生长的细胞菌落进行定期成像。在每个时间间隔内对新生成的TRE报告分子进行光漂白，可用于在单分子和单细胞分辨率下获取活细胞中蛋白质生成的时间轨迹。该技术相较于使用荧光蛋白融合的体外单细胞检测方法的优势在于，能够利用单分子方法追踪任意类型蛋白质分子的生成过程，并研究影响这些分子功能的相关因素。为构建菌株，需插入编码膜定位序列、快速成熟荧光蛋白以及蛋白酶识别序列的DNA片段，并使其与目标蛋白（在本例中为转录因子或tf）的末端保持阅读框一致并融合连接。在此实验中，使用了靶向膜的 TSR 静脉报告基因。该报告基因与蛋白酶识别序列泛素（ubiquitin）融合，用于计数表达的细菌噬菌体 Lambda 抑制物 C 一蛋白分子的数量。将该构建体整合到大肠杆菌染色体后，将编码特异性识别该序列的蛋白酶的质粒转化至表达荧光报告基因和目的蛋白的菌株中，且目的蛋白与报告基因以翻译融合形式表达。在本实验方案中，使用了泛素羧基末端水解酶，该蛋白酶可特异性切割泛素C末端残基之后的位点。开始本方案时，从新划线的LB琼脂平板上挑取一个大肠杆菌单菌落，接种至1毫升M9最小培养基中，培养基中需添加1×最低必需培养基氨基酸以及适当的抗生素。在摇床中于目标温度下培养足够长时间，使菌液在600纳米处的光密度（OD 600）超过1.0。然后将培养物稀释至含有适当抗生素的一毫升新鲜M9培养基中，使OD600达到0.02。在适当温度下于摇床中培养，若低温生长需要，可增加初始细胞密度。当OD600达到0.2至0.3时，开始准备ARO凝胶垫：称取10至20毫克低熔点ARO，加入1.5毫升离心管中。加入适量体积的M九无抗生素最小培养基，配制成3%的琼脂糖溶液。然后在70摄氏度下加热该琼脂糖溶液30分钟以使其融化。颠倒试管，确保溶液完全融化且均匀。进行凝胶垫组装时，用无菌水冲洗一片预先清洁的盖玻片和一片微流通道载玻片。用压缩空气吹干盖玻片和载玻片。将橡胶垫圈放置在微流通道载玻片上，使其覆盖进样口和出样口。在载玻片的玻璃面一侧，将50微升ARO溶液滴加到微通道的中央。用经过清洁干燥的盖玻片覆盖ARO溶液。让ARO溶液在室温下静置30分钟。当细胞的 OD 600 达到 0.3 至 0.4 时，即可进行成像。取一毫升培养后的菌液转入 1.5 毫升微量

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单分子成像的基因调控<em在体内</em使用转位激活裂解（CoTrAC）

在活细胞中测定特定基因的RNA聚合酶II转录动力学。通过荧光标记目的基因转录出的mRNA，并利用光漂白后荧光恢复技术（FRAP），获得体内转录延伸的动力学参数。...

单个活细胞中 mRNA 转录动力学的测量

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

本文介绍了在早期小鼠全胚胎中检测β-半乳糖苷酶活性的标准实验方案，以及石蜡切片和复染的方法。该方法操作简便、快速，可用于监测发育过程中的基因表达，也可应用于组织切片、器官或培养细胞。...

通过检测完整小鼠胚胎中β-半乳糖苷酶活性示踪基因表达

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。...

体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。...

使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

神经干细胞/前体细胞表现出Notch信号通路组分的多种表达动态，从而导致细胞事件的不同结果。此类动态表达可通过高灵敏度的生物发光成像系统进行实时监测，而非静态分析，从而实现对基因表达快速变化的可视化观察。...

实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

追踪单个翻译事件可实现对帽依赖性翻译机制的高分辨率动力学研究。本文中我们展示了一种 体外 基于荧光标记抗体与表位标记新生肽段之间相互作用成像的单分子检测方法。该方法可实现对活性翻译过程中起始及肽链延伸动力学的单分子表征 体外...

一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。...

快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

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