基因调控的单分子成像 在体 利用共翻译切割激活（CoTrAC）

本实验的目的是获取表达共追踪构建体的生长中大肠杆菌菌落的时间序列荧光图像，以确定新合成的蛋白质分子数量。该目标通过以下步骤实现：首先制备共表达目标蛋白与荧光Cora报告分子融合蛋白的细胞样品，同时该细胞还表达一种特异性切割Cora报告分子与目标蛋白之间连接位点的蛋白酶；第二步是使用M9最小培养基制备低熔点琼脂糖凝胶。

接下来，准备一个 AROS 凝胶垫，并将其用于温度可控的样品室。将大肠杆菌细胞放置在凝胶上，然后组装样品室。最后一步是将样品室置于荧光显微镜下，对多个世代中若干正在生长的细胞菌落进行定期成像。

在每个时间间隔内对新生成的TRE报告分子进行光漂白，可用于在单分子和单细胞分辨率下获取活细胞中蛋白质生成的时间轨迹。该技术相较于使用荧光蛋白融合的体外单细胞检测方法的优势在于，能够利用单分子方法追踪任意类型蛋白质分子的生成过程，并研究影响这些分子功能的相关因素。为构建菌株，需插入编码膜定位序列、快速成熟荧光蛋白以及蛋白酶识别序列的DNA片段，并使其与目标蛋白（在本例中为转录因子或tf）的末端保持阅读框一致并融合连接。

在此实验中，使用了靶向膜的 TSR 静脉报告基因。该报告基因与蛋白酶识别序列泛素（ubiquitin）融合，用于计数表达的细菌噬菌体 Lambda 抑制物 C 一蛋白分子的数量。将该构建体整合到大肠杆菌染色体后，将编码特异性识别该序列的蛋白酶的质粒转化至表达荧光报告基因和目的蛋白的菌株中，且目的蛋白与报告基因以翻译融合形式表达。

在本实验方案中，使用了泛素羧基末端水解酶，该蛋白酶可特异性切割泛素C末端残基之后的位点。开始本方案时，从新划线的LB琼脂平板上挑取一个大肠杆菌单菌落，接种至1毫升M9最小培养基中，培养基中需添加1×最低必需培养基氨基酸以及适当的抗生素。在摇床中于目标温度下培养足够长时间，使菌液在600纳米处的光密度（OD 600）超过1.0。

然后将培养物稀释至含有适当抗生素的一毫升新鲜M9培养基中，使OD600达到0.02。在适当温度下于摇床中培养，若低温生长需要，可增加初始细胞密度。当OD600达到0.2至0.3时，开始准备ARO凝胶垫：称取10至20毫克低熔点ARO，加入1.5毫升离心管中。

加入适量体积的M九无抗生素最小培养基，配制成3%的琼脂糖溶液。然后在70摄氏度下加热该琼脂糖溶液30分钟以使其融化。颠倒试管，确保溶液完全融化且均匀。

进行凝胶垫组装时，用无菌水冲洗一片预先清洁的盖玻片和一片微流通道载玻片。用压缩空气吹干盖玻片和载玻片。将橡胶垫圈放置在微流通道载玻片上，使其覆盖进样口和出样口。

在载玻片的玻璃面一侧，将50微升ARO溶液滴加到微通道的中央。用经过清洁干燥的盖玻片覆盖ARO溶液。让ARO溶液在室温下静置30分钟。

当细胞的 OD 600 达到 0.3 至 0.4 时，即可进行成像。取一毫升培养后的菌液转入 1.5 毫升微量离心管中，在台式微量离心机中以 10,000 × g 离心一分钟。弃去上清液后，加入一毫升新鲜的 M9 培养基并重悬菌体。

轻轻悬浮沉淀，然后再次以10,000 × g离心一分钟。接着重复一次重悬和离心步骤，最后将沉淀轻轻重悬于1毫升M9培养基中。此时，细胞可用于显微镜成像，或稀释10至100倍以确保低细胞密度，用于延时成像。

为准备成像样品，小心地从凝胶垫顶部剥离盖玻片。将一微升洗涤后的细胞培养物加至凝胶垫表面。等待约两分钟，使培养物被凝胶垫完全吸收。

切勿等待过久导致凝胶垫过度干燥。理想的干燥时间会因温度和湿度的不同而有所变化。另取一块预先清洁好的盖玻片。

样品干燥后，盖上新的盖玻片，确保盖玻片与微流通道载玻片对齐良好。按照制造商的说明组装温控培养室。现在即可用于显微镜成像。

开始成像时，按照制造商的说明打开激光器和显微镜。将组装好的培养室锁定到显微镜的载物台插槽上。将培养室和物镜加热器的温度设置为37摄氏度或其他所需的培养温度。

如果在高于室温的条件下进行成像，焦点或凝胶垫在初始温度变化后的约15分钟内通常会出现显著漂移。实践中，可利用这段时间寻找感兴趣的区域，并根据需要调整成像程序。

进行实验时，调节激光激发强度，使几乎所有荧光分子在六次曝光内发生光漂白。在显微镜下找到细胞，并将其置于预定义且已对齐的成像区域中心。

然后记录每个细胞的位置，以便在同一幅图像中可对多个细胞进行成像。在进行多代时间序列成像时，需设置合适的采集时间窗口，确保初始成像的细胞彼此分离，且至少相距几百微米，以避免在培养过程中其他菌落进入成像区域。使用自动化成像脚本，按照本实验流程中所述算法采集时间序列数据，该算法可在本视频配套的文字版实验方案中找到。

这些图像显示了编码轨迹实验中的典型延时数据。展示的是单个菌落每隔25分钟的图像。在此实验中，每5分钟从12个不同的菌落中采集一次数据。

这些图像代表明场图像和Venus YFP荧光图像，已减去平均背景以校正整个成像视野背景的变化。随着时间推移，当图像叠加时，可揭示TSR静脉UB报告分子在细胞极区的定位，以及不同细胞在五分钟时间窗口内产生的分子数量的异质性。此处展示的是代码追踪实验中单个时间点的典型数据，即在每个五分钟时间间隔开始时采集的六次100毫秒曝光的静脉荧光图像。

六次曝光之间均间隔900毫秒，以使暂时变暗并已熄灭的静脉分子有足够时间重新恢复荧光，从而用于分析。通过从第一幅图像中减去第六幅图像，以校正未漂白分子和自发荧光的影响。该图像中的背景斑点被定位至特定的细胞谱系，并以其积分荧光强度进行定量。

随后，将菌落的平均积分荧光强度在符合该直线的六幅图像上进行绘制，并拟合为指数衰减曲线。加上一个恒定偏移量后，得到的衰变半衰期约为一秒。在本实验中，静脉分子的光漂白速度远快于细胞自发荧光。

因此，在每帧图像中大约有一半的静脉分子被光漂白。通过该方法，可进行电导成像分析，以定量单个细胞中产生的蛋白质分子数量。