Name: 超分辨率成像细菌科机械 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 了解超分辨率成像技术，利用PALM方法研究大肠杆菌FtsZ环的结构组织。该技术通过光激活定位显微镜实现纳米级精度成像，为细菌细胞分裂机制提供定量结构信息。

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资助项目：5RO1GM086447-02。

1. 样品制备
<ol>
	<li>用单个菌落JB281 [BW25113 / pJB042 (PLac:FtsZ-mEos2)] 接种LB培养基。在37 °C摇床中过夜培养。</li>
	<li>将培养物按1:1,000比例稀释至M9+最低培养基 [M9盐溶液、0.4%葡萄糖、2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、MEM氨基酸和维生素] 中，并在室温（RT）下加入氯霉素（150 μg/ml）培养至对数中期（OD600 = 0.2–0.3）。</li>
	<li>用20 μM IPTG诱导培养物2小时（见注释#1）。</li>
	<li>在微量离心机中沉淀培养物（8,000 rpm，1分钟），并用等体积M9+重悬；重复一次。第二次重悬后，继续在室温下培养2小时。</li>
	<li>用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液（pH = 7.4）在室温下固定诱导后的培养物40分钟。离心收集细胞后，用等体积PBS重悬；重复一次。若需成像活细胞，则跳过固定步骤，离心收集培养物后用等体积M9- [M9盐溶液、0.4%葡萄糖、2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、MEM氨基酸]重悬；重复一次。</li>
	<li>将金珠按1:10比例与重悬的培养物混合。将样品施加至已准备好的成像室（见步骤2.4）。</li>
</ol>
[1] 注意：上述诱导方案（步骤 1.1-1.3）已针对菌株 JB281 的表达系统进行优化。其他表达系统或目标蛋白的详细诱导条件可能会有所不同。
2. 成像室的组装
<ol>
	<li>在 M9- 中配制 3% (w/v) 琼脂糖溶液。将琼脂糖置于台式加热块中，于 70 °C 下熔化 40 分钟。熔化后的琼脂糖可在 50 °C 下保存最多 5 小时。</li>
	<li>将洁净的微通道载玻片放置于成像室上半部分，电极朝下。将下部垫圈对准微通道载玻片，使其覆盖灌流通道。</li>
	<li>在玻片中央加入约 50 μl 熔化的琼脂糖。立即在琼脂糖凝胶液滴上覆盖一片洁净干燥的盖玻片。室温下静置 30 分钟，使凝胶完全凝固。
	<ol>
		<li>盖玻片清洗方法：将盖玻片置于陶瓷架中，依次在玻璃瓶内的丙酮、乙醇和 1M KOH 溶液中进行旋转超声处理，每种溶液超声 20 分钟。重复该循环三次，共进行 9 次超声处理，最后在 dH2O 中进行一次超声处理。清洗后的盖玻片保存于新鲜的 dH2O 中。使用前用过滤空气吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心移除盖玻片，将凝胶垫留在微通道载玻片上。立即在凝胶垫表面加入 1 μl 细胞培养样品（见步骤 1.6）。等待约 2 分钟，使溶液被凝胶垫吸收。随后在凝胶垫上覆盖一片新的洁净干燥盖玻片。按照制造商说明组装完整的成像室。</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>打开显微镜、相机和激光器。启动 MetaMorph 软件（Molecular Devices）。</li>
	<li>在成像光路中放置适当的激发/发射滤光片（图 1）。</li>
	<li>根据需要设置激光功率和采集参数。
	<ol>
		<li>488 nm 激光 = 15 mW（参见注释 #2）</li>
		<li>561 nm 激光 = 75 mW</li>
		<li>405 nm 激光 = 2 mW ± 中性密度滤光片（ 参见注释 #3）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过配套的载物台适配器将成像室固定在载物台上。</li>
	<li>选择一个适当的成像区域（100×100 像素），确保该区域被三种激光均匀照射。</li>
	<li>确定一个同时包含细胞和定位标记物（金颗粒）的样品区域，两者应彼此靠近但不重叠。</li>
	<li>将焦平面聚焦于靠近盖玻片的细胞表面。以 50 ms 的积分时间采集一张明场图像，然后将焦点向样品内部移动 0.5 μm（图 3Ai）。</li>
	<li>使用 488 nm 激光激发，以 50 ms 的积分时间采集整体绿色荧光图像（图 3Aii）。</li>
	<li>在红色通道中连续使用 405 nm 和 561 nm 激光照射，采集流式视频。对于固定细胞，采用 50 ms 帧率，共采集 20,000 帧（总计约 17 分钟），每 1,000 帧将 405 nm 激光功率增加约 10%（参见注释 #4）。对于活细胞，采用 10 ms 帧率，共采集 3,000 帧（总计约 30 秒），405 nm 激光功率保持恒定。</li>
	<li>将焦平面移回至细胞的下表面，按照步骤 3.7 再次采集一张明场图像。</li>
</ol>
[2] 注意：细胞绿色荧光的积分强度与细胞中表达的 FtsZ-mEos2 分子总数成正比。所有细胞的 488 nm 激发光功率和群体荧光采集参数应保持一致，以便比较不同细胞中 FtsZ-mEos2 的相对表达水平。
[3] 注意：为了实现较慢的激活速率，从而准确定位每一个单个分子，固定细胞成像时需使用中性密度（ND）滤光片（图1，光学组件 #5）。而在活细胞成像时则移除ND滤光片，以提高激活速率，同时保持在衍射极限区域内同时激活两个分子的概率较低。活细胞成像需要更快的激活速率，以缩短整个采集时间，从而在时间上“冻结”Z环结构，并限制光损伤对细胞的影响。
[4] 注意：所采集的帧数已针对我们的系统进行了优化，具体数量取决于特定的细胞结构、标记密度、激活率，以及分析时是否需要耗尽全部荧光分子库。在活细胞中，为避免细胞结构运动导致图像模糊，需在尽可能短的时间内获得足够数量的定位点。
4. PALM 图像构建
<ol>
	<li>确定每个检测到的斑点的质心位置。
	<ol>
		<li>将图像序列加载到 Matlab（MathWorks, Inc）中。</li>
		<li>裁剪图像堆栈，选取一个细胞周围的区域，并排除所有标记微珠。</li>
		<li>为斑点检测选择一个高于背景水平但低于平均斑点强度的强度阈值。我们通过使用150帧窗口计算最大强度的滑动平均值，来校正整个实验过程中背景水平的变化。然后根据滑动平均值对每一帧的强度阈值进行插值。</li>
		<li>从每一帧中减去相应的阈值。将三个相邻像素的强度均高于阈值的区域识别为潜在斑点。</li>
		<li>使用非线性最小二乘算法，将每个预期斑点的荧光强度拟合至二维高斯函数［方程 #1］图2）。每个荧光点的定位精度根据检测到的光子总数计算 [公式 #2]。定位精度大于 20 nm（固定细胞）或 45 nm（活细胞）的拟合不良荧光点将被剔除（参见注释 #5）。强度超过平均强度两倍以上的荧光点，可能由于发射源重叠，也将被剔除。</li>
		<li>对于固定细胞，通过忽略质心位置在45 nm范围内的任何重复斑点，去除同一分子的重复观测 任何其他在其之前6帧或更少帧数出现的斑点。对于活细胞，保留所有斑点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标志物移动校准样本漂移。
	<ol>
		<li>在标志物周围裁剪出一个 10×10 像素的区域。</li>
		<li>从每一帧中减去在4.1.3节中确定的相应阈值。</li>
		<li>通过最小二乘拟合算法，假设为二维高斯形状，对每帧中的强度分布进行拟合。</li>
		<li>计算相对于第1帧的质心位置之间的位移。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据4.2中计算的适当样本漂移，校正4.1中识别出的每个独特分子的质心位置。比较3.7和3.10中获取的明场图像。若观察到细胞相对于基准标记物发生移动，则舍弃该数据。</li>
	<li>将所有校正后的质心位置叠加到一幅由 15×15 nm 像素组成的图像上。将每个唯一的分子绘制成一个单位面积的二维高斯分布曲线，其中心位于质心位置，标准差等于定位精度［公式 #2］。由此得到一幅概率密度图，其中每个像素的强度与在该像素位置检测到分子的概率成正比。图3Aiv).</li>
	<li>将PALM图像与整体成像图像进行比较。
	<ol>
		<li>按照4.4中的方法重新绘制质心位置，但在一个像素尺寸为150×150 nm、标准差为250 nm的平面上进行。这将生成一幅模拟衍射极限图像的PALM图像，可用于与3.8中获得的衍射极限集合图像进行比较图 3Aiii).</li>
		<li>为了确认所检测到的分子能够代表整个群体，需比较重建的集合图像（图 3Aiii，步骤 4.5.1）与实验组荧光图像（图 3Aii，步骤 3.8）以确认两幅图像显示的结构具有相似的形状、方向和相对强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
[5] 注意：每种成像方法所需的最低定位精度是通过实验确定的，方法是对给定样本中所有分子的定位精度进行作图，并选择适当的截断值。
5. PALM 图像分析
<ol>
	<li>测量Z环宽度和直径。
	<ol>
		<li>旋转PALM图像，使细胞的长轴垂直定向（图4A）。</li>
		<li>裁剪出包含Z环的细胞区域。</li>
		<li>沿细胞长轴投影强度分布，计算累积强度。</li>
		<li>将强度分布拟合为高斯分布。环的宽度定义为拟合高斯分布的半高全宽（FWHM）（图4B）。</li>
		<li>沿细胞短轴投影步骤5.1.2中的累积强度分布。环的直径定义为强度分布的全长（图4C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绘制FtsZ密度（见注释#6）。
	<ol>
		<li>重新绘制质心位置，如步骤(4.4)所示，但不使用高斯拟合，使得每个独特分子赋值为1，并分配至对应其质心位置的单个像素。通过此方法，每个像素的强度代表在该像素中检测到的分子总数。密度PALM图像也可显示为等高线图（图5E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定空间分辨率。
	<ol>
		<li>理论可达空间分辨率：利用所有检测到分子的平均定位精度，为整个样品创建一个代表性的点扩散函数（PSF），并计算其半高全宽（FWHM）（公式#3）。</li>
		<li>实验可达空间分辨率：计算同一分子多次观测之间的平均位移。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
[6] 注意：我们采用全内反射 PALM 技术（TIR-PALM，图 1 和 5），将激活与激发限制在细胞/玻璃界面以上的一薄层（约 200 nm）范围内，从而仅能检测到与盖玻片最近的膜结合的 FtsZ 分子。

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

PALM 图像包含细胞内分子数量和位置的信息，能够对目标蛋白质分子的分布与排列进行详细分析，而这种分析通过其他方法难以实现。下面我们概述在提取 PALM 图像中准确的定量信息时应采取的注意事项，同时保持其生物学相关性。我们还探讨了使用活细胞与固定细胞所能获得的最佳信息类型。最后，我们提出了获取有关细胞分裂机制更多超分辨率信息的可能途径。
	上述方法已通过以下方式优化，以获得准确的 PALM 成像结果。首先，我们对融合蛋白的功能进行了表征和优化，以确保其可作为 Z 环结构的可靠标记物10。其次，我们精细调控了融合蛋白的表达水平，因为过高或过低的表达均会导致异常结构的形成10,12,13。第三，我们根据荧光染料的光致闪烁特性（photoblinking properties）设定了唯一分子判定的阈值（步骤 4.1.5）14。光致闪烁会干扰对唯一分子的识别，若忽略该现象，将导致单分子计数过高。尽管过度计数不影响尺寸测量，但会放大绝对密度测量值，并可能造成虚假簇状结构的假象。在将本方法应用于其他目标蛋白时，应充分考虑上述各项...

<table><tbody><tr><td>50 x MEM 氨基酸</td><td>Sigma</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>100 x MEM 维生素</td><td>Sigma</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Mediatech</td><td>46-102-RF</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Micrsocopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque GTG 琼脂糖</td><td>Lonzo</td><td>50111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm 金珠</td><td>Microspheres-Nanospheres</td><td>790113-010</td><td></td></tr><tr><td>FCS2 成像室</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载物台适配器</td><td>ASI</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>1.45 NA，60x 物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IXON EMCCD 相机</td><td>Andor Technology</td><td>DU897E</td><td></td></tr><tr><td>488-nm Sapphire 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>561-nm Sapphire 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405-nm CUBE 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

细菌分裂机器的超分辨率成像

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

细菌细胞分裂需要在细胞中部协调组装十余种必需蛋白质1,2。该过程的核心是由FtsZ蛋白在分裂面上形成环状超结构（Z环）3,4。Z环由多条单链FtsZ原丝组成，了解原丝在Z环内的排列方式将有助于揭示Z环的组装机制及其作为力生成器的功能5,6。由于传统荧光显微镜和电子显微镜的技术局限，这一信息至今仍不明确。传统荧光显微镜受限于光的衍射极限（约200 nm），无法提供Z环的高分辨率图像。电子冷冻断层成像已在小型的C. crescentus细胞中检测到分散的FtsZ原丝7，但难以应用于E. coli或B. subtilis等较大的细胞。本文描述了一种超分辨率荧光显微技术——光激活定位显微镜（PALM）的应用，用于定量表征E. coli Z环的结构组织8。
	PALM 成像技术兼具高空间分辨率（约 35 nm）和特异性标记能力，可明确识别靶标蛋白。我们使用光激活荧光蛋白 mEos2 标记 FtsZ，该蛋白在 405 nm 激活后，荧光由绿色（激发波长 = 488 nm）转变为红色（激发波长 = 561 nm）9。在 PALM 实验过程中，单个 FtsZ-mEos2 分子被随机激活，并以 &lt;20 nm 的精确定位其单分子对应的质心位置。随后，通过叠加所有检测到的 FtsZ-mEos2 分子的质心位置，重构出 Z 环的超分辨率图像。
	利用该方法，我们发现 Z 环具有约 100 nm 的固定宽度，由在三维空间中相互重叠的松散 FtsZ 原丝束构成。这些数据为深入研究 Z 环在细胞周期依赖性变化方面提供了基础10，并可应用于其他感兴趣的蛋白质。

图3Aiv展示的是通过上述PALM成像方法获得的Z环的二维超分辨率图像。下文总结了可从中获取的定性与定量信息。
	定性观察显示，Z环是一种不规则结构，可呈现多种构型（单一带状或螺旋弧形），这些构型在常规荧光图像中难以区分（比较图3A-Dii与iv）。此类观察可用于确定细胞群体中呈现特定结构构型的比例。
	我们还可以对 Z 环的尺寸进行定量测量。测定环宽度和直径的方法详见步骤 5.1，并在图中予以示意。 图4从 图 4B，环的宽度被确定为113 nm（FWHM）。该值宽于预期的单根FtsZ原丝纤维的宽度（5–10 nm，基于 体外 EM11）。在 图4C环的直径测量为1,050 nm。该直径可用于定量描述细胞分裂过程中的收缩程度。
	<p class="jove_content"...

我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。

细菌细胞分裂需要在细胞中部协调组装十余种必需蛋白1,2。该过程的核心是……的形成

以下实验的总体目标是获取大肠杆菌细胞分裂蛋白在其天然环境中的定量结构信息。该目标通过在活细胞中表达一种光激活荧光融合蛋白，并将这些细胞固定在琼脂糖凝胶垫上实现。随后，通过流式视频对细胞进行成像。在利用激发光和活化激光可视化单个分子位置的同时，通过计算分析所获得的图像序列，以纳米级精度提取分子位置，并将其叠加生成超分辨率图像。随后，可通过多种定量测量方法分析该图像，以描述目标结构的特征，包括其尺寸和分子密度。光活化定位显微技术（photo activated localization microscopy，PALM）是一种易于实现的超分辨率荧光显微技术。仪器操作较为简单，但需要仔细优化数据采集与分析过程，以获得可靠的结果。另一个关键步骤是对融合蛋白及其表达水平进行充分表征，以确保实验结果具有生物学相关性。以下实验方案已针对与Muse two融合的FTSZ蛋白进行优化，应根据您所研究的蛋白进行相应调整。首先，从含有荧光标记蛋白的菌株单克隆中接种LB培养基，该菌株的制备方法如书面实验方案所述。随本视频一起，在37摄氏度摇床中培养过夜。第二天，将培养物按1:1000比例稀释至M9加最小培养基中。在室温下，加入适当的抗生素，将菌液培养至对数生长中期，然后加入20 µM IPTG诱导蛋白表达2小时。同时，通过在M9缺失培养基中配制3%琼脂糖溶液来组装成像室。将琼脂糖置于台式加热块中，在70 °C下加热熔解40分钟。将融化的琼脂糖在 50 摄氏度下保存最多五小时。将洁净的微流控载玻片置于成像室的上半部分，电极朝下。将微流控载慢玻片上的下部垫圈对齐，以覆盖灌流通道。将约 50 微升融化的 aros 加到玻璃片中央。立即用干净、干燥的盖玻片将 Agros 凝胶液滴推至顶部。蛋白诱导后，在室温下静置至少 30 分钟，使凝胶充分固化。在微量离心机中将菌液离心收集沉淀。重悬：将沉淀重悬于等体积的M9培养基中，重复离心，并在第二次重悬后继续在室温下培养两小时。接下来，通过向诱导培养物中加入PBS配制的多聚甲醛，使其终浓度为4%多聚甲醛，以固定细胞。若需进行活细胞成像，请参阅本视频配套的书面实验方案中所述的操作步骤差异。将培养物在室温下孵育40分钟。离心收集细胞沉淀，并用等体积的PBS重悬。接下来，将50纳米的金珠以1:10的比例用重悬的菌液稀释。将样品施加到已制备好的成像室时，小心移除盖玻片，使凝胶垫保留在微流通道载玻片上。立即在凝胶垫顶部加入1微升的细胞培养样品。让溶液大约吸收两分钟，使其被凝胶垫吸收，然后在凝胶垫上加盖一片新的洁净干燥的盖玻片。按照制造商的说明继续组装完整的成像室，以进行图像采集。打开显微镜相机和激光器。通过 Molecular Devices 打开 MetaMorph 软件。将适当的激发和发射滤光片放置在成像光路中，具体位置如本显微镜示意图所示，该示意图可在本视频附带的书面操作流程中找到。接下来设置激光功率和图像采集参数。通过匹配的载物台适配器将成像室正确锁定在载物台上。聚焦于最靠近盖玻片边缘的细胞表面。选择一个由三种激光均匀照明的合适成像区域。选择一个包含细胞和标记物的样本区域，标记物为邻近但不重叠的金珠。使用50毫秒的积分时间采集一张明场图像，然后将焦距向样品内移动0.5微米。接着，使用488纳米激光激发，以50毫秒的积分时间采集一组绿色荧光图像。接下来，使用405纳米和561纳米激光器的连续照明获取流式视频。对于固定细胞，采用50毫秒的帧速，共采集20,000帧。此处405纳米激光功率每1000帧递增约10%，图中显示前500帧。请注意，所采集的帧数已针对该系统进行了优化，且取决于特定的细胞结构。标记密度、激活速率，以及是否需要耗尽全部的基底荧光池，对于分析和图像构建至关重要。首先，在图像流中识别潜在的荧光点：即三个相邻像素的强度均超过经验确定的阈值，然后将每个潜在荧光点的强度拟合为二维高斯函数。为了确定分子位置及每个分子发射的光子总数，需利用检测到的光子总数计算每个光斑的定位位置。接下来，通过设定定位精度的阈值剔除拟合不良的光斑，并排除同一分子的重复观测：忽略与前一个光斑在45纳米范围内且在连续六帧之内的任何光斑，以校正样品漂移。通过从每个分子位置中减去金颗粒随帧变化的位移，将所有校正后的分子位置叠加到一幅由15乘15纳米像素构成的单一图像上，将每个唯一的分子绘制为一个单位面积的二维高斯分布，其标准差等于定位精度。所得图像是一张概率密度图，其中像素的强度与检测到分子的可能性成正比。此处展示的是由PALM成像方法生成的ZR的二维超分辨率渲染图。定性观察发现，Z环是一种不规则结构，可呈现多种构型，例如单条带或螺旋状弧形，这些在常规荧光图像中难以区分。此类观察可用于确定呈现特定结构构型的细胞群体所占百分比。此外，还可从该图中测量Z环的尺寸。环的宽度确定为113纳米。该值比单个FDSC原丝的预期宽度更宽，后者根据体外电子显微镜观察为5至10纳米。此处测得的环直径为1050纳米。该直径可用于定量描述细胞分裂过程中的收缩程度。另一种定量方法是通过计算定区域内定位的分子数量来确定分子密度。由于PALM图像为三维物体的二维投影，必须采用全内反射（TIR）PALM技术，将检测平面限制在Z环的单侧。由于所绘制的分子仅占总FDSC群体的一个子集，因此所确定的密度是实际密度的下限。Z环TIR图像中观察到的最大密度表明，某些区域可能含有重叠的原丝。在进行该操作时，重要的是要监测细胞形态和生长速率，以确保融合蛋白的表达不会影响细胞活力。一旦针对目标蛋白建立了该实验流程，即可用于检测与细胞周期进程相关的结构变化，或进一步扩展为双色成像，以比较多种蛋白在细胞表面的分布情况。

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超分辨率成像细菌科机械

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