GFP标记的蛋白质在实时成像果蝇卵母细胞

在该方案中，从雌性果蝇中解剖表达 GFP 标记蛋白的细胞并成像以研究蛋白质在活细胞中的运动。首先，通过使用硅脂将两个盖玻片贴在载玻片上以形成通道来准备观察室。通道的侧面衬有卤烃油。

接下来，将女性的卵巢解剖成盖玻片上的一滴卤烃油。然后分离单个细胞，并将盖玻片倒置在准备好的载玻片中的通道上，以创建一个观察室。使用明场或 DIC 光学元件定位细胞后，使用共聚焦显微镜和相关软件以设定的时间间隔捕获数字图像。

最终，生成的图像的延时序列可用于监测活细胞中蛋白质或颗粒随时间的运动。该方法可以帮助研究细胞和发育生物学的关键领域，例如蛋白质和 mRNA 运输以及细胞极性的建立。首先麻醉不到一周的健康果蝇，然后选择 10 到 15 只腹部呈圆形奶油色的大雌性。

将选定的果蝇和一些雄性转移到装有新的轻度发酵食物的小瓶中。然后将果蝇在 25 摄氏度下孵育两天以增肥。使果蝇育肥可确保各种阶段，尤其是第 8 至第 12 阶段，可用于对未增肥的果蝇进行成像，或者肥美不良的果蝇通常仅包含非常早期的阶段和成熟细胞 使用硅脂。

将两个盖玻片相距约 1 厘米贴在标准载玻片上。仅使用足够的润滑脂，以确保盖玻片和载玻片之间具有良好的密封性。用力按下每个盖玻片，将润滑脂薄而均匀地涂抹。

然后在盖玻片和载玻片之间的连接处添加一些神圣碳油 27，以防止在后续步骤中损伤分离的细胞。现在将两到三滴碳油 27 滴在 22 平方毫米的盖玻片的表面上。接下来，从食品小瓶中吸取一只雌性，轻轻地倒入 halo Caron 油中。

使用锋利的解剖钳，将苍蝇固定在盖玻片上，然后拉下腹部尖端。通过在油下沿着盖玻片表面拖动卵巢来去除卵巢，以促进细胞粘附在盖玻片上。现在轻轻地梳理卵巢，寻找至少处于卵子发生第 10 B 阶段的细胞。

通过寻找卵母细胞至少占据卵室总体积 50% 至 60% 的卵室来识别此阶段的卵母细胞。使用镊子。使用 1 到 3 只雌性从卵鞘中取出单个卵母细胞。

继续在盖玻片上分离 5 到 8 个未受损的卵母细胞。然后去除任何无法使用的组织。小心地将含有卵母细胞的盖玻片倒置到预先准备好的载玻片上，使细胞位于两个垫片之间。

请记住，不要按压盖玻片，因为它会损坏细胞，如有必要，请在三明治的边缘添加少量卤素碳油，以确保空间被填满。请注意，在卵子发生的这一点上，覆盖在卵母细胞上的卵泡细胞已经变得 coer 并从四面八方包围卵母细胞，除了与护士细胞的连接仍然存在的一小部分区域。使用 DIC 或相差光学元件聚焦卵母细胞。

检查卵母细胞是否有任何损伤迹象，例如细胞质渗漏或卵泡细胞膨出。仅对看起来健康且未受损的卵母细胞进行成像。直接监控流，无需 GFP 标签。

在示波器的 ZI 范围内设置捕获图像，其增益设置高于用于 GFP 标记蛋白质的增益设置。使用空气物镜可大大减少样品的漂移和移动。在卵母细胞表面下方获得光学切片。

一旦感兴趣区域聚焦，关闭明场光学元件并使用软件的快速扫描预览功能切换到共聚焦成像，根据需要调整焦点和增益。此外，设置激发、波长和发射波长的参数。对于 Z 轴捕捉，请选择帧之间延迟为 10 秒的恒定 Z 轴。

在捕获 20 到 50 帧的典型延时序列后，立即查看和评估视频质量。这张单延时图像显示了 11 期卵母细胞。这种表达 GFP 标记蛋白 R TNL one 的卵母细胞可以产生强烈的信号。

R TNL one 似乎与 op plasmic 流过程中存在的长微管共定位。通常，野生型卵室中的 op 质流很明显，表现为自发荧光 ylk 囊泡的明显移动，如 10 B 期卵室的五帧最大投影所示。观看此视频后，您应该对如何分离表达 GFP 标签蛋白的健康女性细胞、如何制备用于实时成像的样品以及如何拍摄荧光蛋白和颗粒的延时视频有很好的了解。