超分辨率成像细菌科机械
2013年1月21日
我们描述了超分辨率成像方法的细菌FtsZ的环探测的组织结构，细胞分裂的重要设备。这种方法是基于光活化的定位显微镜（PALM）图像的定量分析，并可以应用到其他的细菌的细胞骨架蛋白。
以下实验的总体目标是获得有关大肠杆菌细胞分裂蛋白在其天然环境中的定量结构信息。这是通过在活细胞中表达光激活荧光融合蛋白并将这些细胞固定在 acro 凝胶垫上来实现的。然后通过流视频对细胞进行成像。
当激发和激活激光用于可视化单个分子位置时，对生成的视频进行计算分析，以纳米级精度提取分子位置并叠加它们以生成超分辨率图像。然后可以通过各种定量测量来分析该图像，这些测量描述了感兴趣的结构，包括其尺寸和分子密度。光激活定位、显微镜或手掌是一种易于实现的超分辨率荧光显微镜技术。
检测简单明了，但需要仔细优化数据采集和分析才能产生可靠的结果。另一个关键步骤是融合蛋白和表达水平的表征程度，以确保您的结果具有生物学相关性。以下方案针对 FTSZ 蛋白融合 Muse two 进行了优化，应适应您感兴趣的蛋白质。
首先用目标菌株的单个菌落接种 LB 培养基，该菌落含有如书面方案中所述制备的荧光粘接蛋白。附此视频，第二天在 37 摄氏度的摇床中生长过夜。将培养物 1 至 1000 稀释到 M 9 加最低培养基中。
在室温下在适当的抗生素存在下生长至对数中期，然后诱导培养物产生 20 微摩尔 IPTG 的蛋白质，持续 2 小时。同时，通过在 M 9 负介质中制备 3% agro 溶液来组装成像室。将 agros 在 70 摄氏度的台式加热块中融化 40 分钟。
将融化的农产品在 50 摄氏度下存放长达 5 小时。将干净的微导水管载玻片放在成像室的上半部分，电极朝下。对齐微导水管载玻片上的下垫圈，以覆盖灌注通道。
将大约 50 微升融化的 aros 涂抹在玻璃杯的中心。立即用干净、干燥的盖玻片滑到 Agros 凝胶液滴的顶部。蛋白诱导后，让凝胶在室温下凝固至少 30 分钟。
在微量离心机中沉淀培养物。复苏。将沉淀悬浮在等体积的 M 9 中，并在第二次复苏悬吊后重复离心和复苏悬吊。在室温下继续生长 2 小时。
接下来，通过在 PBS 中加入多聚甲醛来固定诱导培养物，以达到 4% 多聚甲醛的最终浓度。如果对活细胞进行成像，请参阅本视频随附的书面方案以了解程序的变化，请让培养物在室温下孵育 40 分钟。沉淀培养物并重悬于等体积的 PBS 中。
接下来，用 Resuspended 培养物稀释 50 纳米金珠，1 到 10。要将样品涂在准备好的成像室中，请小心地取下盖玻片，将凝胶垫留在微导水管载玻片上。立即将 1 μL 细胞培养样品添加到凝胶垫的顶部。
等待大约两分钟，让溶液被凝胶垫吸收，并在凝胶垫上放上一张新的干净、干燥的盖玻片。根据制造商的图像采集说明继续组装整个成像室。打开显微镜相机和激光器。
由 Molecular Devices 提供的 Open metamorph 软件。如本显微镜示意图所示，在成像路径中放置适当的激发和发射滤光片，该示意图可在本视频随附的书面程序中找到。接下来，设置 Laser powers （激光功率） 和 acquisition settings（采集设置）。
通过互补载物台适配器将成像室适当地锁定在载物台中。聚焦于最靠近盖玻片唇的细胞表面。指定一个适当的成像区域，该区域由所有三个激光器均匀照射。
确定同时包含像元和基准标记的样本区域，这些标记是紧密但不重叠的金珠。以 50 毫秒的积分时间采集一张明场图像，并将焦点移动到样品中 0.5 微米。然后使用 50 毫秒的积分时间从 488 纳米激光器激发获取集成绿色荧光图像。
接下来，使用 405 纳米和 561 纳米激光器的连续照明采集流视频。对于固定单元格，50 毫秒的帧速率用于总共 20， 000 帧。405 纳米激光功率每 1000 帧增加约 10%，此处显示了前 500 帧。
请注意，采集的帧数针对该系统进行了优化，并且取决于特定的蜂窝结构。标记密度、激活率以及是否耗尽整个楼层池对于分析很重要 执行图像构建。首先，将图像流中的预期点识别为三个相邻像素，其强度高于经验确定的阈值，使每个预期点的强度符合二维高斯函数。
要识别分子位置和发射光子的总数，请使用检测到的光子总数计算每个点的定位位置。接下来，通过应用定位精度的阈值来丢弃拟合不佳的点，并通过忽略 45 纳米以内的任何点来删除对同一分子的重复观察，并且任何正在进行的点的 6 帧都校正了样品漂移。通过从每个分子位置减去金珠的帧相关位移，将所有校正的分子位置叠加在由 15 x 15 纳米像素组成的单个图像上，将每个独特的分子绘制为一个单位面积、二维高斯分布，标准差等于定位精度。
生成的图像是一个概率密度图，其中像素的强度与找到分子的可能性成正比。在那个 Pixel 插图中。以下是使用 Palm 成像方法生成的 ZR 的二维超分辨率渲染。
定性地观察到 Z 环是一种不规则结构，采用多种配置，例如在常规荧光图像中无法区分的单带或螺旋弧。诸如此类的观察值可用于确定显示特定结构配置的细胞群的百分比。ZR 的维度也可以从此图中测量。
环宽确定为 113 纳米。该值比单个 FDSC 原型细丝的预期宽度更宽，根据体外电子显微镜，预期宽度为 5 到 10 纳米。在这里，环的直径测量为 1050 纳米。
该直径可用于定量描述细胞分裂过程中的收缩程度。另一种定量方法是通过计算位于定义区域内的分子数量来计算分子密度。由于手掌图像是 3D 对象的 2D 投影，因此必须采用全内反射或 TIR 手掌将检测平面限制在 Z 环的单个侧面。
由于绘制的分子代表总 FDSC 种群的子集，因此确定的密度是实际密度的下限。在 Z 环的 TIR 图像中观察到的最大密度表明，某些截面包含重叠的原始细丝。在进行此程序时，监测细胞形态和生长速率非常重要，以确保融合蛋白的表达不会影响细胞活力。
一旦针对您感兴趣的蛋白质建立了该程序，它就可以用于测试与细胞周期进程相关的结构变化，或进一步扩展到双色成像以比较多种蛋白质的面部分布。
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概述
本研究提出了一种超分辨成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，这对细胞分裂至关重要。该技术利用光激活定位显微镜（PALM）来实现细菌细胞骨架蛋白的高分辨成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- FtsZ环对细菌细胞分裂至关重要。
- 了解其结构可以提供细菌生长和分裂的见解。
- 超分辨显微镜技术提升了成像能力，超越了传统方法。
- PALM允许在活细胞中可视化单个分子。
研究目的
- 获得关于大肠杆菌细胞分裂蛋白的定量结构信息。
- 应用超分辨成像研究FtsZ环。
- 分析所涉及蛋白质的结构尺寸和分子密度。
使用的方法
- 在活大肠杆菌细胞中表达光可激活的荧光融合蛋白。
- 将细胞固定在琼脂凝胶垫上进行成像。
- 使用激发和激活激光进行流动视频成像。
- 对视频进行计算分析，以纳米级精度提取单个分子位置。
主要结果
- 成功可视化活细胞中FtsZ环的结构。
- 定量测量结构的尺寸和分子密度。
- 展示PALM作为研究细菌细胞骨架蛋白的有效方法。
- 对细菌细胞分裂的动力学提供见解。
结论
- 超分辨成像方法为细菌细胞分裂提供了宝贵的见解。
- PALM可以应用于研究细菌中的其他细胞骨架蛋白。
- 该技术增强了我们对细胞分裂底层分子机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of bacterial division machinery enables quantitative characterization of protein assemblies critical for cell division, directly informing target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery. PALM-based workflows provide nanometer-scale spatial resolution and quantitative outputs, supporting predictive confidence in early-stage antibacterial R&D. This capability strengthens portfolio triage by clarifying the structural organization and functional relevance of division targets such as FtsZ.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Quantitative mapping of FtsZ suprastructures enables functional target validation for division inhibitors.
- High-resolution localization supports mechanistic de-risking by revealing protofilament arrangement and overlap.
- Structural insights inform predictive confidence for target engagement and downstream screening.
Screening & Assay Development
- PALM imaging establishes validated biological systems for downstream phenotypic or mechanistic assays.
- Quantitative measurement of Z-ring dimensions and density supports assay standardization and reproducibility.
- Super-resolution outputs enable reliable evaluation of compound effects on division machinery.
Translational & Preclinical Research
- Quantitative imaging of division structures aligns with translational biomarker development for antibacterial efficacy.
- Continuity from discovery to preclinical validation is supported by direct measurement of structural changes during cell cycle progression.
- Mechanistic de-risking is enhanced by correlating molecular organization with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This PALM-based imaging method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing division protein assemblies in situ.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for compound screening against division targets.
- Analytics: Delivers nanometer-precision measurements of structural dimensions, density, and configuration.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking structural changes to cell cycle and division phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein targets and bacterial systems for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in division-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by clarifying target relevance and engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of division-targeted assets based on quantitative structural data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to PALM-capable instrumentation and computational infrastructure.
- Necessitates rigorous fusion protein characterization and expression optimization for biological relevance.
- Standardization across protein targets and bacterial strains is essential for cross-study comparability.
- Imaging throughput and adaptation to live-cell or multi-color workflows may be limited by system configuration.
