Name: GFP标记的蛋白质在实时成像果蝇卵母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜对果蝇卵母细胞中GFP标记蛋白进行活细胞成像的技术。该方法通过制备观察室和分离卵母细胞，实时追踪蛋白质动态，为研究细胞生物学和发育生物学中的蛋白质运输及细胞极性建立提供重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）小型研究资助计划（AREA）的 GM096076 项目资助。

1. 准备受剖检的果蝇
<ol>
 <li>麻醉所需基因型的健康果蝇（例如，表达GFP标记蛋白），果蝇年龄应小于一周。选择10-15只腹部呈圆润乳白色的大体型雌蝇。</li>
 <li>将选出的果蝇与少量（3-5只）雄蝇转移至含有新鲜轻度酵母化培养基的小瓶中，在25 °C条件下饲养两天使其体态丰满。有关黑腹果蝇（Drosophila）制备的详细步骤，请参见Weil et al.6。使果蝇体态丰满可确保在成像时能获得包括8-12期在内的多种卵泡发育阶段。体态瘦弱或未经饲养的果蝇通常仅含有非常早期（1-6期）或成熟期（14期）的卵母细胞。</li>
</ol>
2. 使用正置复式显微镜进行卵母细胞成像前的准备
<ol>
 <li>使用硅脂将两张盖玻片固定在标准载玻片上，盖玻片之间相距约 1 cm，以制备载玻片。硅脂用量应适中，确保盖玻片与载玻片之间形成良好密封。用力按压每张盖玻片可使硅脂均匀且薄层分布。在盖玻片与载玻片连接处添加适量卤代烷油 27（Sigma）。这些盖玻片将作为间隔物，防止后续步骤中损伤分离的卵母细胞。No. 1.5 盖玻片效果良好，其平均厚度（0.16–0.18 mm）与晚期卵母细胞的厚度相匹配。</li>
 <li>在 22 mm2 盖玻片表面滴加 2–3 滴卤代烷油 27。为获得最健康的卵母细胞，使用口吸移液法将单只雌蝇从培养管中取出，并在未麻醉的情况下轻柔地放入卤代烷油中。</li>
 <li>使用锋利的解剖镊子（如 Dumont #5）将果蝇固定在盖玻片上，撕开腹部末端。在油下沿盖玻片表面拖动卵巢，以将其取出。此操作有助于卵母细胞黏附于盖玻片。</li>
 <li>轻柔地将卵巢分开，寻找处于卵子发生至少 10B 阶段的卵母细胞。该阶段的卵母细胞可通过观察卵室来识别：卵母细胞占据卵室总体积的至少 50–60%。在此阶段，覆盖卵母细胞的滤泡细胞已变为柱状，并从各个方向包围卵母细胞，仅在与滋养细胞相连的小区域除外。使用镊子从卵巢管鞘中分离单个卵母细胞。</li>
 <li>继续操作，使用 1–3 只雌蝇，直至在盖玻片上分离出 5–8 个无损伤的卵母细胞。清除所有不可用的组织。</li>
 <li>小心地将含有卵母细胞的盖玻片倒置到预先准备好的载玻片上，使卵母细胞位于两个间隔物之间。切勿按压倒置的盖玻片，以免损伤卵母细胞。如有必要，可在“三明治”边缘添加少量卤代烷油，以确保空间完全填充。（可选：让载玻片静置数分钟，使盖玻片稳定沉降。）载玻片现已准备好用于成像。</li>
</ol>
3. 使用倒置复式显微镜进行成像前的卵母细胞制备
<ol>
 <li>卵母细胞的分离操作基本如第2节所述，但使用带玻璃底插入片的小型培养皿（MatTek，35 mm）代替盖玻片。无需覆盖样本，分离后可直接在培养皿中进行成像，但需注意确保卵母细胞始终被油覆盖，避免干燥。</li>
</ol>
4. 活细胞成像
<ol>
 <li>使用微分干涉（DIC）或相差光学系统将卵母细胞调至焦点，检查卵母细胞是否存在任何损伤迹象，例如细胞质泄漏或滤泡细胞凸起。仅对看起来健康且无损伤的卵母细胞进行成像。</li>
 <li>由于细胞质中的卵黄囊泡具有自发荧光7，因此可直接监测胞质流动，无需使用GFP标记。该信号可在显微镜的FITC通道范围内捕获，但增益设置通常需高于GFP标记蛋白所用的设置。</li>
 <li>最佳的流动成像来自紧邻贴附于玻璃盖玻片/培养皿玻璃表面之卵母细胞下方的光学切片。在此位置，卵母细胞略微扁平化，更利于获得清晰的焦平面。成像放大倍数可为200X至1,000X。根据此处所述的装置，应使用空气镜，因为盖玻片在卵母细胞与物镜之间形成屏障。此配置为最优方案，可极大程度减少样品的漂移和移动。</li>
 <li>一旦目标区域处于焦点，关闭明场光学系统并切换至共聚焦成像。利用软件的快速扫描/预览功能，根据需要调整焦距和增益。</li>
 <li>采集参数因显微镜型号而异，但一般参数如下：激发波长约为488 nm，发射波长约为515 nm。设置Z轴采集，使Z轴位置保持恒定，帧间间隔为10秒。先采集5–10帧的测试序列，以确认卵母细胞处于静止状态且焦平面合适。</li>
 <li>典型的时间序列成像通常采集20–50帧，完成后可立即回放以评估视频质量。该过程可对载玻片上的其他细胞重复进行，或根据需要解剖更多雌性个体。</li>
</ol>
5. 故障排除与常见问题
<ol>
 <li>漂移 — 使用直立显微镜时，细胞可能因油的扩散而发生漂移。可通过仅使用足以覆盖盖玻片下方区域的油量来尽量减少此现象。如果问题仍然存在，可减少用于将垫片固定在载玻片上的硅脂用量。</li>
</ol>
注意：某些共聚焦软件包支持细胞追踪，但通常最好放弃对发生漂移的卵母细胞进行成像，而改用另一个样本。
<ol start="2">
 <li>无流动迹象——如果未观察到流动现象，可能由以下两个原因导致：成像捕获的焦平面位置不正确（通常过于深入卵母细胞内部），或卵母细胞已受损。通过时间和实践可尽量减少这两类错误。</li>
</ol>

<ol><li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li>
<li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+Drosophila+oogenesis%3A+Live+imaging+of+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Gen.+Dev%22%5BJournal%5D)">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li>
<li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+RC+%22Ovarian+development+Drosophila+melanogaster%22">Ovarian development Drosophila melanogaster</a>. , Academic Press. New York. (1970).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679(2012).</li>
<li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Röper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li>
<li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+the+ER+and+Exu%3A+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li>
<li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Arch.%2C+Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li>
<li>ImageJ [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html</a> (2013).</li>
</ol>

我无任何披露事项。

Drosophila 卵母细胞是研究细胞及其亚细胞组分功能与结构的多功能模型系统。要全面理解蛋白质功能，必须同时监测其空间和时间上的动态行为。随着成像系统以及果蝇研究可用遗传工具的不断进步，即使是小型实验室也能在活体卵母细胞中开展高质量的成像实验。本文概述了一种用于分析中晚期卵发生过程中GFP标记或自发荧光蛋白及结构行为的实验方案，该方法可结合多种遗传背景用于探究蛋白质功能。
在本方案中，我描述了用于成像的卵母细胞制备过程，以及能够实现荧光蛋白和结构延时成像的基本共聚焦显微镜设置。关于卵母细胞制备的更多细节可参见 Weil et al.6 的研究。目前已可通过外显子捕获技术获得大量内源性标记蛋白的果蝇品系8，并且还可对无限多种蛋白变体进行人工设计并重新导入果蝇中。
在处理活体组织时，样本的健康状况至关重要。10B期的卵室能够基本自主地完成卵子发生过程11，因此非常适合进行短期成像研究。为获得高质量的数据，必须在多个关键步骤中格外注意。在解剖过程中，应尽可能减少对卵巢和卵母细胞的操作，并尽量缩短解剖与成像完成之间的时间间隔。理想情况下，应在共聚焦显微镜所在的同一房间内设置一个小型解剖工作站，并且每次仅对少量卵室进行成像。本文建议的卵室数量（5–8个）可在最小化解剖时间的同时，最大程度地提高获得高质量图像的可能性。我建议先采集一段较短的图像序列，以评估图像质量并确认采集参数已优化，然后再进行长时间的延时成像。大多数软件均支持单独保存每一帧图像，之后可使用ImageJ12或其他软件对这些图像进行多种方式的分析。

<table><tbody><tr><td>卤代烃油 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td></td></tr><tr><td>#5SF 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>硅脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像gfp标记蛋白 果蝇 卵母细胞

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

的 果蝇 卵母细胞已被确立为研究细胞骨架功能、细胞结构以及细胞器结构与功能等基本科学问题的多功能体系。多种GFP标记蛋白的可获得性，使得许多细胞过程能够在活细胞中持续数分钟至数小时进行实时监测。利用该技术，已对RNP转运、上皮形态发生及组织重塑等过程进行了深入细致的描述。 黑腹果蝇 卵母细胞1,2.
结合丰富的突变体资源与视频成像技术，能够以极高的细节水平研究大量基因和生物学过程。其中一个典型例子是卵细胞质流动（oooplasmic streaming）过程，该过程始于卵子发生的中期3,4。这种细胞质囊泡的剧烈运动依赖于微管和驱动蛋白（kinesin）5，为研究这些发育阶段细胞骨架的功能提供了一个有效的实验体系。
本文介绍了一种利用几乎任何共聚焦显微镜系统对活体卵母细胞进行延时成像的实验方案。

GFP标记蛋白的成像效果取决于标记蛋白表达强度。在中期卵母细胞中表达的GFP外显子标记的网蛋白样1（Rtnl-1）会产生强信号8,9。Rtnl-1似乎与卵质流动期间存在的长微管共定位10（图1A）。Rtnl-1是观察卵质流动的良好标志物，同时也是晚期卵母细胞中微管组织状态的指示因子。
在野生型卵室中，使用每10秒采集一帧的速率进行成像时，自荧光卵黄囊泡的明显移动表明存在胞质流动（图1B）。可通过生成五帧图像的最大投影来标记移动囊泡的轨迹。
<img alt="荧光显微镜图像显示蛋白质在细胞结构中的定位；实验结果。" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 自发荧光结构与 GFP 标记结构的活体成像。 A) 表达 Rtnl1-GFP 的 11 期卵母细胞在 400X 下的单帧延时图像。在胞质流动的卵母细胞中，Rtnl1-GFP 纤维呈现波浪状运动。 B) 对 10B 期卵室进行的五帧最大强度投影图像，其中自发荧光的卵黄囊泡每 10 秒成像一次，共成像 50 秒，放大倍数为 400X。比例尺 = 30 μm。

本文描述了一种对单个Drosophila卵母细胞中GFP标记的蛋白质或自发荧光结构进行活体成像的实验方案。

活体成像GFP标记蛋白 果蝇 卵母细胞

果蝇卵母细胞已被确立为研究细胞骨架功能、细胞等基本科学问题的多功能体系...

本方案中，从雌性果蝇中分离出表达GFP标记蛋白的细胞，并进行成像以研究该蛋白在活细胞中的运动。首先，通过使用硅脂将两张盖玻片固定在载玻片上形成通道，制备观察室。通道两侧用石蜡碳氢油填充。接下来，将雌性的卵巢解剖至载玻片上的一滴卤代烷油液滴中。然后分离单个的卵母细胞，并将载玻片倒置覆盖在已制备好的载玻片通道上，以形成观察室。使用明场或微分干涉（DIC）光学系统定位卵母细胞后，利用共聚焦显微镜及配套软件，按设定的时间间隔采集数字图像。最终，可通过生成的延时图像序列来实时监测活细胞中蛋白质或颗粒的运动。该方法有助于研究细胞生物学和发育生物学中的关键领域，例如蛋白质和 mRNA 的运输，以及细胞极性的建立。首先，将小于一周龄的健康果蝇进行麻醉，并选取 10 至 15 只腹部呈乳白色、体型较大的雌性果蝇。将选中的果蝇与几只雄蝇转移至含有新鲜轻度酵母化食物的小瓶中。随后在25摄氏度下孵育果蝇两天以使其增肥。增肥处理可确保获得包括第八至第十二阶段在内的多种发育阶段；未增肥或增肥不良的果蝇通常仅含有非常早期的阶段和成熟卵母细胞。使用硅脂。在标准玻璃载玻片上粘附两片盖玻片，盖玻片之间相距约一厘米。仅使用足量的油脂以确保盖玻片与载玻片之间形成良好密封。用力按压每片盖玻片，使油脂均匀且薄层分布。然后在盖玻片与载玻片连接处加入少量碳油27，以防止后续步骤中损伤分离的细胞。现在，在22平方毫米的盖玻片表面滴加两到三滴碳油27。接着用口吸管从培养瓶中吸取一只单独的雌性个体，并轻轻将其放入卤代碳油中。使用锋利的解剖镊子将果蝇固定在盖玻片上，并撕去腹部末端。在油滴下用盖玻片表面拖动卵巢，使卵母细胞黏附于盖玻片。随后轻柔地分开卵巢，寻找处于卵子发生至少10B阶段的卵母细胞。通过观察卵室来识别此阶段的卵母细胞，其中卵母细胞占据卵室总体积的至少 50% 至 60%。使用镊子，从卵巢鞘中分离单个卵母细胞，每次操作使用一至三只雌性个体。继续在盖玻片上分离出5至8个无损伤的卵母细胞，然后去除任何不可用的组织。小心地将含有卵母细胞的盖玻片倒置到预先准备好的载玻片上，使卵母细胞位于两个垫片之间。请记住，切勿按压盖玻片，因为这可能会损伤细胞。如有必要，可在夹心结构的边缘添加少量石蜡油，以确保间隙被充分填充。请注意，在卵子发生过程的这一阶段，覆盖在卵母细胞上方的滤泡细胞已经变厚，并从各个方向包围卵母细胞，仅在与滋养细胞相连的小区域除外。使用微分干涉差（DIC）或相差显微镜将卵母细胞调至清晰对焦状态。检查卵母细胞是否存在任何损伤迹象，例如细胞质泄漏或滤泡细胞凸起。仅对看起来健康且无损伤的卵母细胞进行成像。通过直接观察来监测胞质流动，无需GFP标记。使用比GFP标记蛋白更高的增益设置，在显微镜的ZI范围内进行图像采集。采用空气物镜以最大程度减少样品漂移和移动。获取卵母细胞表面下方的光学切片。当目标区域聚焦清晰后，关闭明场光学组件，切换至共聚焦成像模式，并使用软件的快速扫描预览功能，根据需要调整焦距和增益。同时，设置激发波长和发射波长参数。对于Z轴图像采集，选择固定的Z轴位置，帧间间隔设为10秒。在拍摄完通常包含20到50帧的延时序列后，立即回放并评估视频质量。这一张延时图像显示了一个11期的卵母细胞。该表达GFP标记蛋白RTNL1的卵母细胞可产生强烈的信号。R TNL1 似乎与卵质流动期间存在的长微管共同定位。通常，在野生型卵室中，卵质流动表现为明显的自荧光卵黄小泡的运动，如 10B 期卵室的五帧最大投影图像所示。观看本视频后，您应能充分理解如何分离表达 GFP 标记蛋白的健康卵母细胞、如何制备活体成像样品，以及如何对荧光蛋白和颗粒进行时间推移成像。

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生物学

GFP标记的蛋白质在实时成像<em&gt;果蝇</em&gt;卵母细胞

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